Name: establishing the minimal bactericidal concentration of an antimicrobial agent for planktonic cells (mbc-p) and biofilm cells (mbc-b)
Uploaded: 2014-01-02T20:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing the Minimal Bactericidal Concentration of an Antimicrobial Agent for Planktonic Cells MBC-P and Biofilm Cells MBC-B at JoVE.com

Författaren vill tacka Li Zhang, Xian-Zhi Li, Aaron Hinz och Clayton Hall för redaktionell hjälp med detta manuskript. Denna analys utvecklades ursprungligen i labbet av George O'Toole, Geisel School of Medicine vid Dartmouth. Forskning i Dr. Mahs labb stöds av bidrag från Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada och Cystic Fibrosis Canada.

1. MBC-B
<ol><li>
Odla en biofilm (anpassad från O'Toole9).
	<ol>
<li>Odla en kultur av den vilda typen av intresse och mutantstam i 16 timmar i ett rikt medium vid 37 °C.</li>
		<li>Späd ut de mättade nattkulturerna 1:100 till färskt medium för antibiotikaresistensanalyser. Ett standardmedium för P. aeruginosa är M63 minimalt medium kompletterat med magnesiumsulfat och arginin (se tabell 1). Detta medium stimulerar bildandet av en mer robus...

<ol>
	<li>Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+resistance+of+bacterial+biofilms.">Antibiotic resistance of bacterial biofilms.</a> Int. J. Antimicrob. Agents. 35 (4), 322-332 (2010).</li><li>Mah, T. F., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+biofilm+resistance+to+antimicrobial+agents.">Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents.</a> Trends Microbiol. 9 (1), 34-39 (2001).</li><li>Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm-specific+antibiotic+resistance.">Biofilm-specific antibiotic resistance.</a> Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).</li><li>Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+basis+for+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+antibiotic+resistance.">A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance.</a> Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).</li><li>Zhang, L., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Involvement+of+a+Novel+Efflux+System+in+Biofilm-Specific+Resistance+to+Antibiotics.">The Involvement of a Novel Efflux System in Biofilm-Specific Resistance to Antibiotics.</a> J. Bacteriol. 190 (13), 4447-4452 (2008).</li><li>Zhang, L., Hinz, A. J., Nadeau, J. P., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+tssC1+Links+Type+VI+Secretion+and+Biofilm-specific+Antibiotic+Resistance.">Pseudomonas aeruginosa tssC1 Links Type VI Secretion and Biofilm-specific Antibiotic Resistance.</a> J. Bacteriol. 193 (19), 5510-5513 (2011).</li><li>Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biofilm-Specific+Antibiotic+Resistance+Gene,+ndvB,+is+Important+for+Expression+of+Ethanol+Oxidation+Genes+in+Pseudomonas+aeruginosa+Biofilms.">The Biofilm-Specific Antibiotic Resistance Gene, ndvB, is Important for Expression of Ethanol Oxidation Genes in Pseudomonas aeruginosa Biofilms.</a> J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).</li><li>O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtiter+Dish+Biofilm+Formation+Assay.">Microtiter Dish Biofilm Formation Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2437 (2011).</li><li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug+tolerance+of+biofilms+and+persister+cells.">Multidrug tolerance of biofilms and persister cells.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 322, 107-131 (2008).</li><li>Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+and+Analyzing+Static+Biofilms.">Growing and Analyzing Static Biofilms.</a> Curr. Protoc. Microbiol. 1, 1B.1.1-1B.1.17 (2005).</li><li>Ramey, B. E., Parsek, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+1.+Growing+and+analyzing+biofilms+in+fermenters.">Chapter 1. Growing and analyzing biofilms in fermenters.</a> Curr. Protoc. Microbiol. 1, 1B.3.1-1B.3.14 (2005).</li></ol>

Antibiotikaresistens i planktoniska celler definieras som en ökning av den minsta hämmande koncentrationen (MIC) av ett antibiotikum på grund av en permanent förändring i cellerna(t.ex. en mutation). De mekanismer för biofilmsspecifik resistens eller tolerans som hittills har identifierats är resultatet av uttrycket av vilda gener inom biofilmer. Således gäller den klassiska definitionen av resistens inte biofilmer. En annan uppsättning definitioner har dock presenterats: resistensmekanismer hindrar an...

Antibiotikaresistens analyser utvecklades ursprungligen för att analysera resistens av planktoniska (fri simning) kulturer av bakterier. Eftersom många bakteriella infektioner involverar biofilmer (ytanslutna celler) var vi intresserade av att utveckla en metod för att analysera biofilmsspecifik antibiotikaresistens. De flesta antibiotikaresistensanalyser är dock dåligt lämpade för att mäta biofilmsresistens. Att till exempel bestämma den minimala hämmande koncentrationen (MIC) är guldstandarden för bestämning av antibiotikaresistens hos planktoniska bakteriekulturer 1. Denna analys innebär att blanda en utspädd planktonisk kultur med en utspädningsserie av antibiotika.  Koncentrationen av antibiotika som hämmar den synliga tillväxten av planktoniska celler är MIC. Eftersom denna analys förlitar sig på hämning av tillväxt, kan den per definition inte fungera med biofilmkulturer, vilket kräver att man undersöker cellernas antibiotikakänslighet i en pregrown biofilm. I stället för att mäta tillväxthämning bestämmer MBC-B-analysen som beskrivs här koncentrationen av antibiotika som dödar celler som redan finns i en biofilm. Således syftar denna analys till att efterlikna antibiotikabehandlingar av etablerade biofilminfektioner och ge en mer relevant bild av bakteriell antibiotikaresistens in vivo.
Eftersom biofilmer i allmänhet är mer antibiotikaresistenta än planktoniska kulturer 2-4 , var det nödvändigt att utforma en metod som direkt relaterar antibiotikaresistensen hos en biofilm till en planktonisk kultur. Ett annat mål med denna metod är således att direkt kunna jämföra nivån av antibiotikaresistens mellan planktoniska och biofilmsceller. MBC-P och MBC-B analyser som beskrivs här gör detta möjligt eftersom celler odlas under liknande förhållanden. Vi har använt denna metod för att studera flera gener som är viktiga för biofilmsspecifik antibiotikaresistens 5-8 .

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			1x&#160;M63
			</td>
			<td style="width:160px;">
			
			</td>
			<td style="width:160px;">
			
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Prepare as a 5x&#160;M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature.&#160; Dilute 5x&#160;stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components.
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			KH2PO4
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Fisher
			</td>
			<td style="width:160px;">
			P285-500
			</td>
			<td style="width:160px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			K2HPO4
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Fisher
			</td>
			<td style="width:160px;">
			P288-500
			</td>
			<td style="width:160px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			(NH4)2SO4
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:160px;">
			A5132
			</td>
			<td style="width:160px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			Magnesium sulfate
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Fisher
			</td>
			<td style="width:160px;">
			M63-500
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Add to 1 mM final concentration.&#160; Prepare as a 1 M stock in water and autoclave.
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			Tobramycin
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:160px;">
			
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Prepare 50 mg/m&#160;stock. Aliquot and store at -20&#176;C.
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			Arginine
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:160px;">
			A5131
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Add to 0.4% final concentration.&#160; Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize.&#160; This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			96-well microtiter plates
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Corning
			</td>
			<td style="width:160px;">
			3595
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Sterile, flat-bottom, low evaporation
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			Tranferpette (multichannel pipette)
			</td>
			<td style="width:160px;">
			BrandTech
			</td>
			<td style="width:160px;">
			2703610
			</td>
			<td style="width:160px;">
			8-channel, 20-200 &#956;l
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			Multiprong device
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Dan-Kar
			</td>
			<td style="width:160px;">
			MC48
			</td>
			<td style="width:160px;">
			48 prongs fit into &#189; of a 96-well microtiter plate
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing the minimal bactericidal concentration of an antimicrobial agent for planktonic cells (mbc-p) and biofilm cells (mbc-b)

Detta protokoll möjliggör en direkt jämförelse mellan planktonisk och biofilmsresistens för en bakteriestam som kan bilda en biofilm in vitro. Bakterier vaccinerar sig i brunnarna på en 96-brunns mikrotiterplatta. När det gäller planktonisk analys tillsätts seriella utspädningar av det antimikrobiella medlet till bakteriella suspensioner. I biofilmstestet, när de väl har vaccinelats, lämnas bakterierna att bilda en biofilm under en viss tidsperiod. Obundna celler avlägsnas från brunnarna, mediet fylls på och seriella utspädningar av det antimikrobiella medlet läggs till. Efter exponering för det antimikrobiella medlet analyseras planktoniska celler för tillväxt. För biofilmsanalysen uppdateras mediet med färska medier som saknar det antimikrobiella medlet och biofilmscellerna lämnas att återhämta sig. Biofilmcellens livskraft analyseras efter återhämtningsperioden. MBC-P för det antimikrobiella medlet definieras som den lägsta koncentrationen av läkemedel som dödar cellerna i planktoniska kulturen.  Däremot bestäms MBC-B för en stam genom att exponera förformade biofilmer för ökande koncentrationer av antimikrobiellt medel i 24 timmar. MBC-B definieras som den lägsta koncentrationen av antimikrobiellt medel som dödar cellerna i biofilmen.

MBC-P- och MBC-B-analyser utfördes och jämförde känsligheten hos PA14 vildtyp med PA14 ∆ndvB. Tobramycin användes som antibiotika. Resultat motsvarande steg 1.4.4(figur 1)och steg 2.3.4(figur 2)presenteras. PA14 och ∆ndvB inokulerades i MBC-P och MBC-B analyser i tre exemplar. Efter att ha slutfört steg 1.0-1.4 i MBC-B-protokollet och steg 2.0-2.3 i MBC-P-protokollet, pläterades de livskraftiga cellerna på en LB agar-platta. Koncentrationer av tobramycin<spa...

Watch this Scientific Journal Video about Establishing the Minimal Bactericidal Concentration of an Antimicrobial Agent for Planktonic Cells MBC-P and Biofilm Cells MBC-B at JoVE.com

Establishing the Minimal Bactericidal Concentration of an Antimicrobial Agent for Planktonic Cells MBC-P and Biofilm Cells MBC-B

Upprättande av minimal bakteriedödande koncentration av ett antimikrobiellt medel för planktoniska celler (MBC-P) och biofilmceller (MBC-B)

Detta protokoll möjliggör en direkt jämförelse mellan planktonisk och biofilmsbeständighet för en bakteriestam som kan bilda en biofilm in vitro med en 96-brunns mikrotiterplatta. Planktoniska bakterier eller biofilmsbakterier utsätts för seriella utspädningar av det antimikrobiella medlet. Livskraft analyseras genom tillväxt på agarplattor.

This protocol allows for a direct comparison between planktonic and biofilm resistance for a bacterial strain that can form a biofilm in vitro. Bacteria ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishing the Minimal Bactericidal Concentration of an Antimicrobial Agent for Planktonic Cells (MBC-P) and Biofilm Cells (MBC-B)

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa och Saccharomyces cerevisiae biofilm i Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro biofilm bildning i en 8-brunnars avdelningen Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Efter Cell-öde i<em&gt; E. E. coli</em&gt; Efter infektion av fag lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Att upprätta en flytande täckt kultur av polariserad Human luftvägsepitelceller Calu-3 celler för att studera svar värdcellen för luftvägspatogener<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Inrättandet av en hög kapacitet Setup för screening av små molekyler som modulerar c-di-GMP Signalering i<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi

Bestämning av biofilm Initiation på virusinfekterade celler av bakterier och svampar

The study of polymicrobial interactions across the taxonomic kingdoms that include fungi, bacteria and virus have not been previously examined with ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

Utveckling och validering av en Ultrasensitive enda molekyl Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay för humant Interferon-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

Multicolor flöde flödescytometri-baserade kvantifiering av mitokondrier och lysosomer i T-celler

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

En hög genomströmning Shigella-specifika bakteriedödande analysmetod

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Production and Characterization of Human Macrophages from Pluripotent Stem Cells

Produktion och karakterisering av humana makrofager från pluripotenta stamceller

Macrophages are present in most vertebrate tissues and comprise widely dispersed and heterogeneous cell populations with different functions. They are key ...