Name: quantitative assessment of human neutrophil migration across a cultured bladder epithelium
Uploaded: 2013-11-07T19:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) gir R01-DK080752 og P50-DK064540. Vi takker J. Loughman for hennes innsats i å etablere denne analysen.

En. Dyrkning 5637 Blære Epitelceller Utfør følgende trinn i en laminær vev-kultur hette forberedt med UV-bestråling og tørkes ned med 70% etanol. <ol><li> Forbered RPMI-1640 medium inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) [betegnet RPMI +], filtersteriliser ved hjelp av et 0,22 mikrometer porestørrelse filter, og varm til 37 ° C i et vannbad. </li><li> Tin en cryovial av 5637-celler (American Type Culture Collection HTB-9; avledet fra blære karsinom) i et 37 ° C vannbad. Raskt...

<ol>
	<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orientation+chamber+in+chemotaxis.">Orientation chamber in chemotaxis.</a> Methods Enzymol. 162, 65-72 (1988).</li><li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber.">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> J. Cell Sci. 99 (Pt. 4), 769-775 (1991).</li><li>Chin, A. C., Parkos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathobiology+of+neutrophil+transepithelial+migration:+implications+in+mediating+epithelial+injury.">Pathobiology of neutrophil transepithelial migration: implications in mediating epithelial injury.</a> Annu. Rev. Pathol. 2, 111-143 (2007).</li><li>Zemans, R. L., Colgan, S. P., Downey, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transepithelial+migration+of+neutrophils:+mechanisms+and+implications+for+acute+lung+injury.">Transepithelial migration of neutrophils: mechanisms and implications for acute lung injury.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 40, 519-535 (2009).</li><li>Loughman, J. A., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+human+neutrophil+migration+and+function+by+uropathogenic+bacteria.">Attenuation of human neutrophil migration and function by uropathogenic bacteria.</a> Microbes Infect. 13, 555-565 (2011).</li><li>Lau, M. E., Loughman, J. A., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YbcL+of+uropathogenic+Escherichia+coli+suppresses+transepithelial+neutrophil+migration.">YbcL of uropathogenic Escherichia coli suppresses transepithelial neutrophil migration.</a> Infect. Immun. 80, 4123-4132 (2012).</li><li>Loughman, J. A., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+indoleamine+2,3-dioxygenase+by+uropathogenic+bacteria+attenuates+innate+responses+to+epithelial+infection.">Induction of indoleamine 2,3-dioxygenase by uropathogenic bacteria attenuates innate responses to epithelial infection.</a> J. Infect. Dis. 205, 1830-1839 (2012).</li><li>Foxman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+urinary+tract+infection.">The epidemiology of urinary tract infection.</a> Nat. Rev. Urol. 7, 653-660 (1038).</li><li>Haraoka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+recruitment+and+resistance+to+urinary+tract+infection.">Neutrophil recruitment and resistance to urinary tract infection.</a> J. Infect. Dis. 180, 1220-1229 (1999).</li><li>Billips, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+host+innate+immune+response+in+the+bladder+by+uropathogenic+Escherichia+coli.">Modulation of host innate immune response in the bladder by uropathogenic Escherichia coli.</a> Infect. Immun. 75, 5353-5360 (2007).</li><li>Bozeman, P. M., Learn, D. B., Thomas, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+the+human+leukocyte+enzymes+myeloperoxidase+and+eosinophil+peroxidase.">Assay of the human leukocyte enzymes myeloperoxidase and eosinophil peroxidase.</a> J. Immunol. Methods. 126, 125-133 (1990).</li><li>Lee, W. Y., Chin, A. C., Voss, S., Parkos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+neutrophil+transepithelial+migration.">In vitro neutrophil transepithelial migration.</a> Methods Mol. Biol. 341, 205-215 (2006).</li><li>S&#228;ve, S., Mohlin, C., Vumma, R., Persson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+adenosine+A2A+receptors+inhibits+neutrophil+transuroepithelial+migration.">Activation of adenosine A2A receptors inhibits neutrophil transuroepithelial migration.</a> Infect. Immun. 79, 3431-3437 (2011).</li><li>Agace, W. W., Patarroyo, M., Svensson, M., Carlemalm, E., Svanborg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+induces+transuroepithelial+neutrophil+migration+by+an+intercellular+adhesion+molecule-1-dependent+mechanism.">Escherichia coli induces transuroepithelial neutrophil migration by an intercellular adhesion molecule-1-dependent mechanism.</a> Infect. Immun. 63, 4054-4062 (1995).</li><li>Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+urinary+tract+infection.">A murine model of urinary tract infection.</a> Nat. Protoc. 4, 1230-1243 (2009).</li></ol>

Ved hjelp av en kultivert blære epitelial cellelinje og fersk isolert human PMN, etablerte vi en in vitro modell av transuroepithelial nøytrofile migrasjon. Denne modellen har vært instrumental i ferd med å dissekere kompleksiteten i det medfødte immunrespons under urinveisinfeksjon (UVI), en svært vanlig bakteriell infeksjon vanligvis forårsaket av UPEC ni. Ved infeksjon av blæren, eller cystitt, er avgjørende for bakteriell klaring 10 rekruttering av PMN til blæren lumen. Å et...

Bevegelsen av celler i hele kroppen, ofte over lange avstander, er nødvendig for vekst og utvikling, sårheling og immunrespons. Celle migrasjon er komplekse og krever samordning av mange ulike prosesser, herunder signal kaskader og omorganisering av cytoskeletal komponenter. Celler kan flytte tilfeldig (chemokinesis) samt mot definerte kjemiske gradienter (kjemotaksis). Mange teknikker har blitt utviklet for å studere cellemigrering in vitro. Den eldste og mest vanlige teknikk, Boyden kammer, består av en vertikal to-kammersystem hvor en kjemoattraktant substans er plassert i bunnkammeret og celler av interesse er plassert i den øverste kammeret 1. Bevegelsen av cellene på tvers av gjennomtrengelige filter med porer av definert størrelse, separering av de to kamre er overvåket. Andre teknikker har blitt utviklet for å undersøke cellemigrasjon, inkludert Zigmond kammeret 2 og Dunn kammeretTre. Disse kollektive tilnærminger har gitt betydelig innsikt i bevegelsen av mange forskjellige celletyper. I tillegg til å avhøre de grunnleggende prinsippene for chemokinesis og kjemotaksis, har to-kammer analyser tilrettelagt etterforskningen av cellemigrasjon gjennom ekstracellulære matrix komponenter og både endothelial og epiteliale cellelagene. En fordel med to-kammer-systemer i forhold til andre teknikker, er at den porøse membran kan være belagt med proteiner som kollagen og fibrinogen, og cellemigrasjon på tvers av en ekstracellulær matriks-lignende barriere kan vurderes. I tillegg kan dyrkede cellelinjer dyrkes og differensieres på permeable støtter. For å undersøke bevegelsen av cellene over en endotelisk barriere, er dyrkede endoteliale celler utsådd og dyrket i det øvre reservoar av de gjennomtrengelige bærere. Bevegelige celler, slik som immunceller, tilsettes til det øvre reservoar, og migrering inn i det nedre reservoar over endothelial barriere i den fysiologiske apikal-til-basolateral retning er observert. Denne modellen har vært uvurderlig i å forstå bloduttredelse av immunceller ut av blodet. I motsetning til transendothelial migrasjon, bevegelse av cellene over en epitelial barrieren oppstår typisk i basolateral-til-apikal retning. For å modellere slike hendelser in vitro, forskere frø og vokse dyrkede epitelceller på undersiden av den gjennomtrengelige bærere. Motile celler blir tilsatt til det øvre reservoar, og migreringen tvers av epiteliale barriere, som representerer den basolateral-til-apikal retning, blir overvåket. Slike modeller av transepithelial migrasjon har bidratt vesentlig til vår forståelse av betennelsesreaksjoner på slimhinner, spesielt de av lunge og gut 4,5. I kontrast, har immunceller menneskehandel gjennom epitelet i urinveiene fått mye mindre oppmerksomhet. For å videreutvikle vår understanding av medfødte immunresponser i urinveiene under infeksjon med uropathogenic Escherichia coli (UPEC), utviklet vi en in vitro assay, den transuroepithelial nøytrofile migrasjon analysen, som gjør at etterforskningen av polymorfonukleære leukocytter (PMN, nøytrofile) bevegelse over en blære epiteliale barriere 6 -8. Som med andre to-kammer-modeller av transepithelial migrasjon, blir dyrkede humane blære epitelceller dyrket på undersiden av en permeabel støtte og danner konfluente epiteliale lag. Humane nøytrofiler, isolert fra venous blod, påføres den basolateral side av epitellaget, og migrasjon på tvers av epitelet i fysiologisk relevant basolateral-til-apikal retningen er kvantifisert som svar på infeksjon med forskjellige stammer av E. coli-eller i nærvær av chemoattractant molekyler. Mye forskning har fokusert på nøytrofil bevegelse, både chemokinesis og chemotaxis, i fravær av andre celletyper. Den transuroepithelial nøytrofile migrasjon analysen er en fordel som det tar hensyn til komplekse interaksjoner mellom blære epitelceller og immunceller under infeksjon. Dette medgjørlig in vitro modell har potensial til å tillate detaljert undersøkelse av immunresponser ved uroepithelial overflater.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell Inserts (i.e.&#160;permeable supports)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3472</td>
			<td>6.5 mm, 3 &#956;m pore, polyester membrane insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Blood Collection Tubes</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>366480</td>
			<td>16 mm x 100 mm x 10 ml green cap tubes containing sodium heparin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Safety-Lok Blood Collection and Infusion Set</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>367281</td>
			<td>21 G x 0.75 in needle x 12 in tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer one-use, nonstackable holder</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>364815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4876</td>
			<td>From Leuconostoc mesenteroides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS density centrifugation solution</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3473</td>
			<td>24-well, clear flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3506</td>
			<td>Reconstituted in DMSO to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human CXCL8/IL-8</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>208-IL</td>
			<td>Reconstituted in PBS to 100 &#956;g/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative assessment of human neutrophil migration across a cultured bladder epithelium

Rekrutteringen av immunceller fra periferien til stedet av betennelse er et viktig skritt i det medfødte immunrespons til enhver slimhinneoverflaten. Under infeksjon i urinblæren, polymorfnukleære leukocytter (PMN, nøytrofile) migrere fra blodet og traversere blæren epitel. Unnlatelse av å løse infeksjon i fravær av en nøytrofil respons demonstrerer viktigheten av PMN i blæren forsvar. For å lette kolonisering av blæren epitel, uropathogenic Escherichia coli (UPEC), den utløsende agent for de fleste urinveisinfeksjoner (UVI), dempe den akutte betennelsesreaksjon ved hjelp av en rekke delvis definerte mekanismer. For ytterligere å undersøke samspillet mellom verten og bakteriell patogen, har vi utviklet en in vitro modell av dette aspektet av den medfødte immunrespons til UPEC. I transuroepithelial nøytrofile migrasjon analysen, en variant på Boyden kammer, kultivert blære epithelial celler blir dyrket til konfluens på undersiden av en permeabel støtte. PMN blir isolert fra humant venøst ​​blod, og er anvendt på basolateral side av blæren epiteliale cellelagene. PMN migrering representerer fysiologisk relevant basolateral-til-apikal retning som reaksjon på bakteriell infeksjon eller kjemotiltrekkende molekyler er nummerert ved hjelp av et hemocytometer. Denne modellen kan brukes til å undersøke samspillet mellom UPEC og eukaryote celler samt å avhøre de molekylære krav til traversering av blæren epitel av PMN. Den transuroepithelial nøytrofile migrasjon modellen vil videreutvikle vår forståelse av den innledende betennelsesreaksjon til UPEC i blæren.

Den transuroepithelial nøytrofil migrering analysen muliggjør kvantitativ vurdering av human PMN migrasjon over dyrkede blære epitelial cellelagene i respons til forskjellige stimuli (figur 1B). Mens protokoll er enkel, er det et antall variabler som kan påvirke PMN migrasjon og følgelig påvirker reproduserbarheten av denne analysen. Tiltak bør tas ved utarbeidelsen av permeable støtter og den PMN å redusere variasjonen mellom tekniske og biologiske replikater. For eksempel bør bare permeable ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium at JoVE.com

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

Vi har utviklet en in vitro-modell som etterligner en viktig komponent i den akutte betennelsesresponsen under infeksjon av blæren med uropathogenic Escherichia coli. Den transuroepithelial nøytrofil migrering analysen muliggjør kvantitativ vurdering av human neutrofil migrering over blæren epitel, kultivert på gjennomtrengelige bærere, som reaksjon på bakteriell infeksjon eller kjemotiltrekkende stoffer.

Kvantitativ vurdering av Menneskelig Neutrophil Migration Across en kultivert Blære Epitel

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

En kvantitativ vurdering av Cell Migration ved Phagokinetic Track Motilitet Assay

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Kvantitativ<em&gt; In vitro</em&gt; Analysen for å måle Neutrophil vedheft til Aktiverte primære humane mikrovaskulær endotelceller under statiske betingelser

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Introduksjon Kokulturanalyse for å vurdere patogenindusert nøytrofil transepiteriemigrasjon

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Menneskelig Neutrophil Flow Chamber Adhesion analysen

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Utvikling og identifikasjon av en Novel undergruppe av menneskelige nøytrofilmedierte avledet Giant Fagocytter<em&gt; In Vitro</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Hjørnetann nøytrofile ekstracellulære felle formasjon: Dynamisk og kvantitativ analyse av fluorescens mikroskopi

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System

Vurdering av overføring av lymfocytter i et ex vivo Transmigration system

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex ...

Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model

Funksjonell vurdering av intestinal permeabilitet og nøytrofil transepithelial migrasjon hos mus ved hjelp av en standardisert tarmsløyfemodell

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water ...