Name: submillisecond conformational changes in proteins resolved by photothermal beam deflection
Uploaded: 2014-02-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation (MCB 1.021.831, JM) en J. &amp; E. Biomedical Research Program (Florida Department of Health, JM).

1. Monster Voorbereidingen <ol><li> Voer de monstervoorbereiding en alle monster manipulaties in een donkere kamer om een ​​ongewenste uncaging voorkomen. </li><li> Oplosbaar DM-nitrophen ((1 - (2-nitro-4 ,5-dimethoxyfenyl) - N, N, N &#39;, N&#39;-tetrakis [(oxy-carbonyl) methyl] -1,2-ethaandiamine) in 50 mM HEPES buffer, 100 mM KCl, pH 7,0 tot een eindconcentratie van 400 uM (ε 350 nm = 4330 M-1 cm -1 9). </li><li> Voeg CaCl2 van de 0,1 M stockoplossing aan ee...

<ol>
	<li>Gensch, T., Viappiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+photothermal+methods:+accessing+time-resolved+thermodynamics+of+photoinduced+processes+in+chemistry+and+biology.">Time-resolved photothermal methods: accessing time-resolved thermodynamics of photoinduced processes in chemistry and biology.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 2, 699-721 (2003).</li><li>Larsen, R. W., Mik&#353;ovsk&#225;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+resolved+thermodynamics+of+ligand+binding+to+heme+proteins.">Time resolved thermodynamics of ligand binding to heme proteins.</a> Coord. Chem. Rev. 251 (9-10), 1101-1127 (2007).</li><li>Westrick, J. A., Peters, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoacoustic+calorimetric+study+of+horse+myoglobin.">A photoacoustic calorimetric study of horse myoglobin.</a> Bioph. Chem. 37 (1-3), 73-79 (1990).</li><li>Belogortseva, N., Rubio, M., Terrell, W., Miksovska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+heme+propionate+groups+to+the+conformational+dynamics+associated+with+CO+photodissociation+from+horse+heart+myoglobin.">The contribution of heme propionate groups to the conformational dynamics associated with CO photodissociation from horse heart myoglobin.</a> J. Inorg. Biochem. 101 (7), 977-986 (2007).</li><li>Mik&#353;ovsk&#225;, J., Suquet, C., Satterlee, J. D., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Conformational+Changes+Coupled+to+Ligand+Photodissociation+from+the+Heme+Binding+Domain+of+FixL.">Characterization of Conformational Changes Coupled to Ligand Photodissociation from the Heme Binding Domain of FixL.</a> Biochemistry. 44 (30), 10028-10036 (2005).</li><li>Miksovska, J., Gennis, R. B., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photothermal+studies+of+CO+photodissociation+from+mixed+valence+Escherichia+coli+cytochrome+bo3.">Photothermal studies of CO photodissociation from mixed valence Escherichia coli cytochrome bo3.</a> FEBS Lett. 579 (14), 3014-3018 (2005).</li><li>Losi, A., Michler, I., G&#228;rtner, W., Braslavsky, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+Thermodynamic+Changes+Photoinduced+in+5,12-trans-locked+Bacteriorhodopsin.+Evidence+that+Retinal+Isomerization+is+Required+for+Protein+Activation.">Time-resolved Thermodynamic Changes Photoinduced in 5,12-trans-locked Bacteriorhodopsin. Evidence that Retinal Isomerization is Required for Protein Activation.</a> Photochem. Photobiol. 72, 590-597 (2000).</li><li>Kondoh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-Induced+Conformational+Changes+in+Full-Length+Arabidopsis+thaliana+Cryptochrome.">Light-Induced Conformational Changes in Full-Length Arabidopsis thaliana Cryptochrome.</a> J. Mol. Biol. 413 (1), 128-137 (2011).</li><li>Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolabile+chelators+for+the+rapid+photorelease+of+divalent+cations.">Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (17), 6571-6575 (1988).</li><li>Eisenberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equation+for+the+Refractive+Index+of+Water.">Equation for the Refractive Index of Water.</a> J. Chem. Phys. 43 (11), 3887-3892 (1965).</li><li>Ellis-Davies, G. C., Kaplan, J. H., Barsotti, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+photolysis+of+caged+calcium:+rates+of+calcium+release+by+nitrophenyl-EGTA+and+DM-nitrophen.">Laser photolysis of caged calcium: rates of calcium release by nitrophenyl-EGTA and DM-nitrophen.</a> Biophys. J. 70, 1006-1016 (1996).</li><li>Miksovska, J., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationships+in+metalloproteins.">Structure-function relationships in metalloproteins.</a> Methods Enzymol. 360, 302-329 (2003).</li><li>Miksovska, J., Norstrom, J., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+profiles+for+CO+photodissociation+from+heme+model+compounds:+effect+of+proximal+ligands.">Thermodynamic profiles for CO photodissociation from heme model compounds: effect of proximal ligands.</a> Inorg. Chem. 44 (4), 1006-1014 (2005).</li><li>Dhulipala, G., Rubio, M., Michael, K., Miksovska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+profile+for+urea+photo-release+from+a+N-(2-nitrobenzyl)+caged+urea+compound.">Thermodynamic profile for urea photo-release from a N-(2-nitrobenzyl) caged urea compound.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 8, 1157-1163 (2009).</li></ol>

