Name: establishing the minimal bactericidal concentration of an antimicrobial agent for planktonic cells (mbc-p) and biofilm cells (mbc-b)
Uploaded: 2014-01-02T20:00:00
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著者は、この原稿の編集上の助けのために李張、西安志李、アーロン・ヒンツ、クレイトン・ホールに感謝したいと思います。このアッセイは当初、ダートマスのガイゼル医学部ジョージ・オトゥールの研究室で開発されました。博士マーの研究室での研究は、カナダの自然科学工学研究評議会と嚢胞性線維症カナダからの助成金によって支えられている。

1. MBC-B
<ol><li>
バイオフィルムの成長 (オトゥール 9 から適応).
	<ol>
<li>37°Cで富の培地で16時間の目的および変異株の野生型株の培養を成長させる。</li>
		<li>飽和した一晩培養物1:100を抗生物質耐性アッセイ用の新鮮な培地に希釈する。 P. 緑素吸塩 の標準培地は、M63最小限の培地で、硫酸マグネシウムとアルギニンを添加した( 表1参照)。こ...

<ol>
	<li>Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+resistance+of+bacterial+biofilms.">Antibiotic resistance of bacterial biofilms.</a> Int. J. Antimicrob. Agents. 35 (4), 322-332 (2010).</li><li>Mah, T. F., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+biofilm+resistance+to+antimicrobial+agents.">Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents.</a> Trends Microbiol. 9 (1), 34-39 (2001).</li><li>Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm-specific+antibiotic+resistance.">Biofilm-specific antibiotic resistance.</a> Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).</li><li>Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+basis+for+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+antibiotic+resistance.">A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance.</a> Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).</li><li>Zhang, L., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Involvement+of+a+Novel+Efflux+System+in+Biofilm-Specific+Resistance+to+Antibiotics.">The Involvement of a Novel Efflux System in Biofilm-Specific Resistance to Antibiotics.</a> J. Bacteriol. 190 (13), 4447-4452 (2008).</li><li>Zhang, L., Hinz, A. J., Nadeau, J. P., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+tssC1+Links+Type+VI+Secretion+and+Biofilm-specific+Antibiotic+Resistance.">Pseudomonas aeruginosa tssC1 Links Type VI Secretion and Biofilm-specific Antibiotic Resistance.</a> J. Bacteriol. 193 (19), 5510-5513 (2011).</li><li>Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biofilm-Specific+Antibiotic+Resistance+Gene,+ndvB,+is+Important+for+Expression+of+Ethanol+Oxidation+Genes+in+Pseudomonas+aeruginosa+Biofilms.">The Biofilm-Specific Antibiotic Resistance Gene, ndvB, is Important for Expression of Ethanol Oxidation Genes in Pseudomonas aeruginosa Biofilms.</a> J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).</li><li>O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtiter+Dish+Biofilm+Formation+Assay.">Microtiter Dish Biofilm Formation Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2437 (2011).</li><li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug+tolerance+of+biofilms+and+persister+cells.">Multidrug tolerance of biofilms and persister cells.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 322, 107-131 (2008).</li><li>Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+and+Analyzing+Static+Biofilms.">Growing and Analyzing Static Biofilms.</a> Curr. Protoc. Microbiol. 1, 1B.1.1-1B.1.17 (2005).</li><li>Ramey, B. E., Parsek, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+1.+Growing+and+analyzing+biofilms+in+fermenters.">Chapter 1. Growing and analyzing biofilms in fermenters.</a> Curr. Protoc. Microbiol. 1, 1B.3.1-1B.3.14 (2005).</li></ol>

プランクトニック細胞における抗生物質耐性は、細胞の永久的な変化(例えば 突然変異)による抗生物質の最小阻害濃度(MIC)の増加と定義される。これまでに同定されたバイオフィルム特異的耐性または耐性のメカニズムは、バイオフィルム内の野生型遺伝子の発現の結果である。したがって、従来の抵抗の定義はバイオフィルムには適用されません。しかし、別の定義のセットが提示?...

抗生物質耐性アッセイは、当初、細菌のプランクトニック(遊泳)培養物の耐性をアッセイするために開発されました。多くの細菌感染はバイオフィルム(表面付着細胞)を含むため、バイオフィルム特異的な抗生物質耐性をアッセイする方法の開発に興味を持っていました。しかし、ほとんどの抗生物質耐性アッセイは、バイオフィルムの耐性を測定するためには不十分です。例えば、最小阻害濃度(MIC)を決定することは、プランクトニック細菌培養 物1の抗生物質耐性を決定するためのゴールドスタンダードである。このアッセイは、希釈されたプランクトニック培養物と希釈系の抗生物質を混合することを伴う。 プランクトニック細胞の目に見える成長を阻害する抗生物質の濃度は、MICです。このアッセイは成長の阻害に依存しているため、定義上、それは、プレウジョンバイオフィルムにおける細胞の抗生物質感受性を調べる必要があるバイオフィルム培養物では動作できません。ここで説明するMBC-Bアッセイは、増殖阻害を測定する代わりに、バイオフィルムに存在する細胞を殺す抗生物質の濃度を決定する。従って、このアッセイは、確立されたバイオフィルム感染症の抗生物質治療を模倣し、 生体内での細菌抗生物質耐性のより関連性の高い見解を提供することを目的とする。
バイオフィルムは一般にプランクトニック培養 2-4 よりも抗生物質耐性が高いため、バイオフィルムの抗生物質耐性をプランクトニック培養物に直接関連付ける方法を考案する必要があった。したがって、この方法のもう一つの目標は、プランクトニック細胞とバイオフィルム細胞間の抗生物質耐性のレベルを直接比較できることである。ここで説明する MBC-P および MBC-B アッセイは、細胞が同様の条件で培養されるため、これを可能にします。我々は、バイオフィルム特異的抗生物質耐性 5-8 に重要ないくつかの遺伝子を研究するために、この方法を利用している。

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			1x&#160;M63
			</td>
			<td style="width:160px;">
			
			</td>
			<td style="width:160px;">
			
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Prepare as a 5x&#160;M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature.&#160; Dilute 5x&#160;stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components.
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			KH2PO4
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Fisher
			</td>
			<td style="width:160px;">
			P285-500
			</td>
			<td style="width:160px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			K2HPO4
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Fisher
			</td>
			<td style="width:160px;">
			P288-500
			</td>
			<td style="width:160px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			(NH4)2SO4
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:160px;">
			A5132
			</td>
			<td style="width:160px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			Magnesium sulfate
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Fisher
			</td>
			<td style="width:160px;">
			M63-500
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Add to 1 mM final concentration.&#160; Prepare as a 1 M stock in water and autoclave.
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			Tobramycin
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:160px;">
			
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Prepare 50 mg/m&#160;stock. Aliquot and store at -20&#176;C.
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			Arginine
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:160px;">
			A5131
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Add to 0.4% final concentration.&#160; Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize.&#160; This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			96-well microtiter plates
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Corning
			</td>
			<td style="width:160px;">
			3595
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Sterile, flat-bottom, low evaporation
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			Tranferpette (multichannel pipette)
			</td>
			<td style="width:160px;">
			BrandTech
			</td>
			<td style="width:160px;">
			2703610
			</td>
			<td style="width:160px;">
			8-channel, 20-200 &#956;l
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			Multiprong device
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Dan-Kar
			</td>
			<td style="width:160px;">
			MC48
			</td>
			<td style="width:160px;">
			48 prongs fit into &#189; of a 96-well microtiter plate
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing the minimal bactericidal concentration of an antimicrobial agent for planktonic cells (mbc-p) and biofilm cells (mbc-b)

このプロトコルは、 インビトロでバイオフィルムを形成することができる細菌株のプランクトニックとバイオフィルム耐性の間の直接比較を可能にする。細菌は96ウェルマイクロティタープレートの井戸に接種される。プランクトニックアッセイの場合、選択した抗菌剤の連続希釈が細菌懸濁液に添加される。バイオフィルムアッセイでは、一度接種すると、細菌は一定期間にわたってバイオフィルムを形成するために残される。未接続の細胞は、ウェルから除去され、培地が補充され、選択した抗菌剤の連続希釈が加え加える。抗菌剤に曝された後、プランクトニック細胞は成長のためにアッセイされる。バイオフィルムアッセイの場合、培地は、抗菌剤を欠いた新鮮な培地でリフレッシュされ、バイオフィルム細胞は回復するために残されます。バイオフィルム細胞の生存率は、回復期間後にアッセイされる。抗菌剤のMBC-Pは、プランクトン培養中の細胞を殺す薬物の最も低い濃度として定義される。 対照的に、株に対するMBC-Bは、24時間の抗菌剤の濃度を増加させるために、プレフォー形成バイオフィルムを曝露することによって決定される。MBC-Bは、バイオフィルム内の細胞を殺す抗菌剤の最も低い濃度として定義されます。

MBC-PおよびMBC-Bアッセイを実施し、PA14野生型の感度をPA14∆ndvBと比較した。トブラマイシンは抗生物質として使用された。ステップ 1.4.4 (図 1) とステップ 2.3.4 (図 2) に対応する結果が表示されます。PA14および∆ndvBは、三重化でMBC-PおよびMBC-Bアッセイに接種された。MBC-B プロトコルのステップ 1.0-1.4 および MBC-P プロトコルのステップ 2.0-2.3 を完了した後?...

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Establishing the Minimal Bactericidal Concentration of an Antimicrobial Agent for Planktonic Cells MBC-P and Biofilm Cells MBC-B

プランクトン細胞(MBC-P)およびバイオフィルム細胞(MBC-B)の抗菌剤の最小殺菌濃度の確立

このプロトコルは、96ウェルマイクロタイタープレートを使用して インビトロで バイオフィルムを形成することができる細菌株のプランクトニックとバイオフィルム耐性の間の直接比較を可能にする。プランクトニックまたはバイオフィルム細菌は、選択した抗菌剤の連続希釈液に曝露される。生存率は寒天プレート上の成長によってアッセイされる。

This protocol allows for a direct comparison between planktonic and biofilm resistance for a bacterial strain that can form a biofilm in vitro. Bacteria ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishing the Minimal Bactericidal Concentration of an Antimicrobial Agent for Planktonic Cells (MBC-P) and Biofilm Cells (MBC-B)

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

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フローセル内の緑膿菌と出芽酵母のバイオフィルム

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

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8ウェルチャンバースライドを用いたin vitro のバイオフィルム形成における

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

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細胞運命を以下に<em&gt; E大腸菌の</emラムダファージによる感染後&gt;

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

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呼吸器病原体に対する宿主細胞応答を研究するために偏ヒト気道上皮Calu-3細胞の液体に覆われた文化の確立<em&gt;インビトロ</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

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調節するc-ジ-GMPシグナリングで、小さな分子をスクリーニングするためのハイスループットセットアップの確立<em&gt;緑膿菌</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi

細菌や真菌によってウイルス感染細胞上のバイオフィルムの開始の決意

The study of polymicrobial interactions across the taxonomic kingdoms that include fungi, bacteria and virus have not been previously examined with ...

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超高感度単一分子の開発と検証配列人間のインターフェロン-α のデジタルの酵素免疫測定法

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