Name: identifying protein-protein interaction in drosophila adult heads by tandem affinity purification (tap)
Uploaded: 2013-12-05T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP at JoVE.com

Wir danken für die Zusendung EUROSARF Hefe TAP Expressionsplasmide. Wir sind auch dankbar für redaktionelle Hilfe von Ryan Labadens. Diese Arbeit wurde durch ein NIH / NINDS Zuschuss (R01NS070962) auf CW unterstützt

1. Generieren UAS-TAP-markierten Transgene Fliegen <ol><li> Generieren pUAST-TAP-markierten DNA-Konstrukte. <ol><li> Entscheiden Sie, welche Seite (N-oder C-Terminus) der Köder-Protein die TAP-Tag sollte die fusioniert werden sollen, aufgrund der Struktur / Funktion des Proteins. Siehe Diskussion für weitere Details. </li><li> Subklonierung der cDNA-codierenden Region des Gens von Interesse in die multiple Klonierungsstellen (MCS) der pUAST NTAP-oder pUAST CTAP-Vektoren, um N-oder C-terminalen-markierten UAS-TAP-Tra...

<ol>
	<li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration.">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nat. Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).</li><li>Collins, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+comprehensive+atlas+of+the+physical+interactome+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Toward a comprehensive atlas of the physical interactome of Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol. Cell. Proteomics. 6, 439-450 (1074).</li><li>Gavin, A. 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O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+proteomics:+characterization+of+protein+complexes+using+tandem+affinity+purification-mass+spectrometry.">Interaction proteomics: characterization of protein complexes using tandem affinity purification-mass spectrometry.</a> Biochem. Soc. Trans. 38, 883-887 (2010).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tandem+affinity+purification+method:+an+efficient+system+for+protein+complex+purification+and+protein+interaction+identification.">The tandem affinity purification method: an efficient system for protein complex purification and protein interaction identification.</a> Protein Expr. Purif. 72, 149-156 (2010).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Bachmann, A., Knust, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+P-element+transposons+to+generate+transgenic+flies.">The use of P-element transposons to generate transgenic flies.</a> Methods Mol. 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Physiol. , (2013).</li><li>Wu, C., Wairkar, Y. P., Collins, C. A., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highwire+function+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction:+spatial,+structural,+and+temporal+requirements.">Highwire function at the Drosophila neuromuscular junction: spatial, structural, and temporal requirements.</a> J. Neurosci. 25, 9557-9566 (2005).</li><li>Wu, C., Daniels, R. 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Neurosci. 14, 1267-1275 (2011).</li><li>Burckstummer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+tandem+affinity+purification+procedure+for+interaction+proteomics+in+mammalian+cells.">An efficient tandem affinity purification procedure for interaction proteomics in mammalian cells.</a> Nat. Methods. 3, 1013-1019 (2006).</li><li>Kyriakakis, P., Tipping, M., Abed, L., Veraksa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+affinity+purification+in+Drosophila:+the+advantages+of+the+GS-TAP+system.">Tandem affinity purification in Drosophila: the advantages of the GS-TAP system.</a> Fly. 2, 229-235 (2008).</li><li>Bailey, D., Urena, L., Thorne, L., Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+protein+interacting+partners+using+tandem+affinity+purification.">Identification of protein interacting partners using tandem affinity purification.</a> J. Vis. Exp. (60), e3643 (2012).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+model+for+Angelman+syndrome.">A Drosophila model for Angelman syndrome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 12399-12404 (2008).</li><li>Liao, L., McClatchy, D. B., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shotgun+proteomics+in+neuroscience.">Shotgun proteomics in neuroscience.</a> Neuron. 63, 12-26 (2009).</li></ol>

Tandem-Affinitätsreinigung (TAP)-Methode bietet eine Dual-Reinigungsprotokoll, das die Isolierung und Anreicherung von Proteinkomplexen durch zwei unabhängige Affinität Reinigungsschritte ermöglicht. Das Design des TAP-Tag nicht zu dem, was in diesem Protokoll Beispiel beschränkt, andere Proteinbindungsdomänen und Motive auch anwendbar, wenn Pufferbedingungen entsprechend angepasst. Ein gutes Beispiel für andere TAP-Tags ist die GS-TAP-Tag, eine Kombination aus einem G-Protein und einem Streptavidin-Bindungsmotiv...

