Name: quantitative assessment of human neutrophil migration across a cultured bladder epithelium
Uploaded: 2013-11-07T19:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) מענקי R01-DK080752 וP50-DK064540. אנו מודים לג&#39; Loughman על מאמציה בהקמת assay זה.

1. Culturing 5637 תאי אפיתל שלפוחית ​​השתן בצע את השלבים הבאים במכסת מנוע רקמות תרבות זרימה למינרית מוכנה עם קרינת UV וניגב את עם 70% אתנול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המדיום RPMI-1640 מכיל 10% בסרום שור העובר (FBS) [+ RP...

<ol>
	<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orientation+chamber+in+chemotaxis.">Orientation chamber in chemotaxis.</a> Methods Enzymol. 162, 65-72 (1988).</li><li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber.">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> J. Cell Sci. 99 (Pt. 4), 769-775 (1991).</li><li>Chin, A. C., Parkos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathobiology+of+neutrophil+transepithelial+migration:+implications+in+mediating+epithelial+injury.">Pathobiology of neutrophil transepithelial migration: implications in mediating epithelial injury.</a> Annu. Rev. Pathol. 2, 111-143 (2007).</li><li>Zemans, R. L., Colgan, S. P., Downey, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transepithelial+migration+of+neutrophils:+mechanisms+and+implications+for+acute+lung+injury.">Transepithelial migration of neutrophils: mechanisms and implications for acute lung injury.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 40, 519-535 (2009).</li><li>Loughman, J. A., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+human+neutrophil+migration+and+function+by+uropathogenic+bacteria.">Attenuation of human neutrophil migration and function by uropathogenic bacteria.</a> Microbes Infect. 13, 555-565 (2011).</li><li>Lau, M. E., Loughman, J. A., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YbcL+of+uropathogenic+Escherichia+coli+suppresses+transepithelial+neutrophil+migration.">YbcL of uropathogenic Escherichia coli suppresses transepithelial neutrophil migration.</a> Infect. Immun. 80, 4123-4132 (2012).</li><li>Loughman, J. A., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+indoleamine+2,3-dioxygenase+by+uropathogenic+bacteria+attenuates+innate+responses+to+epithelial+infection.">Induction of indoleamine 2,3-dioxygenase by uropathogenic bacteria attenuates innate responses to epithelial infection.</a> J. Infect. Dis. 205, 1830-1839 (2012).</li><li>Foxman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+urinary+tract+infection.">The epidemiology of urinary tract infection.</a> Nat. Rev. Urol. 7, 653-660 (1038).</li><li>Haraoka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+recruitment+and+resistance+to+urinary+tract+infection.">Neutrophil recruitment and resistance to urinary tract infection.</a> J. Infect. Dis. 180, 1220-1229 (1999).</li><li>Billips, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+host+innate+immune+response+in+the+bladder+by+uropathogenic+Escherichia+coli.">Modulation of host innate immune response in the bladder by uropathogenic Escherichia coli.</a> Infect. Immun. 75, 5353-5360 (2007).</li><li>Bozeman, P. M., Learn, D. B., Thomas, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+the+human+leukocyte+enzymes+myeloperoxidase+and+eosinophil+peroxidase.">Assay of the human leukocyte enzymes myeloperoxidase and eosinophil peroxidase.</a> J. Immunol. Methods. 126, 125-133 (1990).</li><li>Lee, W. Y., Chin, A. C., Voss, S., Parkos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+neutrophil+transepithelial+migration.">In vitro neutrophil transepithelial migration.</a> Methods Mol. Biol. 341, 205-215 (2006).</li><li>S&#228;ve, S., Mohlin, C., Vumma, R., Persson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+adenosine+A2A+receptors+inhibits+neutrophil+transuroepithelial+migration.">Activation of adenosine A2A receptors inhibits neutrophil transuroepithelial migration.</a> Infect. Immun. 79, 3431-3437 (2011).</li><li>Agace, W. W., Patarroyo, M., Svensson, M., Carlemalm, E., Svanborg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+induces+transuroepithelial+neutrophil+migration+by+an+intercellular+adhesion+molecule-1-dependent+mechanism.">Escherichia coli induces transuroepithelial neutrophil migration by an intercellular adhesion molecule-1-dependent mechanism.</a> Infect. Immun. 63, 4054-4062 (1995).</li><li>Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+urinary+tract+infection.">A murine model of urinary tract infection.</a> Nat. Protoc. 4, 1230-1243 (2009).</li></ol>