Het fysieke principe fotothermische werkwijzen is dat een foto-geëxciteerd molecuul verspreidt overtollige energie via vibrationele relaxatie naar de grondtoestand, waardoor thermische verwarming van de omringende oplosmiddel 1,12. Voor oplosmiddelen zoals water, dit tot een snelle-expansie (AV Th). Aangeslagen toestand moleculen kunnen ook onder fotochemische processen die leiden tot niet-thermische volumeveranderingen (AV nonth) door bindingssplitsing / formatie en / of veranderingen ...

Fotothermische werkwijzen zoals fotoakoestische calorimetrie, fotothermische straalafbuigingsbuizen (VOB), en voorbijgaande rooster gekoppeld nanoseconde laser excitatie vormen een krachtig alternatief voor optische spectroscopie voorbijgaande voor tijdsopgeloste studies kortstondige tussenproducten 1,2. In tegenstelling tot optische technieken, zoals transiënte absorptie-en IR-spectroscopie, die volgen het tijdsprofiel van absorptie veranderingen in de chromofoor omgeving; fotothermische technieken detecteren tijdsafhankelijkheid van warmte / volumeveranderingen en daarom waardevolle gereedschappen voor het onderzoeken tijdprofielen optisch &quot;stille&quot; processen. Tot dusver fotoakoestische calorimetrie en voorbijgaande rooster is met succes toegepast op conformationele dynamica van foto-geactiveerde processen waaronder twee atomen ligand migratie globins 3,4 ligand interacties met zuurstofsensor eiwit bestuderen FixL 5, elektronen en protonen transport in heem-koper oxidasen 6 eennd fotosysteem II evenals foto-isomerisatie in rhodopsin 7 en conformationele dynamica in cryptochrome 8. Om de toepassing van fotothermische technieken om biologische systemen die ontbreken intern chromofoor en / of fluorofoor te breiden, werd de PBD techniek in combinatie met het gebruik van gekooide verbinding aan foto-trekker verhoging van ligand / substraat concentratie binnen enkele microseconden of sneller, afhankelijk het gekooide compound. Deze aanpak zorgt voor de opvolging van de dynamiek en energetica van structurele veranderingen in verband met de ligand / substraat binden aan eiwitten die ontbreken een interne fluorofoor of chromofoor en op tijd-schaal die niet toegankelijk door commerciële stopstroming instrumenten. Hier een toepassing van PBD de thermodynamica van de kooi verbinding Ca2 + DM-nitrophen, foto-splitsing en de kinetiek voor Ca 2 + associatie met het C-terminale domein van de neuronale calcium sensor omlaag monitorenstroom Regulatory Element Antagonist Modulator (DREAM) wordt gepresenteerd. De Ca 2 + is foto-vrijgelaten uit Ca 2 + DM-nitrophen binnen 10 usee en rebinds een unphotolysed kooi met een tijdconstante van ~ 300 msec. Anderzijds, in aanwezigheid van apoDREAM extra kinetische zich op de milliseconde tijdschaal waargenomen en weerspiegelt de ligand binding aan het eiwit. De toepassing van PBD conformationele transities in biologische systemen sonde of andere manier beperkt vanwege de instrumentele moeilijkheden, bijvoorbeeld zware uitlijning van de sonde en pompbundel een sterke en reproduceerbare PBD signaal bereiken. Echter, een zorgvuldige ontwerp van een instrumentatie set-up, een nauwkeurige controle van de temperatuur, en een zorgvuldige afstemming van de sonde en pompbundel een consistente en robuuste PBD signaal dat monitoring van tijdopgeloste volume en enthalpie veranderingen maakt op een breed tijdschaal van 10 usee ongeveer 200 msec. Bovendien modificaties van de experimentele procedure voor de detectie van monster en referentiesporen verzekeren onder identieke temperatuur, buffersamenstelling, optische cel oriëntatie, laservermogen, etc. vermindert de experimentele fout in afgemeten reactievolumes en enthalpie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="639">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col /> 
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-N,N,N&#39;,N&#39;-Tetraacetic Acid</td>
			<td style="width:84px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D-6814</td>
			<td style="width:220px;">DM-nitrophen, cage calcium compound, keep stock solutions in dark to prevent photodissociation,</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid)</td>
