Name: membrane potential dye imaging of ventromedial hypothalamus neurons from adult mice to study glucose sensing
Uploaded: 2013-11-27T22:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing at JoVE.com

NIH R01 DK55619, NIH R21 CA139063

1. Tiere <ol><li> Alle Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss an der Universität für Medizin und Zahnmedizin von New Jersey zugelassen. </li><li> Gruppenhaus männlichen C57BL / 6 Mäuse auf einem 12-Stunden-Licht/12 hr dunklen Zeitplan und damit freien Zugang zu Wasser und Nahrung. Sacrifice bei 4-5 Monaten. Euthanasie der Mäuse wurde unter Verwendung der Operationsebene Anästhesie und eine sekundäre Form der Euthanasie (dh dringende Einschnitt in den Brustra...

<ol>
	<li>Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose-sensing+neurons:+are+they+physiologically+relevant?.">Glucose-sensing neurons: are they physiologically relevant?.</a> Physiol. Behav. 76, 403-413 (2002).</li><li>Canabal, D. D., Potian, J. G., Duran, R. G., McArdle, J. J., Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycemia+impairs+glucose+and+insulin+regulation+of+nitric+oxide+production+in+glucose-inhibited+neurons+in+the+ventromedial+hypothalamus.">Hyperglycemia impairs glucose and insulin regulation of nitric oxide production in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus.</a> Am. J. Physiol. 293, 592-600 (2007).</li><li>Canabal, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose,+insulin,+and+leptin+signaling+pathways+modulate+nitric+oxide+synthesis+in+glucose-inhibited+neurons+in+the+ventromedial+hypothalamus.">Glucose, insulin, and leptin signaling pathways modulate nitric oxide synthesis in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus.</a> American journal of physiology. Reg. Integr. Comp. Physiol. 292, 1418-1428 (2007).</li><li>Murphy, B. A., Fakira, K. A., Song, Z., Beuve, A., Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMP-activated+protein+kinase+and+nitric+oxide+regulate+the+glucose+sensitivity+of+ventromedial+hypothalamic+glucose-inhibited+neurons.">AMP-activated protein kinase and nitric oxide regulate the glucose sensitivity of ventromedial hypothalamic glucose-inhibited neurons.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C750-C758 (2009).</li><li>Murphy, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fasting+enhances+the+response+of+arcuate+neuropeptide+Y-glucose-inhibited+neurons+to+decreased+extracellular+glucose.">Fasting enhances the response of arcuate neuropeptide Y-glucose-inhibited neurons to decreased extracellular glucose.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296, C746-C756 (2009).</li><li>Kang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucokinase+is+a+critical+regulator+of+ventromedial+hypothalamic+neuronal+glucosensing.">Glucokinase is a critical regulator of ventromedial hypothalamic neuronal glucosensing.</a> Diabetes. 55, 412-420 (2006).</li><li>Kang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prior+hypoglycemia+enhances+glucose+responsiveness+in+some+ventromedial+hypothalamic+glucosensing+neurons.">Prior hypoglycemia enhances glucose responsiveness in some ventromedial hypothalamic glucosensing neurons.</a> Reg. Integr. Comp. Physiol. 294, R784-R792 (2008).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2004).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1998).</li><li>Song, Z., Levin, B. E., McArdle, J. J., Bakhos, N., Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+of+pre-+and+postsynaptic+influences+on+glucosensing+neurons+in+the+ventromedial+hypothalamic+nucleus.">Convergence of pre- and postsynaptic influences on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus.</a> Diabetes. 50, 2673-2681 (2001).</li><li>Song, Z., Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+glucose+and+lactate+on+glucosensing+neurons+in+the+ventromedial+hypothalamic+nucleus.">Differential effects of glucose and lactate on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus.</a> Diabetes. 54, 15-22 (2005).</li></ol>

Der Schlüssel zu der Möglichkeit, Aktivität von Nervenzellen aus adulten Mäusen untersucht werden, ist die Fähigkeit, gesunde Neuronen zu distanzieren. Die Dissoziation von Hypothalamus Neuronen aus erwachsenen Mäusen ist an mehreren wichtigen Schritte im Protokoll schwieriger im Vergleich zu Neuronen aus jungen Mäusen. Wir haben dieses Problem auf mehrere Arten zu überwinden. Machen 500 um dicken Hirnschnitten minimiert mechanische Schädigung von Neuronen im Vergleich zu den üblichen 250-350 um Scheiben für ...

Das Gehirn reguliert Energie-Homöostase durch die neuroendokrinen und autonomen Nervensystem. Ventromedialen Hypothalamus (VMH), des ventromedialen Nukleus (VMN) und dem bogenförmigen Kern (ARC) umfassen, ist für die zentrale Überwachung der Energie Homöostase. Specialized Glukosemess Neuronen im VMH, link neuronale Aktivität und peripheren Glukose-Homöostase ein. Es gibt zwei Arten von Glucose Sensor-Neuronen, Glucose angeregt (GE) Neuronen zu erhöhen, während Glukose gehemmt (GI) Neuronen ihre Aktivität verringern, wie extrazelluläre Glukose steigt. VMH Glucose Sensor-Neuronen sind in der Regel mit Hilfe der Elektrophysiologie oder Calcium / Membranpotential empfindlichen Farbstoff-Bildgebung untersucht. Die elektrophysiologische Patch-Clamp-Technik gilt als der Goldstandard in der Studie der ex vivo neuronalen Aktivität sein. Bei dieser Technik wird eine Glas-Mikropipette Elektrode an die Zellmembran über einen hohen Widerstand angeschlossen(GOhm) Siegel. Patch-Clamp-Elektroden ermöglichen Echtzeit-Aufzeichnung von Aktionspotentialfrequenz (Stromzange) oder Ionenleitfähigkeit (Spannungsklemme) innerhalb eines einzelnen Neurons verändert. Während der Patch-Clamp-Technik liefert detaillierte Informationen über Änderungen in bestimmten Ionenkanalleitfähigkeiten, ist ein großer Nachteil, dass nur ein Neuron in einer Zeit beobachtet. Es dauert ca. 30-45 min von Aufnahme zu beginnen, bevor auch nur eine bestimmte experimentelle Behandlung zu überprüfen, ob man die Aufnahme aus einer Glucose-Mess Neurons. Außerdem umfassen GI und GE Neuronen &lt;20% der Gesamt VMH neuronalen Population. Compounding dieses Problem ist der Mangel, in vielen Fällen eine Identifizierung zellulärer Marker für diese Neuronen. So ist es klar, dass trotz wertvolle elektrische Informationen, die andere Techniken nicht, ist Patch-Clamp-Analyse mühsam, zeitaufwendig und geringe Ausbeute. Die Verwendung von Fluoreszenz-Bildgebungs dissoziierter VMH Neuronen ermöglicht die Untersuchung von hundreds von Neuronen gleichzeitig. Calcium-sensitiven Farbstoffen verwendet werden, um intrazellulären Calcium-Änderungen, die indirekt auf Veränderungen der neuronalen Aktivität korrelieren zu messen. Membranpotential empfindliche Farbstoffe verwendet werden, um Membranpotential Änderungen zu überwachen. Mess zellulären Membranpotentials ist ein direkter Index der neuronalen Aktivität im Vergleich zu Veränderungen der intrazellulären Kalziumspiegel. Außerdem Membranpotential-Farbstoff (MPD)-Bildgebung erfasst potenziell kleinere Änderungen des Membranpotentials, wo Aktionspotential Brenn nicht verändert wird und intrazellulären Kalziumspiegel nicht ändern könnten. Diese beiden Fluoreszenz-Bildgebungstechniken verwendet worden, um VMH Glucose erfassenden Neuronen von jungen Mäusen 2-7 studieren. Während die Ergebnisse sind weniger detailliert als die mit Patch-Clamp-Elektrophysiologie erhalten, ist die Stärke des bildgebenden Experimenten, dass sie bewerten, gleichzeitig eine große Population von Zellen, die auf jeden Fall auch eine beträchtliche Anzahl von Glukosemess Neuronen. MPD Bild iist besonders nützlich für die Untersuchung GI Neuronen, die gleichmäßiger über den gesamten VMH lokalisiert sind, wodurch eine ausreichende Population in der dissoziierten VMH (~ 15% GI) zu studieren. Im Gegensatz dazu, während GE Neuronen sind dicht an den ventrolateralen VMN-und Zell armen Bereich zwischen der ARC und VMN lokalisiert, sie stellen keine signifikante Anzahl von Neuronen innerhalb des VMH (&lt;1% GE). Darüber hinaus wird durch das Studium isoliert Neuronen, Astrozyten und präsynaptischen Effekte eliminiert werden. Dies kann ein Vorteil bei der Untersuchung ersten Neuron-Effekte, als auch ein Nachteil sein, da physiologischen Verbindungen und Prozesse verloren gehen. Ein limitierender Faktor sowohl Patch-Clamp-Elektrophysiologie und MPD / Calcium-Farbstoff-Bildgebung ist die Notwendigkeit, jüngere Tiere (zB. Mäuse oder Ratten &lt;8 Wochen alt) zu verwenden. Dies ist vor allem aufgrund der erhöhten Bindegewebe in Kombination mit einer verminderten neuronalen Lebensfähigkeit, die mit zunehmendem Alter auftritt. Im Gehirn-Slice-Elektrophysiologie Gestütn stellt erhöhte Bindegewebe es schwieriger, die Neuronen zu visualisieren. Vermehrter Bindegewebs macht es auch schwieriger, eine große Anzahl von gesunden Neuronen für Bildgebungsuntersuchungen dissoziieren. Außerdem Neuronen von jüngeren Tieren länger überleben entweder während der Aufnahme oder Patch-Clamp-Bildgebung. Jedoch kann die Verwendung von jungen Mäusen eine große Einschränkung sein. Neuronale Aktivität und / oder Antworten auf Neurotransmitter oder zirkulierenden Nährstoffen mit dem Alter verändern. Da beispielsweise die Energiebilanz ist eng mit reproduktiven Status gebunden, die Neuronen des Hypothalamus Regelenergiebilanz unterschiedlich in der Vor-vs postpubescent Tiere reagieren. Darüber hinaus haben viele Krankheiten erfordern eine langfristige Behandlung oder nicht erst im Erwachsenenalter manifestieren. Herausragende Beispiele für solche Erkrankungen sind Nahrungs Adipositas oder Typ-2-Diabetes mellitus. Da Glukose-Mess Neuronen werden vermutlich eine Rolle bei diesen Erkrankungen spielen wir eine Methode entwickelt, für die erfolgreiche Kultivierung von gesunden Erwachsenen VMH Neuronen für den Einsatz in Bild MPD experiments.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="947">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Neurobasal-A Medium (Custom)</td>
			<td style="width:115px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:180px;">0050128DJ</td>
			<td style="width:427px;">custom made glucose free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Hibernate-A Medium (Custom)</td>
			<td style="width:115px;">BrainBits</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td>custom made glucose free</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Penicillin streptomycin (20,000 U/ml)</td>
			<td style="width:115px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:180px;">15140</td>
			<td>other vendors acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Stericup vacuum filter units (0.22 &#956;m)</td>
			<td style="width:115px;">Millipore</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td>other vendors acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">25 mm Glass coverslips</td>
			<td style="width:115px;">Warner</td>
			<td style="width:180px;">#1 25mm round</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">18 mm Glass coverslips</td>
			<td style="width:115px;">Warner</td>
			<td style="width:180px;">#1 18mm round</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">GlutaMAX</td>
			<td style="width:115px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:180px;">35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">B27 minus insulin (50x)</td>
			<td style="width:115px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:180px;">0050129SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Razor blade</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:180px;">55411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Vibratome &#38; cooling chamber</td>
			<td style="width:115px;">Vibratome</td>
			<td style="width:180px;">Series 1000 Sectioning system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Vibratome blades</td>
			<td style="width:115px;">Polysciences</td>
			<td style="width:180px;">22370</td>
			<td>injector or double edge blades from other vendors acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Papain, suspension</td>
			<td style="width:115px;">Worthington</td>
			<td style="width:180px;">LS003124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">BSA, suitable for cell culture</td>
			<td style="width:115px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td>other vendor acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">DNAse, for cell culture</td>
			<td style="width:115px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td>other vendor acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">cloning cylinders, 6 mm x 8 mm</td>
			<td style="width:115px;">Bellco Glass</td>
			<td style="width:180px;">2090-00608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Membrane Potential Dye (blue)</td>
			<td style="width:115px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:180px;">R8042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">In-line heater</td>
			<td style="width:115px;">Warner</td>
			<td style="width:180px;">SF-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Syringe pumps</td>
			<td style="width:115px;">WPI</td>
			<td style="width:180px;">sp100i</td>
			<td>other vendor acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Closed chamber</td>
			<td style="width:115px;">Warner</td>
			<td style="width:180px;">RC-43C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Polyethylene tubing</td>
			<td style="width:115px;">Warner</td>
			<td style="width:180px;">PE-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Metamorph</td>
			<td style="width:115px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td>alternate image analysis software acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Microscope</td>
			<td style="width:115px;">Olympus</td>
			<td style="width:180px;">BX61 WI</td>
			<td>
			used with 10X&#160;objective
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Camera</td>
			<td style="width:115px;">Photometrics</td>
			<td style="width:180px;">Cool Snap HQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Narrow Cy3 Filter Set</td>
			<td style="width:115px;">Chroma</td>
			<td style="width:180px;">41007a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Illumination System</td>
			<td style="width:115px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:180px;">Lambda DG-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

membrane potential dye imaging of ventromedial hypothalamus neurons from adult mice to study glucose sensing

Studium der neuronalen Aktivität werden oft unter Verwendung von Neuronen aus Nager weniger als 2 Monaten aufgrund der technischen Schwierigkeiten mit zunehmender Bindegewebe verbunden und verringerte neuronale Lebensfähigkeit, die mit dem Alter auftreten. Hier beschreiben wir eine Methodik für die Dissoziation von gesunden Neuronen des Hypothalamus von Erwachsenen-Alter von Mäusen. Die Fähigkeit, Neuronen aus adulten Mäusen untersucht Alters erlaubt den Einsatz von Krankheitsmodellen, die in einem höheren Alter manifestieren und könnte für bestimmte Studien mehr entwicklungs genau sein. Fluoreszenz-Imaging von dissoziierten Neuronen verwendet werden, um die Aktivität einer Population von Neuronen zu untersuchen, im Gegensatz zur Verwendung der Elektrophysiologie an einem einzigen Neuron zu untersuchen. Dies ist besonders nützlich bei der Untersuchung eines heterogenen neuronalen Population in dem die gewünschte neuronale Aktivität ist selten wie Glucose Sensor-Neuronen des Hypothalamus. Wir verwendeten Membranpotential Farbstoff Bildgebung des ventromedialen Hypothalamus erwachsenen Neuronen, um ihre Reaktionen zu studieren changes in der extrazellulären Glucose. Glucose Sensing-Neuronen werden geglaubt, um eine Rolle in der zentralen Regulierung der Energiebilanz spielen. Die Fähigkeit, Glukose-Mess bei erwachsenen Nagetieren zu studieren, ist besonders nützlich, da die Dominanz von Krankheiten, die dysfunktionalen Energiebilanz (zB. Adipositas) nehmen mit dem Alter zusammen.

Die genaue Präparation des VMH von anderen Bereichen des Hypothalamus ist wichtig, um konsistente Ergebnisse zu erhalten. Die Einbeziehung von anderen Bereichen könnte die VMH neuronalen Population zu verdünnen, die Änderung der Verzehr% der Neuronen berechnet. Weiterhin wurden Glucose erfassenden Neuronen im Hypothalamus anderen Regionen, wie beispielsweise die lateralen Hypothalamus, die funktionell und mechanistisch von VMH Glucosesensorneuronen abweichen identifiziert. Fig. 1 zeigt die korrekten...

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Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Die Aktivität der einzelnen Neuronen aus erwachsenen Alters Mäusen kann durch distanziert Neuronen aus bestimmten Hirnregionen und unter Verwendung von fluoreszierenden Farbstoff Membranpotential Bildgebung untersucht werden. Durch Prüfung Antworten auf Veränderungen in Glucose, kann diese Technik verwendet, um die Glucoseempfindlichkeit von Erwachsenen ventromedialen Hypothalamus-Neuronen zu untersuchen.

Membrane Potential Dye Imaging von Ventromedial Hypothalamus Neuronen aus erwachsenen Mäusen zu Glucose Sensing Studieren

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

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