Name: establishing the minimal bactericidal concentration of an antimicrobial agent for planktonic cells (mbc-p) and biofilm cells (mbc-b)
Uploaded: 2014-01-02T20:00:00
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O autor gostaria de agradecer li Zhang, Xian-Zhi Li, Aaron Hinz, e Clayton Hall para ajuda editorial com este manuscrito. Este ensaio foi inicialmente desenvolvido no laboratório de George O'Toole, Geisel School of Medicine em Dartmouth. A pesquisa no laboratório do Dr. Mah é apoiada por bolsas do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá e da Fibrose Cística do Canadá.

1. MBC-B
<ol><li>
Crescimento de um biofilme (adaptado de O'Toole9).
	<ol>
<li>Cresça uma cultura do tipo selvagem de interesse e tensão mutante por 16 horas em um meio rico a 37 °C.</li>
		<li>Diluir as culturas saturadas durante a noite 1:100 em meio fresco para ensaios de resistência a antibióticos. Um meio padrão para P. aeruginosa é m63 médio mínimo suplementado com sulfato de magnésio e arginina (ver Tabela 1). Este meio estimula a f...

<ol>
	<li>Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+resistance+of+bacterial+biofilms.">Antibiotic resistance of bacterial biofilms.</a> Int. J. Antimicrob. Agents. 35 (4), 322-332 (2010).</li><li>Mah, T. F., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+biofilm+resistance+to+antimicrobial+agents.">Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents.</a> Trends Microbiol. 9 (1), 34-39 (2001).</li><li>Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm-specific+antibiotic+resistance.">Biofilm-specific antibiotic resistance.</a> Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).</li><li>Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+basis+for+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+antibiotic+resistance.">A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance.</a> Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).</li><li>Zhang, L., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Involvement+of+a+Novel+Efflux+System+in+Biofilm-Specific+Resistance+to+Antibiotics.">The Involvement of a Novel Efflux System in Biofilm-Specific Resistance to Antibiotics.</a> J. Bacteriol. 190 (13), 4447-4452 (2008).</li><li>Zhang, L., Hinz, A. J., Nadeau, J. P., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+tssC1+Links+Type+VI+Secretion+and+Biofilm-specific+Antibiotic+Resistance.">Pseudomonas aeruginosa tssC1 Links Type VI Secretion and Biofilm-specific Antibiotic Resistance.</a> J. Bacteriol. 193 (19), 5510-5513 (2011).</li><li>Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biofilm-Specific+Antibiotic+Resistance+Gene,+ndvB,+is+Important+for+Expression+of+Ethanol+Oxidation+Genes+in+Pseudomonas+aeruginosa+Biofilms.">The Biofilm-Specific Antibiotic Resistance Gene, ndvB, is Important for Expression of Ethanol Oxidation Genes in Pseudomonas aeruginosa Biofilms.</a> J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).</li><li>O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtiter+Dish+Biofilm+Formation+Assay.">Microtiter Dish Biofilm Formation Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2437 (2011).</li><li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug+tolerance+of+biofilms+and+persister+cells.">Multidrug tolerance of biofilms and persister cells.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 322, 107-131 (2008).</li><li>Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+and+Analyzing+Static+Biofilms.">Growing and Analyzing Static Biofilms.</a> Curr. Protoc. Microbiol. 1, 1B.1.1-1B.1.17 (2005).</li><li>Ramey, B. E., Parsek, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+1.+Growing+and+analyzing+biofilms+in+fermenters.">Chapter 1. Growing and analyzing biofilms in fermenters.</a> Curr. Protoc. Microbiol. 1, 1B.3.1-1B.3.14 (2005).</li></ol>

A resistência a antibióticos em células planctônicas é definida como um aumento na concentração inibitória mínima (MIC) de um antibiótico devido a uma mudança permanente nas células (por exemplo, uma mutação). Os mecanismos de resistência ou tolerância específicas de biofilmes que foram identificados até hoje são o resultado da expressão de genes do tipo selvagem dentro de biofilmes. Assim, a definição clássica de resistência não se aplica a biofilmes. No entanto, outro conjunto de defin...