Definieren der molekularen Signalwege und Netzwerke, die einen bestimmten biologischen Prozess zu vermitteln ist eines der obersten Ziele der biomedizinischen Forschung. Fly Genetiker haben massiv auf zukunfts Genetik abhängig, vor allem Modifikator genetischen Bildschirme (beide Enhancer und Suppressor-Screens), um Faktoren, die zusammenarbeiten, parallel, oder stromaufwärts oder stromabwärts eines Gens von Interesse zu identifizieren. , Vorwärts Genetik Bildschirme oft scheitern jedoch zu wesentlichen Gene zu identifizieren, die, wenn mutiert, verursachen Letalität in frühen Entwicklungsstadien, oder Gene mit funktionellen Redundanz und Entschädigung, deren Funktionsverlust nur subtile Defekte, die schwer zu erzielen sind, verursachen. Eine Möglichkeit, diese Schwierigkeit zu überwinden, ist für die direkte Protein-Protein-Interaktionen zu screenen. Seit mehr als einem Jahrzehnt eine wachsende Liste von biochemischen Methoden, einschließlich Hefe-Zwei-Hybrid-, Phagen-Display, chemische Vernetzung, Co-IP, Tandem Affinity Purification (TAP), usw. wurden verwendet, um Protein zu untersuchen-Protein-Wechselwirkungen. Jeder dieser Ansätze hat ihre eigenen Stärken und Schwächen im Hinblick auf die Empfindlichkeit und Spezifität. Unter ihnen kann der TAP-Verfahren zum Nachweis von physikalischen Wechselwirkung unter nahezu physiologischen Bedingungen bewahrt Spezifität und Konsistenz 2 und schließt die Fähigkeit zum Hochdurchsatz-Analyse 3,4 erstrecken. Die TAP-Methode wurde ursprünglich in der Hefe durch Rigautand Kollegen 1 entwickelt. In diesem Verfahren wird ein Protein von Interesse mit einem TAP-Tag exprimiert. Der TAP-Tag birgt zwei unabhängige Affinität bindende Domänen: eine Protein A-Domäne, die an IgG bindet und eine Calmodulin-Bindungsdomäne. Die beiden Bereiche sind durch eine TEV (Tabak-Etch-Virus)-Spaltstelle getrennt sind. Eine solche Kombination ermöglicht zwei unabhängige Runden der Affinitätsreinigungen ausreichend unspezifische Bindungen zu reduzieren und bereichern spezifischen Bindungen ein. Für diesen Fall ist die TAP-Methode ein sehr leistungsfähiges method in vivo Interaktionen eines bestimmten Proteins zu identifizieren, obwohl Überexpression des exogenen Proteins kann es die sich bei Proteinen, die normalerweise nicht mit den komplexen endogenen Gegen Verbindung zu bringen. Seit seiner Entwicklung hat die TAP-Methode in vielen anderen Systemen, einschließlich Zellkultur-basierten Systemen 5,6 und in vivo Modellsystemen 9.6 angewendet. Hier beschreiben wir die Anpassung der TAP-Methode in Drosophila. Zunächst erzeugen pUAST NTAP-und pUAST CTAP-Vektoren Klonierung und Fusion der TAP-Tag entweder am N-oder C-Terminus des Gens von Interesse zu erleichtern. Die FH-TAP-markierten Transgen wird dann im Nervensystem unter der Kontrolle eines neuronalen GAL4 Treiber 10 ausgedrückt. Als nächstes wird eine große Anzahl von erwachsenen Fliege Köpfe erfasst werden, die hohen Gehalt an Nervenzellen und sind leicht von anderen Körperteilen nach dem Einfrieren auf Größe Differenzen zu trennen. Die erwachsenen Köpfe sind homogenisiert und gelöscht by aufeinanderfolgenden Zentrifugationen und der Überstand wird unter einer unten beschriebenen Prozedur TAP.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="697">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">U.S.A. standard test sieve No. 25</td>
			<td style="width:104px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">04-881-18&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">U.S.A. standard test sieve No. 40</td>
			<td style="width:104px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">04-881-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Kontes Dounce Tissue Grinders 15 ml</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>885300-0015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IgG sepharose beads</td>
			<td>Pharmacia</td>
			<td style="width:119px;">17-0969-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Econo-column 0.7 cm x 20 cm</td>
			<td style="width:104px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">737-4721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Econo-column 0.5 cm x 15 cm</td>
			<td style="width:104px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">737-4716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calmodulin beads</td>
			<td style="width:104px;">Stratagene</td>
			<td style="width:119px;">214303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coors Mortar and Pestle</td>
			<td style="width:104px;">CoorsTek</td>
			<td>60311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AcTEV Protease</td>
			<td style="width:104px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12575-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:104px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease Inhibitor Mix</td>
			<td style="width:104px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying protein-protein interaction in drosophila adult heads by tandem affinity purification (tap)

