Name: methods for studying the mechanisms of action of antipsychotic drugs in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2014-02-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Arbetet stöddes av en NIH Clinical Scientist Utveckling utmärkelse K08NS002083, en Shervert Frazier Forskningsinstitut Grant, och en NARSAD Young Investigator Award till Edgar A. Buttner.

1. Developmental Delay / Leta analys: vildtyp (N2) och två Mutant (Mut1 och Mut2) Stammar testas i tre klozapin Halter i en 12-brunnar <ol><li> På dag 1, häll 2 ml NGM mediet 10 i varje brunn i en 12-brunnsplatta (varje brunn med en 2 cm diameter) och låt härda på bänken vid rumstemperatur (RT) över natten. Samma dag plocka en koloni av Escherichia coli OP50 bakterier infekterar en flaska av 50 ml LB-lösning och kultur den i en 37 ° C skakapparat vid 220 varv per minut r...

<ol>
	<li>Donohoe, D. R., Jarvis, R. A., Weeks, K., Aamodt, E. J., Dwyer, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+adaptation+in+C.+elegans+produced+by+antipsychotic+drugs+requires+serotonin+and+is+associated+with+calcium+signaling+and+calcineurin+inhibition.">Behavioral adaptation in C. elegans produced by antipsychotic drugs requires serotonin and is associated with calcium signaling and calcineurin inhibition.</a> Neurosci. Res. 64, 280-289 (2009).</li><li>Karmacharya, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clozapine+interaction+with+phosphatidyl+inositol+3-kinase+(PI3K)/insulin-signaling+pathway+in+Caenorhabditis+elegans.">Clozapine interaction with phosphatidyl inositol 3-kinase (PI3K)/insulin-signaling pathway in Caenorhabditis elegans.</a> Neuropsychopharmacology. 34, 1968-1978 (2009).</li><li>Rand, J. B., Johnson, C. D., Estein, H. F., Shakes, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Carnorhabditis elegans Modern Biological Analysis of an Organism. 48, 187-204 (1995).</li><li>Kwok, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+screen+in+C.+elegans+yields+a+new+calcium+channel+antagonist.">A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist.</a> Nature. 441, 91-95 (2006).</li><li>Wang, X., Sliwoski, G. R., Buttner, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relevance+of+Caenorhabditis+elegans+genetics+for+understanding+human+psychiatric+disease.">The relevance of Caenorhabditis elegans genetics for understanding human psychiatric disease.</a> Harv. Rev. Psychiatry. 19, 210-218 (2011).</li><li>Donohoe, D. R., Aamodt, E. J., Osborn, E., Dwyer, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antipsychotic+drugs+disrupt+normal+development+in+Caenorhabditis+elegans+via+additional+mechanisms+besides+dopamine+and+serotonin+receptors.">Antipsychotic drugs disrupt normal development in Caenorhabditis elegans via additional mechanisms besides dopamine and serotonin receptors.</a> Pharmacol. Res. 54, 361-372 (2006).</li><li>Karmacharya, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+effects+of+clozapine:+involvement+of+trace+amine+pathways+in+C.+elegans+and+M.+musculus.">Behavioral effects of clozapine: involvement of trace amine pathways in C. elegans and M. musculus.</a> Brain Res. 1393, 91-99 (2011).</li><li>Saur, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genome-Wide+RNAi+Screen+in+Caenorhabditis+elegans+Identifies+the+Nicotinic+Acetylcholine+Receptor+Subunit+ACR-7+as+an+Antipsychotic+Drug+Target.">A Genome-Wide RNAi Screen in Caenorhabditis elegans Identifies the Nicotinic Acetylcholine Receptor Subunit ACR-7 as an Antipsychotic Drug Target.</a> PLoS Genet. 9, (2013).</li><li>Avery, L., You, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> C. elegans feeding. WormBook, ed. The C. elegans Research Community, doi:10.1895/wormbook.1.150.1. , (2012).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+worm+lab:+from+culturing+worms+to+mutagenesis.">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> J Vis Exp. 47, (2011).</li><li>Lewis, J. A., Fleming, J. T., Estein, H. F., Shakes, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Carnorhabditis elegans Modern Biological Analysis of an Organism. 48, 3-29 (1995).</li><li>Davis, J. R., Li, Y., Rankin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+developmental+exposure+to+ethanol+on+Caenorhabditis+elegans.">Effects of developmental exposure to ethanol on Caenorhabditis elegans.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 32, 853-867 (2008).</li><li>Kage-Nakadai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+very+long+chain+fatty+acid+acyl-CoA+synthetase+genes,+acs-20+and+acs-22,+have+roles+in+the+cuticle+surface+barrier+in+Caenorhabditis+elegans.">Two very long chain fatty acid acyl-CoA synthetase genes, acs-20 and acs-22, have roles in the cuticle surface barrier in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 5, (2010).</li><li>Partridge, F. A., Tearle, A. W., Gravato-Nobre, M. J., Schafer, W. R., Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+glycosyltransferase+BUS-8+has+two+distinct+and+essential+roles+in+epidermal+morphogenesis.">The C. elegans glycosyltransferase BUS-8 has two distinct and essential roles in epidermal morphogenesis.</a> Dev. Biol. 317, 549-559 (2008).</li><li>Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+and+biosensing+with+fluorescent+C.+elegans+strains.">High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains.</a> J. Vis. Exp. (51), (2011).</li></ol>

Här beskriver vi metoder för att testa effekterna av APDs på utveckling och beteende hos C. elegans. DMSO eller etanol användes för att upplösa klozapin, eftersom läkemedlet är relativt olösligt i vatten. Eftersom lösningsmedel har rapporterats påverka C. elegans biologi 12, DMSO-alone eller etanol enbart kontrollgrupper är viktiga. Den högsta koncentrationen av DMSO som används i våra analyser är upp till 3%, vilket inte har någon uppenbar effekt på C. elegans-utveckli...

Caenorhabditis elegans är en enkel genetisk organism mottaglig för storskaliga framåt och bakåt genetiska skärmar och kemiska genetiska skärmar. C. elegans är känslig för ett brett spektrum av bioaktiva föreningar och har därför använts med framgång för att definiera mekanismen av handlingen av en mängd sådana föreningar. Till exempel, bioaktiva föreningar studeras med hjälp av snäckfarmakogenetik innefattar acetylkolin receptor-agonister (t.ex. levamisol, nikotin, morantel och pyrantel), bedövningsmedel (t.ex. halotan), koffein, kolinesterashämmare (t ex aldikarb, lannate och triklorfon), fluorid, GABA-relaterade föreningar (t.ex. GABA och muscimol), ivermektin, parakvat, forbolestrar och serotoninrelaterade läkemedel (t.ex. serotonin och imiprimine) 3. Vidare C. elegans har använts för stora små molekyler skärmar, vilket gör upptäckten av nya bioaktiva förenings och identifiering av nya genetiska mål 4. The C. elegans genomet innehåller potentiella antipsykotiska läkemedel (APD) mål bevarade hos människor, inklusive gener som kodar för proteiner som krävs för signalsubstansen syntes och för synaptiska struktur och funktion 5. Sålunda C. elegans Neurogenetik och neurobiologi erbjuder metoder för att upptäcka nya molekylära verkningsmekanismer av APD. I nematoder, APD exponering tidigt i utveckling ger utvecklingsförsening, och vid högre koncentrationer, dödlighet 2,6. APD exponering under vuxenlivet ger beteendemässiga fenotyper. Exempelvis hämmar klozapin exponering locomotion och svalg pumpa och förbättrar äggläggning 1,2,7. APD-inducerad utvecklingsförsening och dödlighet är kraftfulla fenotyper för storskaliga kemiska genetiska skärmar. Dessa fenotyper är komplexa i den mån de sannolikt har mer än en cell-och genetiska basier. Därför är sådana genetiska skärmar förväntas ge en mängd olika läkemedelsmål indirekt. Dock har vårt laboratorium genomfört kandidatgenen skärmar och en genomet hela RNAi skärm för dämpning av APD-inducerad utvecklingsförsening och dödlighet och har framgångsrikt återhämtat gener som sannolikt kodar direkta mål, bland annat dopamin, insulin, och nikotinacetylkolinreceptorer 2,8. Genetiska skärmar baserade på APD-inducerade beteenden i vuxen har också lett till identifiering av nya APD mål, och vi är nu validering av nya från både utvecklings-och beteende skärmar i däggdjur 7. Således verkar en ryggradslös kemisk genetisk metod för att upptäcka nya molekylära verkningsmekanismer för APDs vara genomförbart 5,8. The C. elegans svalget är ett organ som omfattar 20 neuroner, 20 muskelceller, och 20 hjälpceller, insvept av en basalmembran. I likhet med däggdjur hjärta, är svalget autonoma and pumpar ständigt mat i från den yttre miljön 9. Hämning av svalg pumphastigheten äventyrar livsmedelsupptag, och därmed mutationer eller läkemedel som hämmar svalg pumpning orsaka utvecklingsförsening eller gripa 9. APDs hämmar svalgpumphastigheten och står delvis för deras effekter på utveckling och livskraft 1,2. Här använder vi den atypiska APD klozapin som ett exempel för att påvisa drog analyser för nematod utveckling och svalg pumpning.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="406">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td>Clozapine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6305</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Acetic acid (HAC)</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP2401</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Sodium hydroxide(NaOH)</td>
			<td style="width:71px;">EMD</td>
			<td style="width:119px;">SX0590-13</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Hypochlorite</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">425044</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:236px;">Centrifuge 5810</td>
			<td style="width:188px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:200px;">5810 000.017</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:236px;">Incubator shaker</td>
			<td style="width:188px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:200px;">M1246-0006</td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:236px;">Low temperature incubator 815</td>
			<td style="width:188px;">Precision Scientific</td>
			<td style="width:200px;">J1790-1B</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:236px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:188px;">Olympus</td>
			<td style="width:200px;">SZX12</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:236px;">Petri dish 35 x 10 mm</td>
			<td style="width:188px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:200px;">NC9434271</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:236px;">12-well tissue culture plate</td>
			<td style="width:188px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:200px;">REF 353043</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for studying the mechanisms of action of antipsychotic drugs in caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans är en enkel genetisk organism mottaglig för storskaliga framåt och bakåt genetiska skärmar och kemiska genetiska skärmar. The C. elegans genomet innefattar potentiell antipsykotisk drog (APD) mål konserverade hos människor, inklusive gener som kodar för proteiner som krävs för neurotransmittersyntesen och för synaptisk struktur och funktion. APD exponering ger utvecklingsförsening och / eller dödlighet i nematoder på ett koncentrationsberoende sätt. Dessa fenotyper orsakas delvis av APD-inducerad hämning av svalg pumpa 1,2. Sålunda har utvecklings fenotyp en neuromuskulär basis, vilket gör det lämpligt för farmakogenetiska studier av neuroleptika. Här kan vi visa detaljerade förfaranden för testning APD effekter på nematod utveckling och svalg pumpning. För utvecklingsanalys, synkroniseras embryon som placeras på nematod tillväxtmedium (NGM) plattor som innehåller APDs, och de olika stadierna i utvecklingen av animals därefter görs dagligen. För analys av svalgpumphastigheten, iscensatt unga vuxna djur testas på NGM plattor innehållande APDs. Antalet pharyngeal pumpar per tidsenhet registreras och pumpningshastigheten beräknas. Dessa analyser kan användas för att studera många andra typer av små molekyler eller till och med stora molekyler.

1. Utvecklingsförsening / dödlighet analysresultat Ett typiskt resultat för analys av utvecklingsförsening / dödlighet demonstreras i figur 1a och 1b. När vildtyp djur i kontrollgruppen har vuxit till en dräktig vuxenstadiet (Figur 1a), vildtyp djur som exponerats för klozapin är fortfarande i unga larvstadier eller är döda (Figur 1b). Figur 1c visar ett representativt resultat att jämföra en suppressor mutant ...

Watch this Scientific Journal Video about Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Tillvägagångssätt för att testa effekterna av antipsykotiska läkemedel (APD) i Caenorhabditis elegans demonstreras. Analyser beskrivs för att testa läkemedelseffekter på utveckling och livskraft och på svalgpumphastighet. Dessa metoder är också tillämpliga för farmakogenetiska experiment med andra än APDs läkemedelsklasser.

Metoder för att studera verkningsmekanismerna för antipsykotiska läkemedel i<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Mus I livmodern Elektroporation: Kontrollerad Spatiotemporal Gene Transfektion

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Direkt Intraventrikulär tillförsel av läkemedel till Gnagare Centrala nervsystemet

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

ETT<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Modellsystem för Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Hela Mount immunomärkning av luktreceptor nervceller i<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenn

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

En analys för mätning av effekterna av etanol på rörelsefart av<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Agarose Microchambers för Långsiktig Kalcium Imaging av<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Nya Metrics för att karaktärisera Embryonala Förlängning av nematoden<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. ...

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

en<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Nutritionell statusbaserad koppar-aversionsanalys

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Proportionerlig kalcium avbildning av enskilda nervceller i beter sig Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans

Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans

Imaging Dendritic Spines i Caenorhabditis elegans

Dendritic spines are specialized sites of synaptic innervation modulated by activity and serve as substrates for learning and memory. Recently, dendritic ...