			<td style="width:84px;">Sigma Adrich</td>
			<td>0909C</td>
			<td>HEPES buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Potassium ferricyanide(III)</td>
			<td style="width:84px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">702587</td>
			<td style="width:220px;">reference compound for PBD measurments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"> </td>
			<td style="width:84px;"> </td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td style="width:220px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sodium chromate</td>
			<td style="width:84px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">307831</td>
			<td style="width:220px;">reference compound for PBD measurments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">He-Ne Laser Diode 5mW 635nm </td>
			<td style="width:84px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:119px;">54-179</td>
			<td style="width:220px;">use as a probe beam for PBD measurments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Oscilloscope, </td>
			<td style="width:84px;">LeCroy</td>
			<td style="width:119px;">Wave Surfer 42Xs</td>
			<td style="width:220px;">400 MHz bandwith</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nd:YAG laser</td>
			<td style="width:84px;">Continuum</td>
			<td style="width:119px;">ML II</td>
			<td>pump beam for PBD measurments</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:216px;">M355; Nd:YAG laser mirror</td>
			<td style="width:84px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:119px;">47-324</td>
			<td>laser mirror for 355 nm laser line</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:216px;">M1 and M2; Laser diode mirror</td>
			<td style="width:84px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:119px;">43-532</td>
			<td>visilbe laser flat mirror, wavelength range 300-700 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">P1 and P2; Iris Diaphragm</td>
			<td style="width:84px;">Edmind Optics</td>
			<td style="width:119px;">62-649</td>
			<td style="width:220px;">pin hole to shape the probe and pum beams</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">L1; bi-convex lens</td>
			<td style="width:84px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:119px;">LB1844</td>
			<td style="width:220px;">a lens to focus the probe beam at the detector, EFL 50 mm, wavelength range 350 - 2000 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DM, dichroic mirror</td>
			<td style="width:84px;">Thorlab </td>
			<td style="width:119px;">DMLP505</td>
			<td style="width:220px;">a longpass dichroic mirror with a cutoff wavelength of 505 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">F1; Edge filter</td>
			<td style="width:84px;">Andower </td>
			<td style="width:119px;">500FH90-25</td>
			<td>a long pass filter with a cutoff wavelength of 500 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Temperature-controlled cuvette holder</td>
			<td style="width:84px;">Quantum Northwest</td>
			<td style="width:119px;">FLASH 300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

submillisecond conformational changes in proteins resolved by photothermal beam deflection

Fotothermische straalafbuiging met fotoakoestische calorimetrie en thermische raster behoort tot de familie van fotothermische methoden die de tijd-profiel volume en enthalpie veranderingen van licht geïnduceerde conformationele veranderingen in eiwitten op microseconde tijdschaal die niet toegankelijk zijn milliseconde traditionele stop bewaken flow instrumenten. Bovendien, omdat algemene wijzigingen in volume en / of enthalpie gepeild, deze technieken kunnen worden toegepast om proteïnen en andere biomacromolecules die een fluorofoor en een chromofoor label of ontbreekt. Om dynamiek en energetica van structurele veranderingen in verband met Ca 2 monitoren + binden aan calcium transducers, zoals neuronale calcium sensoren, een gekooide calciumverbinding, DM-nitrophen, wordt gebruikt om foto-trekker een snelle (τ &lt;20 msec) toename van vrije calcium concentratie en het bijbehorende volume en enthalpie veranderingen worden gesondeerd met fotothermische bundeldeflectie techniek.