Genetische Screens durchgeführt unter Verwendung von Drosophila melanogaster (Fruchtfliege) haben zahlreiche Meilenstein Entdeckungen im Vorfeld der biologischen Wissenschaften gemacht. Jedoch wurde die Verwendung von biochemischen Screening auf die sich die Kenntnis der genetischen Analyse gewonnenen Ziel erst kürzlich entdeckt. Hier beschreiben wir eine Methode, um den Proteinkomplex zu reinigen, der sich an jedem Protein von Interesse von erwachsenen Fliegenköpfe. Diese Methode nutzt die Drosophila GAL4/UAS System, um eine Köderprotein mit einem Tandem Affinity Purification (TAP)-Tag in fly Neuronen in vivo verschmolzen Ausdruck zu bringen, und dann implementiert zwei Runden der Reinigung mit einem TAP-Verfahren, ähnlich dem ursprünglich fest Hefe ein, um die Interaktion Protein-Komplex zu reinigen. Am Ende dieses Verfahrens wird ein Gemisch aus mehreren Protein-Komplexe erhalten wird, dessen Molekular Identitäten durch Massenspektrometrie bestimmt werden. Validierung der Kandidatenproteine ​​aus der r profitierenesource und einfache Durchführung loss-of-function-Studien in Fliegen. Ähnliche Ansätze können auf andere Flug Gewebe angewendet werden. Wir glauben, dass die Kombination von genetischen Manipulationen und proteomischen Ansatz dieser in der Flugmodellsystem birgt ein enormes Potenzial für die Bekämpfung der grundlegenden Probleme im Bereich der Neurobiologie und darüber hinaus.

Hier zeigen wir unsere Anstrengungen bei der Identifizierung von Highwire-interagierenden Proteinen im Fliegenhirn. Highwire (Hiw) und seine Wirbeltieren und wirbellosen Homologen sind riesig Ubiquitin-Ligasen, die die Entwicklung und Reparatur des Nervensystems 14 zu regeln. Sie teilen sich eine Reihe von hoch konservierten funktionellen Domänen. Allerdings sind ihre molekularen Aktionen nicht ganz klar. Arbeiten im Schnecken getan, Fliegen und Maus führte zu der aktuellen Arbeitsmodell, dass Hiw Funktione...

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Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila ist berühmt für seine leistungsstarken genetischen Manipulation, aber nicht für die Eignung der eingehenden biochemischen Analyse. Hier präsentieren wir eine TAP-basierte Verfahren, um Interaktionspartner eines Proteins von Interesse aus dem Fliegenhirn zu identifizieren. Dieser Vorgang kann möglicherweise zu neue Wege der Forschung führen.

Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkung in<em&gt; Drosophila</em&gt; Adult Heads von Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Orthogonal Protein Purification von einer kleinen Bispezifische Affinity Tag Facilitated

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Forschung

Biologie

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

Identifizierung von Protein Interaktionspartner mittels Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Chromatin Isolierung von RNA-Reinigung (Chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

Eine flüssige Phase Affinity Capture Assay Verwendung von magnetischen Kügelchen, um Protein-Protein Interaktion Studie: Das Poliovirus-Nanobody Beispiel

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identifizierung von Protein-Komplexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Mit Sequential Peptide Affinity Purification in Kombination mit Tandem-Massenspektrometrie

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

Reinigung von Transcripts und Metaboliten aus<em&gt; Drosophila</em&gt; Köpfe

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Protein Purification-freie Methode der Bindungsaffinität Bestimmung durch Microscale Thermophorese

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Ermittlung von Protein-Protein-Interaktionsstellen unter Verwendung von Peptid-Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Genomweite Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Screening Protein-Fragment Komplementierungsassay (PKA) in lebenden Zellen

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...