Name: establishing the minimal bactericidal concentration of an antimicrobial agent for planktonic cells (mbc-p) and biofilm cells (mbc-b)
Uploaded: 2014-01-02T20:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing the Minimal Bactericidal Concentration of an Antimicrobial Agent for Planktonic Cells MBC-P and Biofilm Cells MBC-B at JoVE.com

Der Autor dankt Li Zhang, Xian-Zhi Li, Aaron Hinz und Clayton Hall für die redaktionelle Hilfe bei diesem Manuskript. Dieser Test wurde ursprünglich im Labor von George O'Toole, Geisel School of Medicine in Dartmouth, entwickelt. Die Forschung in Dr. Mahs Labor wird durch Stipendien des Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada und Cystic Fibrosis Canada unterstützt.

1. MBC-B
<ol><li>
Anbau eines Biofilms (angepasst an O'Toole9).
	<ol>
<li>Wachsen Sie eine Kultur der wilden Art Stamm von Interesse und mutierte Sorte für 16 Stunden in einem reichen Medium bei 37 °C.</li>
		<li>Verdünnen Sie die gesättigten Nachtkulturen 1:100 in ein frisches Medium für Antibiotikaresistenztests. Ein Standardmedium für P. aeruginosa ist M63 minimal medium ergänzt mit Magnesiumsulfat und Arginin (siehe Tabelle 1). Dieses Med...

<ol>
	<li>Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+resistance+of+bacterial+biofilms.">Antibiotic resistance of bacterial biofilms.</a> Int. J. Antimicrob. Agents. 35 (4), 322-332 (2010).</li><li>Mah, T. F., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+biofilm+resistance+to+antimicrobial+agents.">Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents.</a> Trends Microbiol. 9 (1), 34-39 (2001).</li><li>Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm-specific+antibiotic+resistance.">Biofilm-specific antibiotic resistance.</a> Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).</li><li>Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+basis+for+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+antibiotic+resistance.">A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance.</a> Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).</li><li>Zhang, L., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Involvement+of+a+Novel+Efflux+System+in+Biofilm-Specific+Resistance+to+Antibiotics.">The Involvement of a Novel Efflux System in Biofilm-Specific Resistance to Antibiotics.</a> J. Bacteriol. 190 (13), 4447-4452 (2008).</li><li>Zhang, L., Hinz, A. J., Nadeau, J. P., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+tssC1+Links+Type+VI+Secretion+and+Biofilm-specific+Antibiotic+Resistance.">Pseudomonas aeruginosa tssC1 Links Type VI Secretion and Biofilm-specific Antibiotic Resistance.</a> J. Bacteriol. 193 (19), 5510-5513 (2011).</li><li>Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biofilm-Specific+Antibiotic+Resistance+Gene,+ndvB,+is+Important+for+Expression+of+Ethanol+Oxidation+Genes+in+Pseudomonas+aeruginosa+Biofilms.">The Biofilm-Specific Antibiotic Resistance Gene, ndvB, is Important for Expression of Ethanol Oxidation Genes in Pseudomonas aeruginosa Biofilms.</a> J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).</li><li>O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtiter+Dish+Biofilm+Formation+Assay.">Microtiter Dish Biofilm Formation Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2437 (2011).</li><li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug+tolerance+of+biofilms+and+persister+cells.">Multidrug tolerance of biofilms and persister cells.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 322, 107-131 (2008).</li><li>Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+and+Analyzing+Static+Biofilms.">Growing and Analyzing Static Biofilms.</a> Curr. Protoc. Microbiol. 1, 1B.1.1-1B.1.17 (2005).</li><li>Ramey, B. E., Parsek, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+1.+Growing+and+analyzing+biofilms+in+fermenters.">Chapter 1. Growing and analyzing biofilms in fermenters.</a> Curr. Protoc. Microbiol. 1, 1B.3.1-1B.3.14 (2005).</li></ol>

Antibiotikaresistenz in planktonischen Zellen ist definiert als eine Erhöhung der minimalen hemmenden Konzentration (MIC) eines Antibiotikums aufgrund einer permanenten Veränderung der Zellen(z. B. eine Mutation). Die bisher identifizierten Mechanismen der biofilmspezifischen Resistenz oder Toleranz sind das Ergebnis der Expression wildartiger Gene in Biofilmen. Daher gilt die klassische Definition von Resistenz nicht für Biofilme. Es wurde jedoch eine weitere Reihe von Definitionen vorgelegt: Resistenzmechan...

Antibiotikaresistenz-Assays wurden ursprünglich entwickelt, um die Resistenz von planktonischen (freischwimmenden) Bakterienkulturen zu assayen. Da es sich bei vielen bakteriellen Infektionen um Biofilme (oberflächengebundene Zellen) handelt, waren wir an der Entwicklung einer Methode zum Assay biofilmspezifischer Antibiotikaresistenz interessiert. Die meisten Antibiotikaresistenztests sind jedoch schlecht geeignet, um die Resistenz von Biofilmen zu messen. Beispielsweise ist die Bestimmung der minimalen hemmenden Konzentration (MIC) der Goldstandard für die Bestimmung der Antibiotikaresistenz von planktonischen Bakterienkulturen 1. Dieser Test beinhaltet das Mischen einer verdünnten planktonischen Kultur mit einer Verdünnungsserie von Antibiotika.  Die Konzentration von Antibiotika, die das sichtbare Wachstum der planktonischen Zellen hemmt, ist das MIC. Da dieser Test auf wachstumshemmungshzuhemmen ist, kann er per definitionem nicht mit Biofilmkulturen arbeiten, was die Untersuchung der antibiotika-Empfindlichkeit von Zellen in einem vorgewachsenen Biofilm erfordert. Anstatt die Wachstumshemmung zu messen, bestimmt der hier beschriebene MBC-B-Assay die Konzentration von Antibiotika, die bereits in einem Biofilm vorhandene Zellen abtötet. So zielt dieser Test darauf ab, antibiotika-Behandlungen etablierter Biofilminfektionen nachzuahmen und einen relevanteren Überblick über die bakterielle Antibiotikaresistenz in vivozu geben.
Da Biofilme im Allgemeinen antibiotikaresistenter sind als planktonische Kulturen 2-4 , war es notwendig, eine Methode zu entwickeln, die die Antibiotikaresistenz eines Biofilms direkt mit der einer planktonischen Kultur in Beziehung steht. Ein weiteres Ziel dieser Methode ist es, den Grad der Antibiotikaresistenz zwischen planktonischen und Biofilmzellen direkt vergleichen zu können. Die hier beschriebenen MBC-P- und MBC-B-Assays machen dies möglich, da Zellen unter ähnlichen Bedingungen kultiviert werden. Wir haben diese Methode verwendet, um mehrere Gene zu untersuchen, die für die biofilmspezifische Antibiotikaresistenz 5-8 wichtig sind.

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			1x&#160;M63
			</td>
			<td style="width:160px;">
			
			</td>
			<td style="width:160px;">
			
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Prepare as a 5x&#160;M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature.&#160; Dilute 5x&#160;stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components.
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			KH2PO4
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Fisher
			</td>
			<td style="width:160px;">
			P285-500
			</td>
			<td style="width:160px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			K2HPO4
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Fisher
			</td>
			<td style="width:160px;">
			P288-500
			</td>
			<td style="width:160px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			(NH4)2SO4
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:160px;">
			A5132
			</td>
			<td style="width:160px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			Magnesium sulfate
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Fisher
			</td>
			<td style="width:160px;">
			M63-500
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Add to 1 mM final concentration.&#160; Prepare as a 1 M stock in water and autoclave.
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			Tobramycin
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:160px;">
			
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Prepare 50 mg/m&#160;stock. Aliquot and store at -20&#176;C.
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			Arginine
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:160px;">
			A5131
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Add to 0.4% final concentration.&#160; Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize.&#160; This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			96-well microtiter plates
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Corning
			</td>
			<td style="width:160px;">
			3595
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Sterile, flat-bottom, low evaporation
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			Tranferpette (multichannel pipette)
			</td>
			<td style="width:160px;">
			BrandTech
			</td>
			<td style="width:160px;">
			2703610
			</td>
			<td style="width:160px;">
			8-channel, 20-200 &#956;l
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			Multiprong device
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Dan-Kar
			</td>
			<td style="width:160px;">
			MC48
			</td>
			<td style="width:160px;">
			48 prongs fit into &#189; of a 96-well microtiter plate
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing the minimal bactericidal concentration of an antimicrobial agent for planktonic cells (mbc-p) and biofilm cells (mbc-b)

Dieses Protokoll ermöglicht einen direkten Vergleich zwischen planktonischer und Biofilmresistenz für einen Bakterienstamm, der in vitroeinen Biofilm bilden kann. Bakterien werden in die Brunnen einer 96-Well-Mikrotiterplatte geimpft. Beim planktonischen Assay werden den bakteriellen Suspensionen serielle Verdünnungen des antimikrobiellen Mittels der Wahl zugesetzt. Im Biofilm-Assay, einmal geimpft, werden die Bakterien über einen bestimmten Zeitraum zu einem Biofilm zurückgelassen. Nicht angeschlossene Zellen werden aus den Brunnen entfernt, das Medium aufgefüllt und serielle Verdünnungen des antimikrobiellen Mittels der Wahl hinzugefügt. Nach der Exposition gegenüber dem antimikrobiellen Mittel werden die planktonischen Zellen auf Wachstum untersucht. Für den Biofilm-Assay werden die Medien mit frischen Medien ohne antimikrobielle Mittel aufgefrischt und die Biofilmzellen müssen sich erholen. Die Lebensfähigkeit von Biofilmzellen wird nach der Erholungsphase geprüft. Das MBC-P für das antimikrobielle Mittel ist definiert als die niedrigste Konzentration von Medikament, das die Zellen in der planktonischen Kultur abtötet.  Im Gegensatz dazu wird das MBC-B für einen Stamm bestimmt, indem vorgeformte Biofilme für 24 Stunden erhöhten Konzentrationen antimikrobiellen Mittels aussetzen. Das MBC-B ist definiert als die niedrigste Konzentration an antimikrobiellen Mitteln, die die Zellen im Biofilm abtötet.

MBC-P- und MBC-B-Assays wurden durchgeführt, um die Empfindlichkeit des PA14-Wildtyps mit PA14 ∆ndvBzu vergleichen. Tobramycin wurde als Antibiotikum verwendet. Die Ergebnisse, die Schritt 1.4.4 (Abbildung 1) und Schritt 2.3.4 (Abbildung 2) entsprechen, werden dargestellt. PA14 und ∆ndvB wurden in die MBC-P- und MBC-B-Assays in dreifacher Ausfertigung geimpft. Nach Abschluss der Schritte 1.0-1.4 des MBC-B-Protokolls und der Schritte 2.0-2.3 des MBC-P-Protokolls wur...

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Establishing the Minimal Bactericidal Concentration of an Antimicrobial Agent for Planktonic Cells MBC-P and Biofilm Cells MBC-B

Etablierung der minimalen bakteriziden Konzentration eines antimikrobiellen Mittels für planktonische Zellen (MBC-P) und Biofilmzellen (MBC-B)

Dieses Protokoll ermöglicht einen direkten Vergleich zwischen planktonischer und Biofilmresistenz für einen Bakterienstamm, der mit einer 96-Well-Mikrotiterplatte einen Biofilm in vitro bilden kann. Planktonische oder Biofilmbakterien sind seriellen Verdünnungen des antimikrobiellen Mittels der Wahl ausgesetzt. Die Lebensfähigkeit wird durch das Wachstum auf Agarplatten geprüft.

This protocol allows for a direct comparison between planktonic and biofilm resistance for a bacterial strain that can form a biofilm in vitro. Bacteria ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishing the Minimal Bactericidal Concentration of an Antimicrobial Agent for Planktonic Cells (MBC-P) and Biofilm Cells (MBC-B)

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa und Saccharomyces cerevisiae Biofilm im Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Forschung

Immunologie und Infektion

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In-vitro-Bildung von Biofilmen in einem 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Nach Cell-Schicksal<em&gt; E. coli</em&gt; Nach Infektion mit Phagen

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Aufbau einer Liquid-bedeckten Kultur Polarized Menschliche Airway Epithelial Calu-3-Zellen, um Host-Zell-Antwort, um Atemwegspathogene Studie<em&gt; In-vitro-</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Einrichtung eines Setup-Hochdurchsatz-Screening für kleine Moleküle, die Modulate c-di-GMP-Signalisierung in<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi

Bestimmung von Biofilm Initiation auf Virus-infizierte Zellen durch Bakterien und Fungi

The study of polymicrobial interactions across the taxonomic kingdoms that include fungi, bacteria and virus have not been previously examined with ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

Entwicklung und Validierung eines empfindsamen Einzelmolekül Array digitale Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay für menschliche Interferon-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

Multicolor Flow Cytometry-basierte Quantifizierung der Mitochondrien, Lysosomen in T-Zellen

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Ein High-Throughput- Shigella-spezifischen bakterizide Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Production and Characterization of Human Macrophages from Pluripotent Stem Cells

Produktion und Charakterisierung menschlicher Makrophagen aus pluripotenten Stammzellen

Macrophages are present in most vertebrate tissues and comprise widely dispersed and heterogeneous cell populations with different functions. They are key ...