Name: establishing the minimal bactericidal concentration of an antimicrobial agent for planktonic cells (mbc-p) and biofilm cells (mbc-b)
Uploaded: 2014-01-02T20:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing the Minimal Bactericidal Concentration of an Antimicrobial Agent for Planktonic Cells MBC-P and Biofilm Cells MBC-B at JoVE.com

המחבר רוצה להודות ללי ג'אנג, שיאן-ג'י לי, אהרון הינץ ואולם קלייטון על העזרה הערכית בכתב היד הזה. מבחנים אלה פותחו בתחילה במעבדתו של ג'ורג' אוטול, בית הספר לרפואה גייזל בדארטמות'. המחקר במעבדתו של ד"ר מאה נתמך על ידי מענקים ממועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה וסיסטיק פיברוזיס קנדה.

1. MBC-B
<ol><li>
גידול ביופילם (מותאם מאוטול9).
	<ol>
<li>לגדל תרבות של זן סוג פראי של עניין זן מוטציה במשך 16 שעות במדיום עשיר ב 37 °C (69 °F).</li>
		<li>לדלל את תרבויות לילה רווי 1:100 לתוך מדיום טרי עבור בדיקות עמידות לאנטיביוטיקה. מדיום סטנדרטי עבור P. aeruginosa הוא M63 בינוני מינימלי בת?...

<ol>
	<li>Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+resistance+of+bacterial+biofilms.">Antibiotic resistance of bacterial biofilms.</a> Int. J. Antimicrob. Agents. 35 (4), 322-332 (2010).</li><li>Mah, T. F., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+biofilm+resistance+to+antimicrobial+agents.">Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents.</a> Trends Microbiol. 9 (1), 34-39 (2001).</li><li>Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm-specific+antibiotic+resistance.">Biofilm-specific antibiotic resistance.</a> Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).</li><li>Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+basis+for+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+antibiotic+resistance.">A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance.</a> Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).</li><li>Zhang, L., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Involvement+of+a+Novel+Efflux+System+in+Biofilm-Specific+Resistance+to+Antibiotics.">The Involvement of a Novel Efflux System in Biofilm-Specific Resistance to Antibiotics.</a> J. Bacteriol. 190 (13), 4447-4452 (2008).</li><li>Zhang, L., Hinz, A. J., Nadeau, J. P., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+tssC1+Links+Type+VI+Secretion+and+Biofilm-specific+Antibiotic+Resistance.">Pseudomonas aeruginosa tssC1 Links Type VI Secretion and Biofilm-specific Antibiotic Resistance.</a> J. Bacteriol. 193 (19), 5510-5513 (2011).</li><li>Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biofilm-Specific+Antibiotic+Resistance+Gene,+ndvB,+is+Important+for+Expression+of+Ethanol+Oxidation+Genes+in+Pseudomonas+aeruginosa+Biofilms.">The Biofilm-Specific Antibiotic Resistance Gene, ndvB, is Important for Expression of Ethanol Oxidation Genes in Pseudomonas aeruginosa Biofilms.</a> J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).</li><li>O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtiter+Dish+Biofilm+Formation+Assay.">Microtiter Dish Biofilm Formation Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2437 (2011).</li><li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug+tolerance+of+biofilms+and+persister+cells.">Multidrug tolerance of biofilms and persister cells.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 322, 107-131 (2008).</li><li>Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+and+Analyzing+Static+Biofilms.">Growing and Analyzing Static Biofilms.</a> Curr. Protoc. Microbiol. 1, 1B.1.1-1B.1.17 (2005).</li><li>Ramey, B. E., Parsek, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+1.+Growing+and+analyzing+biofilms+in+fermenters.">Chapter 1. Growing and analyzing biofilms in fermenters.</a> Curr. Protoc. Microbiol. 1, 1B.3.1-1B.3.14 (2005).</li></ol>

עמידות לאנטיביוטיקה בתאים פלנקטוניים מוגדרת כעלייה בריכוז המעכב המינימלי (MIC) של אנטיביוטיקה עקב שינוי קבוע בתאים (למשל מוטציה). המנגנונים של התנגדות או סובלנות ספציפיים לביופילם שזוהו עד כה הם תוצאה של ביטוי של גנים מסוג בר בתוך biofilms. לפיכך, ההגדרה הקלאסית של התנגדות אינה חלה על ביופ?...