באמצעות קו תרבותי אפיתל שלפוחית ​​תא וPMN אדם המבודד טרי, הקמנו מודל במבחנה של הגירת נויטרופילים transuroepithelial. מודל זה כבר סייע במתחיל לנתח את המורכבות של התגובה החיסונית המולדת בדלקת בדרכי שתן (UTI), זיהום חיידקים נפוץ מאוד שנגרם בדרך כלל על ידי 9 UPEC. במהלך הזיה?...

התנועה של תאים בכל הגוף, לעתים קרובות על פני מרחקים ארוכים, נדרשת לצמיחה והתפתחות, ריפוי פצעים, ותגובה חיסונית. נדידת תאים היא מורכבת ודורשת התיאום של תהליכים רבים ושונים, כוללים מפלי איתות והסידור מחדש של רכיבי cytoskeletal. תאים יכולים לנוע באופן אקראי (chemokinesis), כמו גם לכיוון הדרגתיים מוגדר כימי (chemotaxis). טכניקות רבות פותחו ללמוד נדידת תאים במבחנה. הטכניקה העתיקה ביותר והנפוצה ביותר, קאמרי בוידן, מורכב ממערכת שתי קאמרית אנכית שבו חומר chemoattractant ממוקם בתא והתאים של עניין התחתון ממוקמות בתא העליון 1. התנועה של תאים על פני המסנן החדיר, עם נקבוביות בגודל מוגדר, בין שני התאים היא תחת פיקוח. טכניקות נוספות פותחו כדי לחקור את נדידת תאים, כוללים תא זיגמונד 2 וקאמרי דאן3. גישות קולקטיביות אלו הניבו תובנה משמעותית לתנועה של תאים מסוגים רבים ושונים. בנוסף לחקירה את העקרונות הבסיסיים של chemokinesis וchemotaxis, מבחני שני קאמריים הקלו החקירה של נדידת תאים באמצעות רכיבי מטריצה ​​תאיים ושני שכבות תאי אנדותל ואפיתל. יתרון של מערכות שתי קאמריות על פני שיטות אחרות הוא שהקרום הנקבובי יכול להיות מצופה עם חלבונים כגון קולגן או פיברינוגן, ונדידת תאים על פני מחסום כמו מטריקס-תאי ניתן להעריך. בנוסף, ניתן לגדל שורות תאים בתרבית ומובחנות על תומך החדיר. כדי לחקור את התנועה של תאים על פני מכשול אנדותל, תאי אנדותל בתרבית הם זורעים וגדלו במאגר העליון של תומך החדיר. תאי ניעתי, כגון תאים חיסוניים, מתווספים למאגר וההגירה העליונים למאגר התחתון ברחבי enמחסום dothelial בכיוון הקודקוד לbasolateral הפיזיולוגי הוא ציין. מודל זה כבר לא יסולא בפז בהבנת extravasation של תאים חיסוניים מחוץ לזרם הדם. בניגוד לtransendothelial הגירה, התנועה של תאים על פני מחסום האפיתל מתרחשת בדרך כלל בכיוון basolateral לפסגה. על מנת לבנות מודל אירועים אלה במבחנה, חוקרי הזרעים ולגדל תאי אפיתל בתרבית בחלק התחתון של תומך החדיר. תאי ניעתי מתווספים למאגר העליון וההגירה על פני מחסום אפיתל, המייצג את כיוון basolateral לפסגה, הוא תחת פיקוח. מודלים כאלה של הגירת transepithelial תרמו באופן משמעותי להבנה של תגובות דלקתיות במשטחים הריריים, במיוחד אלו של הריאות ובטן 4,5 שלנו. בניגוד לכך, סחר בתא חיסון דרך האפיתל של דרכי השתן זכה להרבה פחות תשומת לב. כדי לקדם את understanding של תגובות חיסוניים מולדים בדרכי השתן במהלך זיהום בחיידקי Escherichia uropathogenic (UPEC), פיתחנו assay במבחנה, assay הגירת נויטרופילים transuroepithelial, המאפשר חקירה של ויקוציטים polymorphonuclear (PMN; נויטרופילים) תנועה על פני מחסום האפיתל בשלפוחית ​​השתן 6 -8. כמו בדגמים שני קאמריים אחרים של הגירת transepithelial, תאי שלפוחית ​​השתן אנושיים בתרבית האפיתל גדלים על החלק התחתון של תמיכה חדירה ויוצרים שכבות אפיתל ומחוברות. נויטרופילים אנושיים, מבודדים מהדם ורידים, מוחלים על צד basolateral של שכבת האפיתל, והגירה על פני האפיתל בכיוון basolateral לפסגה הרלוונטי מבחינה פיזיולוגית היא לכמת בתגובה לזיהום עם זנים שונים של א coli או הנוכחות של מולקולות chemoattractant. מחקרים רבים שהתמקדו בתנועת נויטרופילים, שניהם chemokinesis וchemotaxis, בהעדר סוגים נוספים של תאים. Assay הגירת נויטרופילים transuroepithelial הוא יתרון כפי שהוא לוקח בחשבון את יחסי גומלין מורכבים בין תאי אפיתל שלפוחית ​​השתן ותאי מערכת החיסון בזיהום. יש מודל צייתן זה במבחנה את הפוטנציאל כדי לאפשר את החקירה מפורטת של תגובות חיסוניים במשטחי uroepithelial.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell Inserts (i.e.&#160;permeable supports)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3472</td>
			<td>6.5 mm, 3 &#956;m pore, polyester membrane insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Blood Collection Tubes</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>366480</td>
			<td>16 mm x 100 mm x 10 ml green cap tubes containing sodium heparin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Safety-Lok Blood Collection and Infusion Set</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>367281</td>
			<td>21 G x 0.75 in needle x 12 in tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer one-use, nonstackable holder</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>364815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4876</td>
			<td>From Leuconostoc mesenteroides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS density centrifugation solution</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3473</td>
			<td>24-well, clear flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3506</td>
			<td>Reconstituted in DMSO to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human CXCL8/IL-8</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>208-IL</td>
			<td>Reconstituted in PBS to 100 &#956;g/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative assessment of human neutrophil migration across a cultured bladder epithelium

הגיוס של תאי מערכת החיסון מהפריפריה לאתר של דלקת הוא צעד חיוני בתגובה החיסונית המולדת בכל משטח הרירי. במהלך הזיהום של שלפוחית ​​השתן, כדוריות דם לבנות polymorphonuclear (PMN; נויטרופילים) נודדים ממחזור הדם ולעבור את אפיתל שלפוחית ​​השתן. כישלון לפתור את הזיהום בהעדר תגובת neutrophilic מדגים את החשיבות של PMN בהגנה על שלפוחית ​​השתן. כדי להקל על קולוניזציה של אפיתל שלפוחית ​​השתן, Escherichia coli uropathogenic (UPEC), הסוכן סיבתי של רוב הדלקות בדרכי שתן (זיהומים בדרכי השתן), לדכא את התגובה הדלקתית חריפה באמצעות מגוון של מנגנונים שהוגדרו באופן חלקי. כדי לחקור את יחסי הגומלין בין המארח ופתוגן חיידקים נוסף, פיתחנו מודל במבחנה של היבט זה של התגובה החיסונית המולדת לUPEC. ב assay הגירת נויטרופילים transuroepithelial, וריאציה על חדר בוידן, epith שלפוחית ​​השתן בתרביתתאי elial גדלים למפגש בחלק התחתון של תמיכה חדירה. PMN מבודדים מהדם ורידי אדם ומוחל על צד basolateral של שכבות תאי אפיתל שלפוחית ​​השתן. הגירת PMN המייצגת את כיוון basolateral לפסגה רלוונטי מבחינה פיזיולוגית בתגובה לזיהום חיידקים או מולקולות chemoattractant נפקדת באמצעות hemocytometer. מודל זה יכול לשמש כדי לחקור אינטראקציות בין UPEC ותאי אוקריוטים כמו גם לחקור את הדרישות מולקולריות לחציית האפיתלים שלפוחית ​​השתן על ידי PMN. מודל נדידת נויטרופילים transuroepithelial יהיה לקדם את ההבנה של התגובה הדלקתית הראשונית לUPEC בשלפוחית ​​השתן שלנו.

Assay הגירת נויטרופילים transuroepithelial מאפשר הערכה כמותית של הגירת PMN האנושי על פני שכבות תאי אפיתל שלפוחית ​​השתן בתרבית בתגובה לגירויים שונים (איור 1). בעוד הפרוטוקול הוא פשוט, יש מספר משתנה שיכול להשפיע על הגירת PMN וכתוצאה מכך משפיעה על שחזור של assay זה. יש לנקוט אמ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium at JoVE.com

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

פיתחנו מודל במבחנה המחקה מרכיב חשוב בתגובה הדלקתית החריף במהלך הזיהום של שלפוחית ​​השתן עם חיידקי Escherichia uropathogenic. Assay הגירת נויטרופילים transuroepithelial מאפשר הערכה כמותית של הגירת נויטרופילים אנושיים על פני epithelia שלפוחית ​​השתן, בתרבית על תומך חדיר, בתגובה לזיהום חיידקים או חומרי chemoattractant.

הערכה כמותית של אדם נויטרופילים הגירה מעבר מתורבת שלפוחית ​​השתן האפיתל

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

הרחבה, טיהור, והערכה תפקודית של האדם תאים דם היקפיים NK

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

מעקב זחילה Intraluminal נויטרופילים, הגירה Chemotaxis Transendothelial ועל רקמות על ידי מיקרוסקופית וידאו Intravital

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

הערכה כמותית של נדידת תאים על ידי Assay כושר תנועת המסלול Phagokinetic

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

כמותי<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay כדי למדוד הידבקות נויטרופילים לתאים מופעלים עיקריים אדם אנדותל כלי הדם בתנאים סטטיים

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

במבחנה Coculture Assay כדי להעריך פתוגן המושרה נדידת נויטרופילים טרנס אפיתל

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

אדם נויטרופילים תזרים לשכת הידבקות Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

פיתוח זיהוי של subpopulation רומן של אדם נויטרופילים הנגזר הענק Phagocytes<em&gt; במבחנה</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

במבחנה מבנה הכלבי נויטרופילים מלכודת חוץ-תאית: דינמי וניתוח כמותי על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System

הערכה של הגירה לימפוציט במערכת הגירה לשעבר של Vivo

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex ...

Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model

הערכה תפקודית של חלחיליות מעיים ונדידה טרנס-אפיתלית נויטרופילית בעכברים באמצעות מודל לולאת מעיים מתוקננת

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water ...

הערכה כמותית של אדם נויטרופילים הגירה מעבר מתורבת שלפוחית ​​השתן האפיתל

הערכה כמותית של אדם נויטרופילים הגירה מעבר מתורבת שלפוחית השתן האפיתל