Een representatief voorbeeld van PBD sporen voor Ca 2 + foto afgifte van Ca2 + DM-nitrophen wordt getoond in figuur 3. De snelle fase komt overeen met de foto-splitsing van Ca 2 + DM-nitrophen en Ca 2 + bevrijding, terwijl de langzame fase weerspiegelt Ca 2 + binding aan de nonphotolysed kooi. De plot van het monster PBD amplitude van de snelle en langzame fase geschaald op de amplitude van de referentieverbinding als functie van de temperatuur afha...

Watch this Scientific Journal Video about Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection at JoVE.com

Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection

Hier een toepassing van de fotothermische straalafbuigingsbuizen techniek in combinatie met een gekooide calciumverbinding, DM-nitrophen tot microseconde en milliseconde dynamiek en energiebalans van structurele veranderingen met betrekking tot calcium vereniging een neuronale calcium sensor downstream Regulatory Element Antagonist Modulator volgen we verslag .

Submillisecond Conformational Veranderingen in Eiwitten opgelost door Fotothermische straalafbuiging

Photothermal beam deflection together with photo-acoustic calorimetry and thermal grating belongs to the family of photothermal methods that monitor the ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Chemistry

Biology

Physics

Fundamentals

Unit 1

The First Law of Thermodynamics

Macromolecules

SCIENTISTS IN ACTION

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

Het bepalen van de IJsbindende Vlakken van Antivries eiwitten door Fluorescentie-gebaseerde Ice Plane Affiniteit

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

The Use of Gas Chromatography to Analyze Compositional Changes of Fatty Acids in Rat Liver Tissue during Pregnancy

Het gebruik van gaschromatografie tot veranderingen in de samenstelling van vetzuren Analyseer in Rat leverweefsel tijdens de zwangerschap

Gas chromatography (GC) is a highly sensitive method used to identify and quantify the fatty acid content of lipids from tissues, cells, and plasma/serum, ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Radioactief en kwantificering van cellulaire niveaus van fosfoinositiden door High Performance Liquid Chromatography-gekoppeld Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

In Situ karakterisering van gehydrateerde Eiwitten in Water door SALVI en ToF-SIMS

This work demonstrates in situ characterization of protein biomolecules in the aqueous solution using the System for Analysis at the Liquid Vacuum ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

Een HS-MRM Assay voor de kwantificering van de gastheercel eiwitten in Protein biofarmaceutica door vloeistofchromatografie Ion mobiliteit QTOF massaspectrometrie

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

Time-resolved Photophysical Characterization of Triplet-harvesting Organic Compounds at an Oxygen-free Environment Using an iCCD Camera

Time-resolved fotofysische karakterisering van Triplet-oogst organische verbindingen in een zuurstofvrije omgeving met behulp van een iCCD Camera

Here, we present a sensible method of the acquisition and analysis of time-resolved photoluminescence using an ultrafast iCCD camera. This system enables ...

DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

DNA-magnetische deeltjes analyse door dynamische en elektroforetische lichtverstrooiing bindend

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in an Efficient Way in Plants

Co expressie van meerdere chimeer fluorescerende Fusion eiwitten op een efficiënte manier in planten

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent ...

Photoelectron Imaging of Anions Illustrated by 310 Nm Detachment of F&#8722;

Photoelectron Imaging of Anions Illustrated by 310 Nm Detachment of FÃƒÆ’Ã‚Â¢Ãƒâ€¹Ã¢â‚¬Â '

Photoelectron beeldvorming van anionen geïllustreerd door 310 Nm detachement van F−

Anion photoelectron imaging is a very efficient method for the study of energy states of bound negative ions, neutral species and interactions of unbound ...

Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers

Verbetering van de extrusie van de hoge viscositeit van Microcrystals voor Time-resolved seriële femtoseconde kristallografie aan X-ray Lasers

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray ...