Name: membrane potential dye imaging of ventromedial hypothalamus neurons from adult mice to study glucose sensing
Uploaded: 2013-11-27T22:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing at JoVE.com

NIH R01 DK55619, NIH R21 CA139063

1. Животные <ol><li> Все процедуры были одобрены Комитетом Институциональная уходу и использованию животных в Университете медицины и стоматологии Нью-Джерси на. </li><li> Группа дом мужской мышей C57BL / 6 на 12 ч light/12 ч графику темной и позволяют вволю доступ к воде и пище. Жертвоприношение ?...

<ol>
	<li>Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose-sensing+neurons:+are+they+physiologically+relevant?.">Glucose-sensing neurons: are they physiologically relevant?.</a> Physiol. Behav. 76, 403-413 (2002).</li><li>Canabal, D. D., Potian, J. G., Duran, R. G., McArdle, J. J., Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycemia+impairs+glucose+and+insulin+regulation+of+nitric+oxide+production+in+glucose-inhibited+neurons+in+the+ventromedial+hypothalamus.">Hyperglycemia impairs glucose and insulin regulation of nitric oxide production in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus.</a> Am. J. Physiol. 293, 592-600 (2007).</li><li>Canabal, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose,+insulin,+and+leptin+signaling+pathways+modulate+nitric+oxide+synthesis+in+glucose-inhibited+neurons+in+the+ventromedial+hypothalamus.">Glucose, insulin, and leptin signaling pathways modulate nitric oxide synthesis in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus.</a> American journal of physiology. Reg. Integr. Comp. Physiol. 292, 1418-1428 (2007).</li><li>Murphy, B. A., Fakira, K. A., Song, Z., Beuve, A., Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMP-activated+protein+kinase+and+nitric+oxide+regulate+the+glucose+sensitivity+of+ventromedial+hypothalamic+glucose-inhibited+neurons.">AMP-activated protein kinase and nitric oxide regulate the glucose sensitivity of ventromedial hypothalamic glucose-inhibited neurons.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C750-C758 (2009).</li><li>Murphy, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fasting+enhances+the+response+of+arcuate+neuropeptide+Y-glucose-inhibited+neurons+to+decreased+extracellular+glucose.">Fasting enhances the response of arcuate neuropeptide Y-glucose-inhibited neurons to decreased extracellular glucose.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296, C746-C756 (2009).</li><li>Kang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucokinase+is+a+critical+regulator+of+ventromedial+hypothalamic+neuronal+glucosensing.">Glucokinase is a critical regulator of ventromedial hypothalamic neuronal glucosensing.</a> Diabetes. 55, 412-420 (2006).</li><li>Kang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prior+hypoglycemia+enhances+glucose+responsiveness+in+some+ventromedial+hypothalamic+glucosensing+neurons.">Prior hypoglycemia enhances glucose responsiveness in some ventromedial hypothalamic glucosensing neurons.</a> Reg. Integr. Comp. Physiol. 294, R784-R792 (2008).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2004).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1998).</li><li>Song, Z., Levin, B. E., McArdle, J. J., Bakhos, N., Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+of+pre-+and+postsynaptic+influences+on+glucosensing+neurons+in+the+ventromedial+hypothalamic+nucleus.">Convergence of pre- and postsynaptic influences on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus.</a> Diabetes. 50, 2673-2681 (2001).</li><li>Song, Z., Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+glucose+and+lactate+on+glucosensing+neurons+in+the+ventromedial+hypothalamic+nucleus.">Differential effects of glucose and lactate on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus.</a> Diabetes. 54, 15-22 (2005).</li></ol>

Ключ к возможности изучить активность нейронов от взрослых мышей является возможность отделить здоровые нейроны. Разобщенность нейронов гипоталамуса от взрослых мышей сложнее в нескольких ключевых шагов в протоколе по сравнению с нейронами мышей несовершеннолетних. Мы преодолели э...

Мозг регулирует энергетического гомеостаза через нейроэндокринной и вегетативной нервной системы. Вентромедиального гипоталамус (VMH), состоит из вентромедиального ядра (ВМН) и дугообразного ядра (ARC), имеет важное значение для центральной регуляции энергетического гомеостаза. Специализированный нейроны зондирования глюкозы, в VMH, ссылаются активность нейронов и периферийного гомеостаза глюкозы 1. Есть два типа глюкозы зондирования нейронов; глюкозы, возбуждаемые (GE) нейроны расти, а уровень глюкозы ингибирует (GI) нейроны уменьшить свою деятельность как внеклеточных глюкозы увеличивается. Нейроны VMH глюкозы зондирования, как правило, изучены с помощью электрофизиологии или потенциальную изображений чувствительный краситель кальция / мембраны. Электрофизиологические техника патч зажим считается золотым стандартом при изучении экс естественных нейронной активности. В этой технике, стекло микропипетки электрод прикреплен к клеточной мембране с помощью высокой устойчивостью(ГОм) печать. Патч зажим электроды позволяют в режиме реального времени записи потенциала действия частоты (ток зажима) или ион проводимости (зажим напряжения) меняет в пределах одного нейрона. В то время как техника патч зажим предоставляет подробную информацию об изменениях в конкретных проводимостей ионных каналов, основным недостатком является то, что только один нейрон может наблюдаться одновременно. Это занимает примерно 30-45 мин записи, чтобы убедиться, что один находится в режиме записи от чувствительного к глюкозе нейрона даже до начала конкретного экспериментальное лечение. Кроме того, GI и GE нейроны составляют &lt;20% от общей численности населения нейронов VMH. Усугубляет эту проблему, является отсутствие во многих случаях, из идентифицирующего сотовой маркера для этих нейронов. Таким образом, ясно, что, несмотря на ценную информацию электрический что другие методы не могут, анализ патч зажим является трудоемким, трудоемким и низкий выход. Использование визуализации флуоресценции диссоциированных нейронов ВМХ позволяет для изучения хуndreds нейронов одновременно. Кальций чувствительные красители могут быть использованы для измерения внутриклеточного кальция изменений, которые косвенно коррелируют с изменением активности нейронов. Мембранный потенциал чувствительные красители используются для мониторинга изменений мембранного потенциала. Измерение сотовой мембранный потенциал является более прямой индекс активности нейронов по сравнению с изменениями в внутриклеточных уровней кальция. Кроме того, мембранный потенциал краситель (MPD) изображений потенциально распознает малейшие изменения мембранного потенциала, где потенциал действия стрельбы не изменяется и внутриклеточные уровни кальция может не измениться. Оба этих методов визуализации флуоресценции были использованы для изучения VMH нейроны чувствительных к глюкозе у мышей с ювенильного 2-7. В то время как результаты менее подробная, чем полученные с патч зажим электрофизиологии, прочность экспериментов изображений является то, что они одновременно оценить большое популяцию клеток, которые неизбежно включают в себя значительное количество глюкозы нейронами зондирования. MPD изображений яы особенно полезны для изучения GI нейроны, которые более равномерно локализован по всей VMH; таким образом обеспечивая адекватное население учиться в диссоциированной VMH (~ 15% GI). В отличие от этого, в то время как GE нейроны плотно локализованы в вентролатеральной-VMN и клеточной бедном регионе между АРК и VMN, они не представляют значительное число нейронов в пределах VMH (&lt;1% GE). Кроме того, изучая изолированные нейроны, астроцитов и пресинаптические эффекты устраняются. Это может быть преимуществом в изучении последствий первого порядка нейронов, а также недостатком, поскольку физиологические соединений и процессов, будут потеряны. Ограничивающим фактором в обоих патч зажим электрофизиологии и визуализации MPD / кальция красителя является необходимость использовать более молодых животных (например,. Мышей или крыс &lt;возрасте 8 недель). Это преимущественно за счет увеличения соединительной ткани в сочетании с пониженной нейронной жизнеспособности, которое происходит с возрастом. В мозг-среза электрофизиологии шпильких годов, увеличилось соединительной ткани делает его более трудным для визуализации нейронов. Увеличение соединительной ткани также затрудняет отделить большое количество здоровых нейронов для визуальных исследований. Кроме того, нейроны от молодых животных живут дольше во время или записи патч зажим или изображений. Тем не менее, использование молодых мышей может быть основным ограничением. Активность нейронов и / или ответы на нейротрансмиттеров или циркулирующих питательных веществ меняются с возрастом. Например, так как энергетический баланс тесно связана с репродуктивного статуса, гипоталамуса нейроны, регулирующие энергетический баланс может иначе реагировать в предварительном против postpubescent животных. Кроме того, многие болезни требуют длительного лечения или не никак не проявляют до совершеннолетия. Ярким примером таких заболеваний являются пищевые ожирение или сахарный диабет 2 типа. Поскольку нейроны зондирования глюкозы, как полагают, играют определенную роль в этих болезней мы разработали методологию успешно культивирование здоровых взрослых VMH нейроны для использования в визуализации MPD ехрeriments.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="947">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Neurobasal-A Medium (Custom)</td>
			<td style="width:115px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:180px;">0050128DJ</td>
			<td style="width:427px;">custom made glucose free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Hibernate-A Medium (Custom)</td>
			<td style="width:115px;">BrainBits</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td>custom made glucose free</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Penicillin streptomycin (20,000 U/ml)</td>
			<td style="width:115px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:180px;">15140</td>
			<td>other vendors acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Stericup vacuum filter units (0.22 &#956;m)</td>
			<td style="width:115px;">Millipore</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td>other vendors acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">25 mm Glass coverslips</td>
			<td style="width:115px;">Warner</td>
			<td style="width:180px;">#1 25mm round</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">18 mm Glass coverslips</td>
			<td style="width:115px;">Warner</td>
			<td style="width:180px;">#1 18mm round</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">GlutaMAX</td>
			<td style="width:115px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:180px;">35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">B27 minus insulin (50x)</td>
			<td style="width:115px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:180px;">0050129SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Razor blade</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:180px;">55411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Vibratome &#38; cooling chamber</td>
			<td style="width:115px;">Vibratome</td>
			<td style="width:180px;">Series 1000 Sectioning system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Vibratome blades</td>
			<td style="width:115px;">Polysciences</td>
			<td style="width:180px;">22370</td>
			<td>injector or double edge blades from other vendors acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Papain, suspension</td>
			<td style="width:115px;">Worthington</td>
			<td style="width:180px;">LS003124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">BSA, suitable for cell culture</td>
			<td style="width:115px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td>other vendor acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">DNAse, for cell culture</td>
			<td style="width:115px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td>other vendor acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">cloning cylinders, 6 mm x 8 mm</td>
			<td style="width:115px;">Bellco Glass</td>
			<td style="width:180px;">2090-00608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Membrane Potential Dye (blue)</td>
			<td style="width:115px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:180px;">R8042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">In-line heater</td>
			<td style="width:115px;">Warner</td>
			<td style="width:180px;">SF-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Syringe pumps</td>
			<td style="width:115px;">WPI</td>
			<td style="width:180px;">sp100i</td>
			<td>other vendor acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Closed chamber</td>
			<td style="width:115px;">Warner</td>
			<td style="width:180px;">RC-43C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Polyethylene tubing</td>
			<td style="width:115px;">Warner</td>
			<td style="width:180px;">PE-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Metamorph</td>
			<td style="width:115px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td>alternate image analysis software acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Microscope</td>
			<td style="width:115px;">Olympus</td>
			<td style="width:180px;">BX61 WI</td>
			<td>
			used with 10X&#160;objective
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Camera</td>
			<td style="width:115px;">Photometrics</td>
			<td style="width:180px;">Cool Snap HQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Narrow Cy3 Filter Set</td>
			<td style="width:115px;">Chroma</td>
			<td style="width:180px;">41007a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Illumination System</td>
			<td style="width:115px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:180px;">Lambda DG-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

membrane potential dye imaging of ventromedial hypothalamus neurons from adult mice to study glucose sensing

Исследования активности нейронов часто выполняются с использованием нейроны от грызунов менее 2-месячного возраста в связи с техническими трудностями, связанными с увеличением соединительной ткани и снижение нейронов жизнеспособность, которые происходят с возрастом. Здесь мы описываем методологию для диссоциации здоровых нейронов гипоталамуса мышей взрослых возраста. Способность к обучению нейроны от взрослого возраста мышей позволяет использовать моделей заболеваний, которые проявляются в более позднем возрасте и может быть более умственно точным для некоторых исследований. Флуоресценции визуализации диссоциированных нейронов могут быть использованы для изучения деятельности населением нейронов, в отличие от использования электрофизиологии изучать один нейрон. Это особенно полезно при исследовании гетерогенную популяцию нейронов, в котором желаемый тип нейронов является редким, таких как, гипоталамических глюкозы зондирования нейронов. Мы использовали мембранного потенциала красителя визуализации взрослых вентромедиальных нейронов гипоталамуса изучать свои ответы на чаНГРЭС в внеклеточной глюкозы. Нейроны Глюкоза зондирования, как полагают, играют определенную роль в центральной регуляции энергетического баланса. Способность к обучению зондирования глюкозы у взрослых грызунов особенно полезно с преобладанием заболеваний, связанных с неблагополучной энергетического баланса (например. Ожирение) увеличивается с возрастом.

Точная рассечение VMH от других гипоталамуса областях важно получить устойчивые результаты. Включение других местах может разбавить нейронов население VMH, изменяя% от деполяризованных нейронов расчетных. Кроме того, глюкозы нейроны зондирования были определены в других гипоталамуса р...

Watch this Scientific Journal Video about Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing at JoVE.com

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Деятельность отдельных нейронов мышей взрослых возраста можно изучать с помощью диссоциации нейроны от конкретных областях мозга и использованием изображений потенциальную красителя люминесцентные мембраны. По тестирования реакциям на изменения глюкозы, этот метод может быть использован для изучения чувствительности к глюкозе взрослых вентромедиальных нейронов гипоталамуса.

Мембранный потенциал Краска Визуализация вентромедиального Hypothalamus нейроны от взрослых мышей по изучению глюкозы Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Лазерная Захват микродиссекции Drosophila Периферийные Нейроны

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Определение Митохондриальная мембранного потенциала и активных форм кислорода в Живом Крыса корковых нейронов

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Vibrodissociation нейронов из кусочков мозга грызунов по изучению синаптической передачи изображения и пресинаптические терминалы

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

Количественный анализ Synaptic пополнение бассейна пузырьков в культуре нейронов мозжечка гранул использованием FM Красители

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Выделение и культуре нейронов гиппокампа мышей от пренатального

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Генетическое изучение регенерации аксонов с искусственного взрослых нейронов ганглиев

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Напряжение чувствительные краски Запись с аксонов, дендритов и дендритных шипиков отдельных нейронов в срезах мозга

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

PHluorin изображений с метками рецепторов вставки в плазматическую мембрану в первичной культуре нейронов мыши

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Мозг Slice Биотинилирование:<em&gt; Экс Vivo</em&gt; Подход к Измерьте Регион-специфический плазменным мембранный белок с торговлей взрослых нейронов

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Изображений внутриклеточный Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Сигналы в полосатом теле астроциты от мышей помощью взрослого генетически закодированные показатели кальция