Name: isolation of pulmonary artery smooth muscle cells from neonatal mice
Uploaded: 2013-10-19T19:00:00
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この作品は、NIH HL109478（KNF）によってサポートされていました。著者は文化にPASMCを分離し、維持する上での支援のためにジーナキムとジョアン·テイラーを認め、感謝する。

ノースウェスタン大学の制度動物実験委員会は、このプロトコルを承認した。 1。新生児マウスから肺動脈の分離 - 一日目<ol><li> 100ミリリットル（最終濃度= 20％）、熱不活性化FBS、5ミリリットル（最終濃度= 1％）ペニシリン/ストレプトマイシンをミックス400ミリリットルM199 - 完全M199メディアを準備します。 </li><li> 5ミリリットル（最終濃度= 1％）ペニシ...

<ol>
	<li>Levin, D. L., Rudolph, A. M., Heymann, M. A., Phibbs, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+development+of+the+pulmonary+vascular+bed+in+fetal+lambs.">Morphological development of the pulmonary vascular bed in fetal lambs.</a> Circulation. 53, 144-151 (1976).</li><li>Walsh-Sukys, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+pulmonary+hypertension+of+the+newborn+in+the+era+before+nitric+oxide:+practice+variation+and+outcomes.">Persistent pulmonary hypertension of the newborn in the era before nitric oxide: practice variation and outcomes.</a> Pediatrics. 105, 14-20 (2000).</li><li>Khemani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+artery+hypertension+in+formerly+premature+infants+with+bronchopulmonary+dysplasia:+clinical+features+and+outcomes+in+the+surfactant+era.">Pulmonary artery hypertension in formerly premature infants with bronchopulmonary dysplasia: clinical features and outcomes in the surfactant era.</a> Pediatrics. 120, 1260-1269 (2007).</li><li>Jobe, A. H., Bancalari, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchopulmonary+dysplasia.">Bronchopulmonary dysplasia.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 163, 1723-1729 (2001).</li><li>Mourani, P. M., Sontag, M. K., Younoszai, A., Ivy, D. D., Abman, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+utility+of+echocardiography+for+the+diagnosis+and+management+of+pulmonary+vascular+disease+in+young+children+with+chronic+lung+disease.">Clinical utility of echocardiography for the diagnosis and management of pulmonary vascular disease in young children with chronic lung disease.</a> Pediatrics. 121, 317-325 (2008).</li><li>Check, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+growth+restriction+and+pulmonary+hypertension+in+premature+infants+with+bronchopulmonary+dysplasia.">Fetal growth restriction and pulmonary hypertension in premature infants with bronchopulmonary dysplasia.</a> J. Perinatol. , (2013).</li><li>Farrow, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperoxia+increases+phosphodiesterase+5+expression+and+activity+in+ovine+fetal+pulmonary+artery+smooth+muscle+cells.">Hyperoxia increases phosphodiesterase 5 expression and activity in ovine fetal pulmonary artery smooth muscle cells.</a> Circ. Res. 102, 226-233 (2008).</li><li>Aschner, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+nitric+oxide+synthase+gene+transfer+enhances+dilation+of+newborn+piglet+pulmonary+arteries.">Endothelial nitric oxide synthase gene transfer enhances dilation of newborn piglet pulmonary arteries.</a> Am. J. Physiol. 277, 371-379 (1999).</li><li>Cornfield, D. N., Stevens, T., McMurtry, I. F., Abman, S. H., Rodman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+hypoxia+increases+cytosolic+calcium+in+fetal+pulmonary+artery+smooth+muscle+cells.">Acute hypoxia increases cytosolic calcium in fetal pulmonary artery smooth muscle cells.</a> Am. J. Physiol. 265, 53-56 (1993).</li><li>Bailly, K., Ridley, A. J., Hall, S. M., Haworth, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RhoA+activation+by+hypoxia+in+pulmonary+arterial+smooth+muscle+cells+is+age+and+site+specific.">RhoA activation by hypoxia in pulmonary arterial smooth muscle cells is age and site specific.</a> Circ. Res. 94, 1383-1391 (2004).</li><li>Black, S. M., DeVol, J. M., Wedgwood, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+fibroblast+growth+factor-2+expression+in+pulmonary+arterial+smooth+muscle+cells+involves+increased+reactive+oxygen+species+generation.">Regulation of fibroblast growth factor-2 expression in pulmonary arterial smooth muscle cells involves increased reactive oxygen species generation.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 294, 345-354 (2008).</li><li>Cogolludo, A., Moreno, L., Lodi, F., Tamargo, J., Perez-Vizcaino, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+maturational+shift+from+PKCzeta+and+voltage-gated+K++channels+to+RhoA/Rho+kinase+in+pulmonary+vasoconstriction.">Postnatal maturational shift from PKCzeta and voltage-gated K+ channels to RhoA/Rho kinase in pulmonary vasoconstriction.</a> Cardiovasc. Res. 66, 84-93 (2005).</li><li>Wedgwood, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide+regulates+extracellular+superoxide+dismutase+activity+and+expression+in+neonatal+pulmonary+hypertension.">Hydrogen peroxide regulates extracellular superoxide dismutase activity and expression in neonatal pulmonary hypertension.</a> Antiox. Signal. 15, 1497-1506 (1089).