מבחני עמידות לאנטיביוטיקה פותחו בתחילה כדי לנסות עמידות של תרבויות פלנקטוניות (שחייה חופשית) של חיידקים. מכיוון שזיהומים חיידקיים רבים כרוכים בביופילמים (תאים המחוברים לפני השטח), התעניינו בפיתוח שיטה לעמידות לאנטיביוטיקה ספציפית לביופילם. עם זאת, רוב מבחני עמידות לאנטיביוטיקה אינם מתאימים למדידת ההתנגדות של biofilms. לדוגמה, קביעת הריכוז המעכב המינימלי (MIC) הוא תקן הזהב לקביעת עמידות לאנטיביוטיקה של תרביות חיידקים פלנקטוניים 1. זה assay כרוך ערבוב תרבות פלנקטונית מדוללת עם סדרת דילול של אנטיביוטיקה.  ריכוז האנטיביוטיקה המעכבת את הצמיחה הנראית לעין של התאים הפלנקטוניים הוא ה- MIC. מאז בדיקה זו מסתמכת על עיכוב של צמיחה, מעצם הגדרתו, זה לא יכול לעבוד עם תרביות biofilm, אשר דורש בחינת הרגישות האנטיביוטית של תאים בביופילם גדל מראש. במקום למדוד עיכוב גדילה, מבחני MBC-B המתוארים כאן קובעים את ריכוז האנטיביוטיקה שהורג תאים שכבר קיימים בביופילם. לכן, זו assay שואפת לחקות טיפולים אנטיביוטיים של זיהומים biofilm הוקמה, ולספק תצוגה רלוונטית יותר של עמידות לאנטיביוטיקה חיידקי vivo.
מאז biofilms הם בדרך כלל עמידים יותר לאנטיביוטיקה מאשר תרבויות פלנקטוניות 2-4 , היה צורך לתכנן שיטה המקשרת ישירות את עמידות לאנטיביוטיקה של biofilm לזה של תרבות פלנקטונית. לכן מטרה נוספת של שיטה זו היא להיות מסוגל להשוות ישירות את רמת עמידות לאנטיביוטיקה בין תאים פלנקטוניים וביופילם. מבחני MBC-P ו- MBC-B המתוארים כאן מאפשרים זאת מכיוון שהתאים מתרבתים בתנאים דומים. השתמשנו בשיטה זו כדי לחקור מספר גנים חשובים לעמידות לאנטיביוטיקה ספציפית לביופילם 5-8 .

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			1x&#160;M63
			</td>
			<td style="width:160px;">
			
			</td>
			<td style="width:160px;">
			
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Prepare as a 5x&#160;M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature.&#160; Dilute 5x&#160;stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components.
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			KH2PO4
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Fisher
			</td>
			<td style="width:160px;">
			P285-500
			</td>
			<td style="width:160px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			K2HPO4
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Fisher
			</td>
			<td style="width:160px;">
			P288-500
			</td>
			<td style="width:160px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			(NH4)2SO4
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:160px;">
			A5132
			</td>
			<td style="width:160px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			Magnesium sulfate
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Fisher
			</td>
			<td style="width:160px;">
			M63-500
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Add to 1 mM final concentration.&#160; Prepare as a 1 M stock in water and autoclave.
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			Tobramycin
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:160px;">
			
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Prepare 50 mg/m&#160;stock. Aliquot and store at -20&#176;C.
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			Arginine
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:160px;">
			A5131
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Add to 0.4% final concentration.&#160; Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize.&#160; This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			96-well microtiter plates
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Corning
			</td>
			<td style="width:160px;">
			3595
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Sterile, flat-bottom, low evaporation
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			Tranferpette (multichannel pipette)
			</td>
			<td style="width:160px;">
			BrandTech
			</td>
			<td style="width:160px;">
			2703610
			</td>
			<td style="width:160px;">
			8-channel, 20-200 &#956;l
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			Multiprong device
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Dan-Kar
			</td>
			<td style="width:160px;">
			MC48
			</td>
			<td style="width:160px;">
			48 prongs fit into &#189; of a 96-well microtiter plate
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing the minimal bactericidal concentration of an antimicrobial agent for planktonic cells (mbc-p) and biofilm cells (mbc-b)

פרוטוקול זה מאפשר השוואה ישירה בין התנגדות פלנקטונית וביופילם לזן חיידקי שיכול ליצור ביופילם במבחנה. חיידקים מחוסנים לתוך בארות של צלחת מיקרוטיטר 96-היטב. במקרה של בדיקה פלנקטונית, דילול סדרתי של הסוכן מיקרוביאלית של בחירה מתווספים השעיות חיידקים. ב biofilm assay, פעם מחוסן, החיידקים נשארים ליצור biofilm על פני תקופה מוגדרת של זמן. תאים לא מחוברים מוסרים מן הבארות, התקשורת מתחדשת ודילול סדרתי של הסוכן מיקרוביאלית של בחירה מתווספים. לאחר חשיפה לסוכן מיקרוביאלית, התאים הפלנקטוניים הם assayed לצמיחה. עבור מבחני הביופילם, התקשורת מתרעננת עם מדיה טרייה חסרה את הסוכן מיקרוביאלית ותאי הביופילם נשארים להתאושש. הכדאיות של תאי הביופילם מתבצעת לאחר תקופת ההחלמה. MBC-P עבור הסוכן מיקרוביאלית מוגדר כריכוז הנמוך ביותר של סמים שהורג את התאים בתרבות הפלנקטונית.  לעומת זאת, MBC-B עבור זן נקבע על ידי חשיפת biofilms מעוצבים מראש לריכוזים הולכים וגדלים של חומר מיקרוביאלית במשך 24 שעות. MBC-B מוגדר כריכוז הנמוך ביותר של חומר מיקרוביאלית שהורג את התאים בביופילם.

מבחני MBC-P ו- MBC-B בוצעו, והשוו את הרגישות של סוג הפרא PA14 עם PA14 ∆ndvB. טוברמיצין שימש כאנטיביוטיקה. מוצגות תוצאות המתאימות לשלב 1.4.4 (איור 1) ולצעד 2.3.4 (איור 2). PA14 ו- ∆ndvB חוסנו לתוך מבחני MBC-P ו- MBC-B המשולש. לאחר השלמת שלבים 1.0-1.4 של פרוטוקול MBC-B ושלבים 2.0-2.3 של פרוטוקול MBC-P, התאי...

Watch this Scientific Journal Video about Establishing the Minimal Bactericidal Concentration of an Antimicrobial Agent for Planktonic Cells MBC-P and Biofilm Cells MBC-B at JoVE.com

Establishing the Minimal Bactericidal Concentration of an Antimicrobial Agent for Planktonic Cells MBC-P and Biofilm Cells MBC-B

הקמת הריכוז החיידקי המינימלי של סוכן מיקרוביאלית לתאים פלנקטוניים (MBC-P) ותאי ביופילם (MBC-B)

פרוטוקול זה מאפשר השוואה ישירה בין התנגדות פלנקטונית וביופילם לזן חיידקי שיכול ליצור ביופילם במבחנה באמצעות צלחת מיקרוטיטר 96 באר. חיידקי פלנקטוניים או ביופילם נחשפים לדילול סדרתי של הסוכן האנטי-מיקרוביאלי המועדף. הכדאיות נפגעת על ידי צמיחה על צלחות אגר.

This protocol allows for a direct comparison between planktonic and biofilm resistance for a bacterial strain that can form a biofilm in vitro. Bacteria ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishing the Minimal Bactericidal Concentration of an Antimicrobial Agent for Planktonic Cells (MBC-P) and Biofilm Cells (MBC-B)

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa ו biofilm Saccharomyces cerevisiae בתוך תאים Flow

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

ב גיבוש biofilm חוץ גופית ב 8-Slide גם לשכת

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

בעקבות Cell-גורל ב<em&gt; א coli</em&gt; לאחר זיהום על ידי phage מבדה

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

הקמת תרבות הנוזלית מכוסית של Airway האנושי המקוטב-3 Calu תאי אפיתל ללמוד תגובת תא מארחת לפתוגנים נשימה<em&gt; במבחנה</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

הקמת הגדרת תפוקה גבוהה להקרנה מולקולות קטנות לווסת ג-di-GMP איתות<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi

קביעת Biofilm ייזום על תאים נגועים בנגיף על ידי חיידקים ופטריות

The study of polymicrobial interactions across the taxonomic kingdoms that include fungi, bacteria and virus have not been previously examined with ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

פיתוח ובדיקת של מולקולה בודדת העדינה מערך דיגיטלי מקושרים-אנזים Immunosorbent Assay עבור אינטרפרון אנושי-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

כימות מבוססי Cytometry זרימה ססגוניות של המיטוכונדריה, Lysosomes בתאי T

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

תפוקה גבוהה שיגלה-Assay אחרים ספציפיים

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Production and Characterization of Human Macrophages from Pluripotent Stem Cells

הפקה ואפיון של מקרופאגים האדם מ Pluripotent תאי גזע

Macrophages are present in most vertebrate tissues and comprise widely dispersed and heterogeneous cell populations with different functions. They are key ...