Name: quantitative assessment of human neutrophil migration across a cultured bladder epithelium
Uploaded: 2013-11-07T19:40:00
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Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH), concede R01-DK080752 y P50-DK064540. Damos las gracias a J. Loughman por sus esfuerzos en el establecimiento de este ensayo.

1. El cultivo de 5.637 células de la vejiga epiteliales Realice los siguientes pasos en una campana de cultivo de tejidos de flujo laminar preparado con la irradiación UV y limpiada con etanol al 70%. <ol><li> Prepare medio RPMI-1640 que contenía suero bovino fetal al 10% (FBS) [denominado RPMI +], esterilizar por filtración usando un filtro de 0,22 micras de tamaño de poro, y se calienta a 37 ° C en un baño de agua. </li><li> Descongelar un criovial de 5.637 células (American Type...

<ol>
	<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orientation+chamber+in+chemotaxis.">Orientation chamber in chemotaxis.</a> Methods Enzymol. 162, 65-72 (1988).</li><li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber.">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> J. Cell Sci. 99 (Pt. 4), 769-775 (1991).</li><li>Chin, A. C., Parkos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathobiology+of+neutrophil+transepithelial+migration:+implications+in+mediating+epithelial+injury.">Pathobiology of neutrophil transepithelial migration: implications in mediating epithelial injury.</a> Annu. Rev. Pathol. 2, 111-143 (2007).</li><li>Zemans, R. L., Colgan, S. P., Downey, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transepithelial+migration+of+neutrophils:+mechanisms+and+implications+for+acute+lung+injury.">Transepithelial migration of neutrophils: mechanisms and implications for acute lung injury.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 40, 519-535 (2009).</li><li>Loughman, J. A., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+human+neutrophil+migration+and+function+by+uropathogenic+bacteria.">Attenuation of human neutrophil migration and function by uropathogenic bacteria.</a> Microbes Infect. 13, 555-565 (2011).</li><li>Lau, M. E., Loughman, J. A., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YbcL+of+uropathogenic+Escherichia+coli+suppresses+transepithelial+neutrophil+migration.">YbcL of uropathogenic Escherichia coli suppresses transepithelial neutrophil migration.</a> Infect. Immun. 80, 4123-4132 (2012).</li><li>Loughman, J. A., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+indoleamine+2,3-dioxygenase+by+uropathogenic+bacteria+attenuates+innate+responses+to+epithelial+infection.">Induction of indoleamine 2,3-dioxygenase by uropathogenic bacteria attenuates innate responses to epithelial infection.</a> J. Infect. Dis. 205, 1830-1839 (2012).</li><li>Foxman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+urinary+tract+infection.">The epidemiology of urinary tract infection.</a> Nat. Rev. Urol. 7, 653-660 (1038).</li><li>Haraoka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+recruitment+and+resistance+to+urinary+tract+infection.">Neutrophil recruitment and resistance to urinary tract infection.</a> J. Infect. Dis. 180, 1220-1229 (1999).</li><li>Billips, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+host+innate+immune+response+in+the+bladder+by+uropathogenic+Escherichia+coli.">Modulation of host innate immune response in the bladder by uropathogenic Escherichia coli.</a> Infect. Immun. 75, 5353-5360 (2007).</li><li>Bozeman, P. M., Learn, D. B., Thomas, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+the+human+leukocyte+enzymes+myeloperoxidase+and+eosinophil+peroxidase.">Assay of the human leukocyte enzymes myeloperoxidase and eosinophil peroxidase.</a> J. Immunol. Methods. 126, 125-133 (1990).</li><li>Lee, W. Y., Chin, A. C., Voss, S., Parkos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+neutrophil+transepithelial+migration.">In vitro neutrophil transepithelial migration.</a> Methods Mol. Biol. 341, 205-215 (2006).</li><li>S&#228;ve, S., Mohlin, C., Vumma, R., Persson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+adenosine+A2A+receptors+inhibits+neutrophil+transuroepithelial+migration.">Activation of adenosine A2A receptors inhibits neutrophil transuroepithelial migration.</a> Infect. Immun. 79, 3431-3437 (2011).</li><li>Agace, W. W., Patarroyo, M., Svensson, M., Carlemalm, E., Svanborg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+induces+transuroepithelial+neutrophil+migration+by+an+intercellular+adhesion+molecule-1-dependent+mechanism.">Escherichia coli induces transuroepithelial neutrophil migration by an intercellular adhesion molecule-1-dependent mechanism.</a> Infect. Immun. 63, 4054-4062 (1995).</li><li>Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+urinary+tract+infection.">A murine model of urinary tract infection.</a> Nat. Protoc. 4, 1230-1243 (2009).</li></ol>

Usando una línea de células epiteliales cultivadas de la vejiga y recién aisladas PMN humanos, establecimos un modelo in vitro de la migración de neutrófilos transuroepithelial. Este modelo ha sido instrumental en el inicio de diseccionar la complejidad de la respuesta inmune innata durante la infección del tracto urinario (ITU), una infección bacteriana muy común por lo general causada por la UPEC 9. Durante la infección de la vejiga, o cistitis, el reclutamiento de los PMN al lumen de la v...

El movimiento de las células en todo el cuerpo, a menudo a través de largas distancias, se requiere para el crecimiento y el desarrollo, la curación de heridas, y la respuesta inmune. La migración celular es complejo y requiere la coordinación de muchos procesos diferentes, incluyendo cascadas de señalización y la reordenación de los componentes del citoesqueleto. Las células pueden moverse al azar (quimiocinesis), así como hacia gradientes químicos definidos (quimiotaxis). Muchas técnicas se han desarrollado para estudiar la migración celular in vitro. La técnica más antigua y más común, la cámara de Boyden, consiste en un sistema de dos cámaras verticales cuando una sustancia quimiotáctica se coloca en la cámara inferior y células de interés se colocan en la cámara superior 1. El movimiento de las células a través del filtro permeable, con poros de tamaño definido, que separa las dos cámaras se controla. Otras técnicas se han desarrollado para investigar la migración de células, incluyendo la cámara de Zigmond 2 y la cámara de Dunn3. Estos enfoques colectivos han aportado una información valiosa sobre el movimiento de muchos tipos de células diferentes. Además de interrogar a los principios básicos de la quimiocinesis y la quimiotaxis, ensayos de dos cámaras han facilitado la investigación de la migración celular a través de componentes de la matriz extracelular y ambas capas de células endoteliales y epiteliales. Una ventaja de los sistemas de dos cámaras sobre otras técnicas es que la membrana porosa se puede recubrir con proteínas tales como colágeno o fibrinógeno, y la migración de células a través de una barrera de matriz extracelular se puede evaluar. Además, las líneas de células cultivadas se pueden cultivar y diferenciar en los soportes permeables. Para investigar el movimiento de las células a través de una barrera endotelial, células endoteliales cultivadas se siembran y cultivan en el depósito superior de los soportes permeables. Células móviles, tales como las células inmunes, se añaden al depósito superior y la migración en el depósito inferior a través de la linease observa barrera endotelial en la dirección fisiológica-apical a basolateral. Este modelo ha sido muy valioso para la comprensión de la extravasación de las células inmunes de la sangre. En contraste con la migración transendotelial, el movimiento de las células a través de una barrera epitelial se produce normalmente en la dirección basolateral a apical. Con el fin de modelar estos eventos in vitro, los investigadores siembran y crecen las células epiteliales cultivadas en la parte inferior de los soportes permeables. Células móviles se añaden al depósito superior y la migración a través de la barrera epitelial, que representa la dirección basolateral a apical, se supervisa. Estos modelos de la migración transepitelial han contribuido significativamente a nuestra comprensión de las respuestas inflamatorias en las superficies de las mucosas, especialmente los de pulmón y el intestino 4,5. En contraste, el tráfico de células inmune a través del epitelio de las vías urinarias ha recibido mucha menos atención. Para avanzar en nuestra understanding de la respuesta inmune innata en el tracto urinario durante la infección con uropatógena de Escherichia coli (UPEC), hemos desarrollado un ensayo in vitro, el ensayo de migración de neutrófilos transuroepithelial, que permite la investigación de leucocitos polimorfonucleares (PMN; neutrófilos) movimiento a través de una barrera epitelial de la vejiga 6 -8. Al igual que con otros modelos de dos cámaras de la migración transepitelial, células epiteliales de la vejiga humanas cultivadas se cultivan en la parte inferior de un soporte permeable y forman capas epiteliales confluentes. Los neutrófilos humanos, aislados a partir de sangre venosa, se aplican a la parte basolateral de la capa epitelial, y la migración a través del epitelio en la dirección basolateral a apical fisiológicamente relevante se cuantifica en respuesta a la infección con diferentes cepas de E. coli o la presencia de moléculas quimioatrayentes. Mucha investigación se ha centrado en el movimiento de los neutrófilos, tanto chemokinesis y quimiotaxis, en ausencia de otros tipos de células. El ensayo de la migración de neutrófilos transuroepithelial es ventajoso, ya que toma en cuenta las interacciones complejas entre las células epiteliales de la vejiga y de células inmunes durante la infección. Este modelo tratables in vitro tiene el potencial de permitir la investigación detallada de la respuesta inmune en superficies uroepiteliales.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell Inserts (i.e.&#160;permeable supports)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3472</td>
			<td>6.5 mm, 3 &#956;m pore, polyester membrane insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Blood Collection Tubes</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>366480</td>
			<td>16 mm x 100 mm x 10 ml green cap tubes containing sodium heparin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Safety-Lok Blood Collection and Infusion Set</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>367281</td>
			<td>21 G x 0.75 in needle x 12 in tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer one-use, nonstackable holder</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>364815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4876</td>
			<td>From Leuconostoc mesenteroides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS density centrifugation solution</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3473</td>
			<td>24-well, clear flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3506</td>
			<td>Reconstituted in DMSO to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human CXCL8/IL-8</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>208-IL</td>
			<td>Reconstituted in PBS to 100 &#956;g/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative assessment of human neutrophil migration across a cultured bladder epithelium

El reclutamiento de células inmunes desde la periferia hacia el sitio de la inflamación es un paso esencial en la respuesta inmune innata en cualquier superficie de la mucosa. Durante la infección de la vejiga urinaria, los leucocitos polimorfonucleares (PMN; neutrófilos) migran desde el torrente sanguíneo y atraviesan el epitelio de la vejiga. La incapacidad de resolver la infección en ausencia de una respuesta neutrofílica demuestra la importancia de los PMN en la defensa de la vejiga. Para facilitar la colonización del epitelio de la vejiga, uropatógena de Escherichia coli (UPEC), el agente causante de la mayoría de las infecciones del tracto urinario (ITU), amortiguar la respuesta inflamatoria aguda utilizando una variedad de mecanismos parcialmente definidas. Para investigar más a fondo la interacción entre el huésped y el patógeno bacteriano, hemos desarrollado un modelo in vitro de este aspecto de la respuesta inmune innata a la UPEC. En el ensayo de migración de neutrófilos transuroepithelial, una variación en la cámara de Boyden, epith vejiga cultivadasElial células se cultivan hasta la confluencia en la parte inferior de un soporte permeable. PMN se aíslan a partir de sangre venosa humana y se aplica a la cara basolateral de las capas de células epiteliales de la vejiga. Migración de PMN que representa la dirección basolateral a apical fisiológicamente relevantes en respuesta a la infección bacteriana o moléculas quimioatrayentes se enumera usando un hemocitómetro. Este modelo se puede utilizar para investigar las interacciones entre la UPEC y células eucariotas, así como para interrogar a los requisitos moleculares para el recorrido de los epitelios de la vejiga por los PMN. El modelo de la migración de neutrófilos transuroepithelial será mejorar nuestra comprensión de la respuesta inflamatoria inicial a la UPEC en la vejiga.

El ensayo de migración de neutrófilos transuroepithelial permite la evaluación cuantitativa de la migración de PMN humano a través de capas de células epiteliales de la vejiga cultivadas en respuesta a diversos estímulos (Figura 1B). Mientras que el protocolo es sencillo, hay un número de variables que pueden influir en la migración de PMN y por consiguiente afectar a la reproducibilidad de este ensayo. Se deberían tomar medidas, mientras que la preparación de los soportes permeables y el PMN...

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Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

Hemos desarrollado un modelo in vitro que imita un componente importante de la respuesta inflamatoria aguda durante la infección de la vejiga con Escherichia coli uropatógena. El ensayo de migración de neutrófilos transuroepithelial permite la evaluación cuantitativa de la migración de neutrófilos humanos a través de los epitelios de la vejiga, se cultivaron en soportes permeables, en respuesta a la infección bacteriana o sustancias quimioatrayentes.

Evaluación cuantitativa de neutrófilo humano migración a través de una vejiga cultivada Epitelio

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Expansión, purificación y evaluación funcional de la sangre periférica humana células NK

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Investigación

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Seguimiento de Rastreo de neutrófilos intraluminal, la migración transendotelial y la quimiotaxis de los tejidos por microscopía de vídeo intravital

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

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