</li><li>Farrow, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+oxidant+stress+increases+PDE5+activity+in+persistent+pulmonary+hypertension+of+the+newborn.">Mitochondrial oxidant stress increases PDE5 activity in persistent pulmonary hypertension of the newborn.</a> Respir. Physiol. Neurobiol. 174, 272-281 (2010).</li><li>Chester, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cinaciguat,+a+soluble+guanylate+cyclase+activator,+augments+cGMP+after+oxidative+stress+and+causes+pulmonary+vasodilation+in+neonatal+pulmonary+hypertension.">Cinaciguat, a soluble guanylate cyclase activator, augments cGMP after oxidative stress and causes pulmonary vasodilation in neonatal pulmonary hypertension.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 301, 755-764 (2011).</li><li>Konduri, G. G., Bakhutashvili, I., Eis, A., Gauthier, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+voltage+gated+potassium+channel+responses+in+a+fetal+lamb+model+of+persistent+pulmonary+hypertension+of+the+newborn.">Impaired voltage gated potassium channel responses in a fetal lamb model of persistent pulmonary hypertension of the newborn.</a> Pediatr. Res. 66, 289-294 (2009).</li><li>Olschewski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+the+K(Ca)+channel+to+membrane+potential+and+O2+sensitivity+is+decreased+in+an+ovine+PPHN+model.">Contribution of the K(Ca) channel to membrane potential and O2 sensitivity is decreased in an ovine PPHN model.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, L1103-L1109 (2002).</li><li>Aslam, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+stromal+cells+attenuate+lung+injury+in+a+murine+model+of+neonatal+chronic+lung+disease.">Bone marrow stromal cells attenuate lung injury in a murine model of neonatal chronic lung disease.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 180, 1122-1130 (2009).</li><li>Balasubramaniam, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow-derived+angiogenic+cells+restore+lung+alveolar+and+vascular+structure+after+neonatal+hyperoxia+in+infant+mice.">Bone marrow-derived angiogenic cells restore lung alveolar and vascular structure after neonatal hyperoxia in infant mice.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 298, L315-L323 (2010).</li><li>de Visser, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphodiesterase-4+inhibition+attenuates+pulmonary+inflammation+in+neonatal+lung+injury.">Phosphodiesterase-4 inhibition attenuates pulmonary inflammation in neonatal lung injury.</a> Eur. Respir. J. 31, 633-644 (2008).</li><li>de Visser, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sildenafil+attenuates+pulmonary+inflammation+and+fibrin+deposition,+mortality+and+right+ventricular+hypertrophy+in+neonatal+hyperoxic+lung+injury.">Sildenafil attenuates pulmonary inflammation and fibrin deposition, mortality and right ventricular hypertrophy in neonatal hyperoxic lung injury.</a> Respir. 10, 30 (2009).</li><li>Ladha, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sildenafil+improves+alveolar+growth+and+pulmonary+hypertension+in+hyperoxia-induced+lung+injury.">Sildenafil improves alveolar growth and pulmonary hypertension in hyperoxia-induced lung injury.</a> Am. Respir. Crit. Care Med. 172, 750-756 (2005).</li><li>Farrow, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+hyperoxia+increases+mitochondrial+oxidation+and+increases+phosphodiesterase+5+activity+in+fetal+pulmonary+artery+smooth+muscle+cells.">Brief hyperoxia increases mitochondrial oxidation and increases phosphodiesterase 5 activity in fetal pulmonary artery smooth muscle cells.</a> Antioxid. Redox Signal. 17, 460-470 (2012).</li><li>Waypa, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+triggers+subcellular+compartmental+redox+signaling+in+vascular+smooth+muscle+cells.">Hypoxia triggers subcellular compartmental redox signaling in vascular smooth muscle cells.</a> Circ. Res. 106, 526-535 (2010).</li><li>Waypa, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+Generated+at+Mitochondrial+Complex+III+Triggers+Acute+Responses+to+Hypoxia+in+the+Pulmonary+Circulation.">Superoxide Generated at Mitochondrial Complex III Triggers Acute Responses to Hypoxia in the Pulmonary Circulation.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 187, 424-432 (2013).</li><li>Marshall, C., Mamary, A. J., Verhoeven, A. J., Marshall, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+artery+NADPH-oxidase+is+activated+in+hypoxic+pulmonary+vasoconstriction.">Pulmonary artery NADPH-oxidase is activated in hypoxic pulmonary vasoconstriction.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15, 633-644 (1996).</li><li>Farrow, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+Dismutase+and+Inhaled+Nitric+Oxide+Normalize+Phosphodiesterase+5+Expression+and+Activity+in+Neonatal+Lambs+with+Persistent+Pulmonary+Hypertension.">Superoxide Dismutase and Inhaled Nitric Oxide Normalize Phosphodiesterase 5 Expression and Activity in Neonatal Lambs with Persistent Pulmonary Hypertension.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 299, L109-L116 (2010).</li></ol>

本稿では、我々は初めてP7、P14、およびP21でマウスからPASMCの単離のため説明しています。これを達成するために、アガロースおよび0.2μMの鉄粒子のスラリーをPAにRVを介して注入される。鉄粒子のサイズが小さいので、彼らは、肺毛細血管床を通過することができず、従って、小さなPAに堆積される。肺は、膨張削除と解離している。鉄含有容器は、磁石を用いて溶液から引き出されている。...

胎盤は、ガス交換の主要な器官として機能し、心拍出量の10％だけが、肺血管床を通って循環されるため、肺高血圧症は、子宮内の生命の間に正常な動作です。 子宮内では 、肺の圧力が上昇し、肺血管抵抗が原因で全身の圧力に類似しています。妊娠が進行するにつれて、肺内の小さなPAの急速な成長は、出生1で生じる肺血流量の劇的な増加のために胎児の調製がある。通常の周産期の移行は短期的とフル期産児に失敗した場合、結果は（PPHN）新生児遷延性肺高血圧症である。 PPHNは、さまざまな基本的な病態に起因する臨床的な症候群である。しかし、これらの乳児のすべてがこのような高められた肺血管抵抗、低酸素血症、動脈管開存症などのような永続的な接続の間または胎児のために血流の右から左への短絡などの一般的な病態生理学的特徴を共有卵円アーメン。 PPHNは出生1,000人あたり2-6に影響を与え、死亡率と同様に重要な短期および長期罹患2の8〜10％のリスクを伝える。さらに、超低出生体重未熟児は、その基礎となる肺疾患の結果として肺高血圧を開発することがあります。未熟児の最も一般的な基本的な肺疾患は、気管支肺異形成症（BPD）です。 BPDの全体的なリスクは、在胎週数と出生体重と相関しながら、これらの乳幼児のサブセットが著しい肺高血圧症を開発し、どのように適切にこれらの乳児を治療する理由、それは不明である。長引く入院や死亡率の増加など、悪い結果は、3-6一般的です。 歴史的には、健康な動物からヒツジ胎児PASMC又はブタ胎児PASMCは出産後に正常肺血管転移に関与するシグナル伝達経路を研究するために使用されている。これらは、典型的には、第五世代の抵抗PAから分離されnのヒツジまたは任意の自発呼吸7-9前に配信され、安楽死させているブタ胎児。さらに、いくつかの研究者が単離され、少し古いからPASMC利用と自発的に3日間、2週間と4週間10-12で子羊や子豚を呼吸している。最近では、いくつかのグループが成功した疾患状態13-17でシグナル伝達経路で撹乱を検討するPPHNと子羊から分離PASMCを分離し、利用してきた。これらの細胞は、シグナル伝達経路は正常と病気の短期的および長期的肺血管系の両方で非常に重要である検討する貴重なツールであることが証明されている。しかし、彼らは、肺高血圧症の未熟児に影響するシグナル伝達経路への洞察を与えることはありません。また彼らは、疾患のマウスモデルに見られる遺伝子操作の可能性を可能にするない。 ラットおよびマウスモデル長いモデルBPDに使用されており、さらに最近で肺HYをモデル化するために使用されているBPD 18-22起因pertension。新生児ラットは彼らの大きなサイズに起因すると動作するように誘導されているが、彼らはまた、遺伝子組み換えの可能性の欠如に苦しんでいます。遺伝的に改変された動物は、広く新生児マウスにおける全体の動物生理学上の特定の遺伝子標的の効果を調査するために、誰が以前に正常にこれらの小さなマウスから単離されていないPASMC今日まで用いられてきた。 PASMCを単離することにより、より大きな情報が経路が環境刺激および/または肺動脈平滑筋特異的遺伝子改変に応じてどのように変化するかについて得ることができる。さらに、ライブPASMCは、カルシウムと活性酸素種23-25 ​​などの主要シグナル伝達分子の急速な変化を調べるために、リアルタイムで画像化することができる。我々は、最近、マーシャルらの手法のバリエーションを用いて成体マウスからPASMCの正常な単離を記載している。26は、ラットPASMC 23,25,26を単離するために用いられる。我々は今、適応しているndは7-21日齢の小さなマウス（P7、P14、およびP21）にこの手法を拡張した。この新しいPASMC分離技術の主な制約は、それが実験のために十分な細胞を作製するために複数のマウスを必要とする細胞は、一次平滑筋細胞の特徴である、非常にゆっくりと成長することである。これらの制限にもかかわらず、我々は新生児マウスPASMCを分離するために、この手法は肺高血圧症の発症に関与する重要なシグナル伝達経路の強化された調査を可能にし、この分野で飛躍的な進歩を表していると考えています。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bard Parker surgical blade handle</td>
			<td>BD</td>
			<td>371030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel surgical blades #10 (sterile)</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>4-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (3 ml and 5 ml, sterile)</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657 and 306646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (27 G, sterile)</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angiocatheter (24 G, sterile)</td>
			<td>BD</td>
			<td>381412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoject blunt cannula (15 G)</td>
			<td>Kendall</td>
			<td>SWD202314Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutures</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9782896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynal magnet particle collector</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>120-01D</td>
			<td>This is a critical tool for the protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates (35 mm, 60 mm, and 10 cm, sterile)</td>
			<td>BD</td>
			<td>353001, 353004, and 353003</td>
			<td>Any brand of tissue culture plates will be fine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors (4 &#189; inch stainless steel)</td>
			<td>American Diagnostic Corporation</td>
			<td>3424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (4 inch stainless steel)</td>
			<td>Quick Medical</td>
			<td>L5-5004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M199 media</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>10-060-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>TX16777-164NWU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone/Thermo Scientific</td>
			<td>SH3091003</td>
			<td>Heat inactivate at 55 &#176;C for 45 min. For consistency in results, lot match all serum and obtain from same vendor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron particles (iron (II, III) oxide powder)</td>
			<td>Aldrich Chemical Company</td>
			<td>#31,006-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase (made to 80 U/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Butlet Schein</td>
			<td>NDC 11695-6776-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse TE2000-U with a Cascade Photometrics 12-bit camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE2000-U</td>
			<td>Any good light microscope will be fine to observe PASMC in culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-desmin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-8281</td>
			<td>Use at 1:200 dilution for immunostaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-smooth muscle myosin</td>
			<td>Biomedical Technologies</td>
			<td>BT-562</td>
			<td>Use at 1:2,000 dilution for immunostaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine-red anti-rabbit secondary</td>
			<td>Molecular Probes/Invitrogen</td>
			<td>R-6394</td>
			<td>Use at 1:200 dilution for immunostaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse TE-300 fluorescent microscope and Cool Snap digital camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE300</td>
			<td>Any good epifluorescence microscope will be fine for immunostaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclic nucleotide phosphodiesterase assay kit</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-AK800-0001</td>
			<td>This is the only colorimetric PDE enzyme activity assay available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sildenafil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PZ-0003</td>
			<td>A PDE5-selective inhibitor is required for the PDE enzyme activity to determine specificity of cGMP hydrolysis.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of pulmonary artery smooth muscle cells from neonatal mice