Ensaios de resistência a antibióticos foram inicialmente desenvolvidos para avaliar a resistência de culturas planctônicas (natação livre) de bactérias. Como muitas infecções bacterianas envolvem biofilmes (células ligadas à superfície), estávamos interessados em desenvolver um método para avaliar a resistência a antibióticos específicos do biofilme. No entanto, a maioria dos ensaios de resistência a antibióticos são pouco adequados para medir a resistência de biofilmes. Por exemplo, determinar a concentração inibitória mínima (MIC) é o padrão-ouro para determinar a resistência a antibióticos das culturas bacterianas planctônicas 1. Este ensaio implica misturar uma cultura plantiônica diluída com uma série de diluição de antibióticos.  A concentração de antibiótico que inibe o crescimento visível das células planctônicas é o MIC. Uma vez que este ensaio se baseia na inibição do crescimento, por definição, ele não pode trabalhar com culturas de biofilme, o que requer examinar a sensibilidade antibiótico das células em um biofilme pré-cultivado. Em vez de medir a inibição do crescimento, o ensaio MBC-B descrito aqui determina a concentração de antibiótico que mata células já existentes em um biofilme. Assim, este ensaio visa imitar tratamentos antibióticos de infecções por biofilmes estabelecidas, e fornecer uma visão mais relevante da resistência a antibióticos bacterianos in vivo.
Uma vez que os biofilmes são geralmente mais resistentes a antibióticos do que as culturas planctônicas 2-4, foi necessário elaborar um método que relaciona diretamente a resistência a antibióticos de um biofilme com o de uma cultura planctônica. Assim, outro objetivo deste método é ser capaz de comparar diretamente o nível de resistência a antibióticos entre células planctônicas e biofilmes. Os ensaios MBC-P e MBC-B descritos aqui tornam isso possível porque as células são cultivadas em condições semelhantes. Utilizamos este método para estudar vários genes que são importantes para a resistência a antibióticos específicas de biofilme 5-8 .

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			1x&#160;M63
			</td>
			<td style="width:160px;">
			
			</td>
			<td style="width:160px;">
			
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Prepare as a 5x&#160;M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature.&#160; Dilute 5x&#160;stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components.
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			KH2PO4
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Fisher
			</td>
			<td style="width:160px;">
			P285-500
			</td>
			<td style="width:160px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			K2HPO4
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Fisher
			</td>
			<td style="width:160px;">
			P288-500
			</td>
			<td style="width:160px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			(NH4)2SO4
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:160px;">
			A5132
			</td>
			<td style="width:160px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			Magnesium sulfate
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Fisher
			</td>
			<td style="width:160px;">
			M63-500
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Add to 1 mM final concentration.&#160; Prepare as a 1 M stock in water and autoclave.
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			Tobramycin
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:160px;">
			
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Prepare 50 mg/m&#160;stock. Aliquot and store at -20&#176;C.
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			Arginine
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:160px;">
			A5131
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Add to 0.4% final concentration.&#160; Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize.&#160; This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			96-well microtiter plates
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Corning
			</td>
			<td style="width:160px;">
			3595
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Sterile, flat-bottom, low evaporation
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			Tranferpette (multichannel pipette)
			</td>
			<td style="width:160px;">
			BrandTech
			</td>
			<td style="width:160px;">
			2703610
			</td>
			<td style="width:160px;">
			8-channel, 20-200 &#956;l
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			Multiprong device
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Dan-Kar
			</td>
			<td style="width:160px;">
			MC48
			</td>
			<td style="width:160px;">
			48 prongs fit into &#189; of a 96-well microtiter plate
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing the minimal bactericidal concentration of an antimicrobial agent for planktonic cells (mbc-p) and biofilm cells (mbc-b)

Este protocolo permite uma comparação direta entre a resistência planctônica e biofilme para uma cepa bacteriana que pode formar um biofilme in vitro. Bactérias são inoculadas nos poços de uma placa de microtismo de 96 poços. No caso do ensaio plantônico, diluições seriais do agente antimicrobiano de escolha são adicionadas às suspensões bacterianas. No ensaio de biofilme, uma vez inoculado, as bactérias são deixadas para formar um biofilme durante um determinado período de tempo. Células nãoectadas são removidas dos poços, a mídia é reabastecida e diluições seriais do agente antimicrobiano de escolha são adicionadas. Após a exposição ao agente antimicrobiano, as células planctônicas são avaliadas para o crescimento. Para o ensaio de biofilme, a mídia é atualizada com mídia fresca sem o agente antimicrobiano e as células de biofilm são deixadas para se recuperar. A viabilidade da célula biofilm é avaliada após o período de recuperação. O MBC-P para o agente antimicrobiano é definido como a menor concentração de droga que mata as células na cultura planctônica.  Em contrapartida, o MBC-B para uma cepa é determinado expondo biofilmes pré-formados ao aumento das concentrações de agente antimicrobiano por 24 horas. O MBC-B é definido como a menor concentração de agente antimicrobiano que mata as células do biofilme.

Foram realizados ensaios MBC-P e MBC-B, comparando a sensibilidade do tipo selvagem PA14 com o PA14 ∆ndvB. A tobramicina foi usada como antibiótico. São apresentados resultados correspondentes à etapa 1.4.4 (Figura 1) e à etapa 2.3.4 (Figura 2). PA14 e ∆ndvB foram inoculados nos ensaios MBC-P e MBC-B em triplicado. Após a conclusão das etapas 1.0-1.4 do protocolo MBC-B e as etapas 2.0-2.3 do protocolo MBC-P, as células viáveis foram emplacar em uma placa de ...

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Establishing the Minimal Bactericidal Concentration of an Antimicrobial Agent for Planktonic Cells MBC-P and Biofilm Cells MBC-B

Estabelecendo a Concentração Bactericidal Mínima de um Agente Antimicrobiano para Células Planktônicas (MBC-P) e Células Biofilm (MBC-B)

Este protocolo permite uma comparação direta entre a resistência planctônica e biofilme para uma cepa bacteriana que pode formar um biofilme in vitro usando uma placa de microtismo de 96 poços. Bactérias planctônicas ou biofilmes são expostas a diluições seriais do agente antimicrobiano de escolha. A viabilidade é avaliada pelo crescimento em placas de ágar.

This protocol allows for a direct comparison between planktonic and biofilm resistance for a bacterial strain that can form a biofilm in vitro. Bacteria ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishing the Minimal Bactericidal Concentration of an Antimicrobial Agent for Planktonic Cells (MBC-P) and Biofilm Cells (MBC-B)

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa e Saccharomyces cerevisiae Biofilme em Células de Fluxo

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Imunologia e Infecção

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro a formação de biofilme em um slide Câmara de 8 poços

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Seguindo o destino celular, em<em&gt; E. coli</em&gt; Após a infecção por um fago Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

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Estabelecer uma cultura líquida, coberta de vias respiratórias humanas epiteliais Polarized Calu-3 células para estudar a resposta Cell Host para patógenos respiratórios<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Estabelecimento de um programa de configuração de alta capacidade para a triagem de pequenas moléculas que modulam c-di-GMP Sinalização<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi

Determinação do biofilme Iniciação em células infectadas por vírus por bactérias e fungos

The study of polymicrobial interactions across the taxonomic kingdoms that include fungi, bacteria and virus have not been previously examined with ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

Desenvolvimento e validação de uma única molécula ultra-sensível de matriz Digital ensaio imunossorvente ligado à enzima para humana Interferon-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

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