肺高血圧症は、罹患率と乳児死亡の重要な原因である。歴史的には、胎児の羊からPASMCにおける血管平滑筋の収縮に関わるシグナル伝達経路の重要な研究があった。羊用語肺高血圧症の優れたモデルを作るが、それらは非常に高価であり、マウスに見られる遺伝子操作の利点を欠いている。逆に、マウスからPASMCを分離することができないことは、そのシステムの重要な制限だった。ここでは、マーシャルらの前述の手法のバリエーションを用いP7、P14、P21及びマウスからマウスPASMCの初代培養物の単離を記載している。26は、予めラットPASMCを単離するために使用された。これらのネズミPASMCは新生児期にシグナル伝達経路の研究のための新規ツールを表しています。簡潔には、0.5％（w / v）のアガロース+ 0.5％鉄粒子M199培地中のスラリーは、右心室（RV）を介して、肺血管床に注入される。ザ鉄粒子は、直径が0.2μMであり、肺毛細血管床を通過することができない。したがって、小肺動脈（PA）の鉄のロッジ。肺は削除され、解離アガロースで膨張している。鉄含有容器は磁石でプルダウンされています。コラゲナーゼ（80 U / ml）で処理し、さらに解離した後、容器は、培養皿の上に細胞移動を可能にするために、20％ウシ胎児血清（FBS）および抗生物質（M199完全培地）を含むM199培地中で組織培養皿に入れられ。細胞のこの最初のプレートは、線維芽細胞およびPASMCの50-50混合物である。したがって、手順​​プルダウンはより純粋PASMC集団を実現し、任意の残留鉄を除去するために複数回繰り返される。平滑筋細胞のアイデンティティは、平滑筋ミオシンとデスミンの免疫染色によって確認された。

分離中および後の、PASMCを光学顕微鏡によりおよび平滑筋細胞マーカーの免疫染色の両方によって調べられます。初期のプロトコルにおける光学顕微鏡により、PASMCは血管を（ 図1A）を含む小鉄からの組織培養皿上に移行が見られる。それらは、最終プーリング段階で引き出されているように日に13上の3つを通じてプレートを1つをプールした後、その後、鉄粒子はもはや見られな...

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Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

我々は、それによって新生児の平滑筋細胞の収縮と弛緩に関与するシグナル伝達経路のより良好な研究を可能にする、新規かつP7の幼いマウスからの肺動脈平滑筋細胞の初代培養物（PASMC）を単離するための再現可能な技術を開発した。

新生児マウスから肺動脈平滑筋細胞の単離

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Research

JoVE Journal

Biology

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

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焦点のCa 2 +</sup平滑筋の>過渡検出

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生物学

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ヒト臍帯動脈平滑筋細胞の単離（HUASMC）

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Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

筋衛星細胞の単離、培養、および移植

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

ネズミ弁内皮細胞の単離

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

マウス冠動脈血管平滑筋細胞の単離

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Induction of Right Ventricular Failure by Pulmonary Artery Constriction and Evaluation of Right Ventricular Function in Mice

肺動脈収縮による右心室障害の誘導とマウスにおける右心室機能の評価

The mechanism of right ventricular failure (RVF) requires clarification due to the uniqueness, high morbidity, high mortality, and refractory nature of ...

Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry

クリック化学を用いた血管平滑筋細胞の増殖測定

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease ...