Name: submillisecond conformational changes in proteins resolved by photothermal beam deflection
Uploaded: 2014-02-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation (MCB 1021831, JM) und J. &amp; E. Biomedical Research Program (Florida Department of Health, JM) unterstützt.

1. Probenvorbereitungen <ol><li> Führen Sie die Probenvorbereitung und Proben alle Manipulationen in einem dunklen Raum eine unerwünschte Uncaging verhindern. </li><li> Solubilisierung DM-Nitrophen ((1 - (2-Nitro-4 ,5-dimethoxyphenyl) - N, N, N &#39;, N&#39;-Tetrakis [(oxy-carbonyl)-methyl] -1,2-ethandiamin) in 50 mM HEPES Puffer, 100 mM KCl, pH 7,0, auf eine Endkonzentration von 400 &amp;mgr; m (350 nm ε = 4330 M -1 cm -1, 9). </li><li> In CaCl 2 aus dem 0,1 M S...

<ol>
	<li>Gensch, T., Viappiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+photothermal+methods:+accessing+time-resolved+thermodynamics+of+photoinduced+processes+in+chemistry+and+biology.">Time-resolved photothermal methods: accessing time-resolved thermodynamics of photoinduced processes in chemistry and biology.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 2, 699-721 (2003).</li><li>Larsen, R. W., Mik&#353;ovsk&#225;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+resolved+thermodynamics+of+ligand+binding+to+heme+proteins.">Time resolved thermodynamics of ligand binding to heme proteins.</a> Coord. Chem. Rev. 251 (9-10), 1101-1127 (2007).</li><li>Westrick, J. A., Peters, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoacoustic+calorimetric+study+of+horse+myoglobin.">A photoacoustic calorimetric study of horse myoglobin.</a> Bioph. Chem. 37 (1-3), 73-79 (1990).</li><li>Belogortseva, N., Rubio, M., Terrell, W., Miksovska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+heme+propionate+groups+to+the+conformational+dynamics+associated+with+CO+photodissociation+from+horse+heart+myoglobin.">The contribution of heme propionate groups to the conformational dynamics associated with CO photodissociation from horse heart myoglobin.</a> J. Inorg. Biochem. 101 (7), 977-986 (2007).</li><li>Mik&#353;ovsk&#225;, J., Suquet, C., Satterlee, J. D., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Conformational+Changes+Coupled+to+Ligand+Photodissociation+from+the+Heme+Binding+Domain+of+FixL.">Characterization of Conformational Changes Coupled to Ligand Photodissociation from the Heme Binding Domain of FixL.</a> Biochemistry. 44 (30), 10028-10036 (2005).</li><li>Miksovska, J., Gennis, R. B., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photothermal+studies+of+CO+photodissociation+from+mixed+valence+Escherichia+coli+cytochrome+bo3.">Photothermal studies of CO photodissociation from mixed valence Escherichia coli cytochrome bo3.</a> FEBS Lett. 579 (14), 3014-3018 (2005).</li><li>Losi, A., Michler, I., G&#228;rtner, W., Braslavsky, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+Thermodynamic+Changes+Photoinduced+in+5,12-trans-locked+Bacteriorhodopsin.+Evidence+that+Retinal+Isomerization+is+Required+for+Protein+Activation.">Time-resolved Thermodynamic Changes Photoinduced in 5,12-trans-locked Bacteriorhodopsin. Evidence that Retinal Isomerization is Required for Protein Activation.</a> Photochem. Photobiol. 72, 590-597 (2000).</li><li>Kondoh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-Induced+Conformational+Changes+in+Full-Length+Arabidopsis+thaliana+Cryptochrome.">Light-Induced Conformational Changes in Full-Length Arabidopsis thaliana Cryptochrome.</a> J. Mol. Biol. 413 (1), 128-137 (2011).</li><li>Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolabile+chelators+for+the+rapid+photorelease+of+divalent+cations.">Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (17), 6571-6575 (1988).</li><li>Eisenberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equation+for+the+Refractive+Index+of+Water.">Equation for the Refractive Index of Water.</a> J. Chem. Phys. 43 (11), 3887-3892 (1965).</li><li>Ellis-Davies, G. C., Kaplan, J. H., Barsotti, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+photolysis+of+caged+calcium:+rates+of+calcium+release+by+nitrophenyl-EGTA+and+DM-nitrophen.">Laser photolysis of caged calcium: rates of calcium release by nitrophenyl-EGTA and DM-nitrophen.</a> Biophys. J. 70, 1006-1016 (1996).</li><li>Miksovska, J., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationships+in+metalloproteins.">Structure-function relationships in metalloproteins.</a> Methods Enzymol. 360, 302-329 (2003).</li><li>Miksovska, J., Norstrom, J., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+profiles+for+CO+photodissociation+from+heme+model+compounds:+effect+of+proximal+ligands.">Thermodynamic profiles for CO photodissociation from heme model compounds: effect of proximal ligands.</a> Inorg. Chem. 44 (4), 1006-1014 (2005).</li><li>Dhulipala, G., Rubio, M., Michael, K., Miksovska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+profile+for+urea+photo-release+from+a+N-(2-nitrobenzyl)+caged+urea+compound.">Thermodynamic profile for urea photo-release from a N-(2-nitrobenzyl) caged urea compound.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 8, 1157-1163 (2009).</li></ol>

Das physikalische Prinzip hinter photothermischen Verfahren ist, dass ein Foto-angeregten Molekül leitet überschüssige Energie über Schwingungsrelaxation in den Grundzustand, was zu einer thermischen Erwärmung des umgebenden Lösungsmittel 1,12. Für Lösungsmittel, wie Wasser, ergibt sich eine schnelle Volumenexpansion (&amp;Dgr; V th). Excited-State-Moleküle können auch photochemische Prozesse, die in nicht-thermische Volumenänderungen (AV nonth) führen durch Bindungsspaltung ...

Foto-thermischen Methoden wie photoakustische Kalorimetrie, photothermischen Strahlablenkung (PDB) und transiente Gitter verbunden mit Nanosekunden-Laseranregung stellen eine leistungsstarke Alternative zu optischen Spektroskopie für die zeitaufgelöste Untersuchungen von kurzlebigen Zwischenprodukte 1,2 vorübergehend. Im Gegensatz zu optischen Techniken, wie transiente Absorption und IR-Spektroskopie, daß der zeitliche Verlauf der Absorptionsänderungen in dem Chromophor Umgebung zu überwachen; photothermische Techniken erfassen die Zeitabhängigkeit der Wärme-/ Volumenänderungen und sind daher wertvolle Werkzeuge für die Untersuchung von Zeitverläufen von optisch &quot;stille&quot; Prozesse. Bisher hat photoakustische Kalorimetrie und vorübergehende Gitter erfolgreich angewendet, um Konformationsdynamik der photoinduzierten Prozesse, einschließlich zweiatomigen Liganden Migration in Globinen 3,4, Liganden-Interaktionen mit Sauerstoff-Sensor-Protein studieren FixL 5, Elektronen-und Protonentransport in Häm-Kupfer-Oxidasen 6 einnd Photosystem II sowie Foto-Isomerisierung in Rhodopsin 7 und Konformationsdynamik von Cryptochrom 8. Die Anwendung der photothermischen Verfahren auf biologische Systeme, fehlt eine interne Chromophor und / oder Fluorophor zu erweitern wurde der PBD-Technik unter Verwendung der photoaktivierbaren Verbindung zur Photo zu einem Anstieg der Ligand / Substrat-Konzentration innerhalb von wenigen Mikrosekunden oder schneller kombiniert, je auf dem Käfig Verbindung. Dieser Ansatz ermöglicht die Überwachung von Dynamik und Energetik von strukturellen Veränderungen mit der Ligand / Substrat-Bindung an Proteine, die fehlt, ist eine interne Fluorophor oder Chromophor sind und auf Zeitskala, die nicht von kommerziellen Stop-Flow-Instrumente zugänglich sind verbunden. Hier ist ein Einsatz von PBD die Thermodynamik der Käfigverbindung, Ca 2 + DM-Nitrophen Photospaltung sowie die Kinetik der Ca 2 +-Assoziation mit dem C-terminalen Domäne des neuronalen Kalziumsensor überwachen untenStrom Regulatory Element Antagonist Modulator (DREAM) wird vorgestellt. Die Ca 2 +-Foto veröffentlicht von Ca 2 + DM-Nitrophen innerhalb von 10 Mikrosekunden und erneuten Bindungen zu einer unphotolysed Käfig mit einer Zeitkonstante von ~ 300 us. Auf der anderen Seite, in Gegenwart apoDREAM eine zusätzliche kinetische auf der Millisekunden-Zeitskala auftritt, beobachtet und reflektiert die Ligandenbindung an das Protein. Die Anwendung von PBD zu Konformationsänderungen in biologischen Systemen zu untersuchen wurde irgendwie durch den instrumentalen Schwierigkeiten beschränkt, zB beschwerliche Ausrichtung der Sonde und Pumpstrahl, eine starke und reproduzierbare PBD-Signal zu erreichen. , Eine sorgfältige Gestaltung eines Instrumentenaufbau, eine präzise Steuerung der Temperatur und eine sorgfältige Ausrichtung der Sonde und Pumpstrahl bieten jedoch eine konsistente und robuste PBD-Signal, das die Überwachung der zeitaufgelösten Volumen-und Enthalpie-Änderungen können auf eine breite Zeitskala von 10 Mikrosekunden auf etwa 200 msec. Außerdem modificErwartungen über die experimentellen Verfahren, um die Detektion von Proben-und Referenzspuren unter identischen Temperatur, Pufferzusammensetzung, optische Zelle Orientierung, Laserleistung, usw. gewährleisten die experimentellen Fehler in der gemessenen Reaktionsvolumina und Enthalpien reduziert.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="639">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col /> 
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-N,N,N&#39;,N&#39;-Tetraacetic Acid</td>
			<td style="width:84px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D-6814</td>
			<td style="width:220px;">DM-nitrophen, cage calcium compound, keep stock solutions in dark to prevent photodissociation,</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid)</td>
			<td style="width:84px;">Sigma Adrich</td>
			<td>0909C</td>
			<td>HEPES buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Potassium ferricyanide(III)</td>
			<td style="width:84px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">702587</td>
			<td style="width:220px;">reference compound for PBD measurments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"> </td>
			<td style="width:84px;"> </td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td style="width:220px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sodium chromate</td>
			<td style="width:84px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">307831</td>
			<td style="width:220px;">reference compound for PBD measurments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">He-Ne Laser Diode 5mW 635nm </td>
			<td style="width:84px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:119px;">54-179</td>
			<td style="width:220px;">use as a probe beam for PBD measurments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Oscilloscope, </td>
			<td style="width:84px;">LeCroy</td>
			<td style="width:119px;">Wave Surfer 42Xs</td>
			<td style="width:220px;">400 MHz bandwith</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nd:YAG laser</td>
			<td style="width:84px;">Continuum</td>
			<td style="width:119px;">ML II</td>
			<td>pump beam for PBD measurments</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:216px;">M355; Nd:YAG laser mirror</td>
			<td style="width:84px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:119px;">47-324</td>
			<td>laser mirror for 355 nm laser line</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:216px;">M1 and M2; Laser diode mirror</td>
			<td style="width:84px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:119px;">43-532</td>
			<td>visilbe laser flat mirror, wavelength range 300-700 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">P1 and P2; Iris Diaphragm</td>
			<td style="width:84px;">Edmind Optics</td>
			<td style="width:119px;">62-649</td>
			<td style="width:220px;">pin hole to shape the probe and pum beams</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">L1; bi-convex lens</td>
			<td style="width:84px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:119px;">LB1844</td>
			<td style="width:220px;">a lens to focus the probe beam at the detector, EFL 50 mm, wavelength range 350 - 2000 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DM, dichroic mirror</td>
			<td style="width:84px;">Thorlab </td>
			<td style="width:119px;">DMLP505</td>
			<td style="width:220px;">a longpass dichroic mirror with a cutoff wavelength of 505 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">F1; Edge filter</td>
			<td style="width:84px;">Andower </td>
			<td style="width:119px;">500FH90-25</td>
			<td>a long pass filter with a cutoff wavelength of 500 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Temperature-controlled cuvette holder</td>
			<td style="width:84px;">Quantum Northwest</td>
			<td style="width:119px;">FLASH 300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

submillisecond conformational changes in proteins resolved by photothermal beam deflection

Photothermische Strahlablenkung zusammen mit photoakustischen Kalorimetrie und thermische Gitter gehört zu der Familie der photothermischen Methoden, die die Zeit-Profil Volumen und Enthalpie Veränderungen von Licht induzierten Konformationsänderungen in Proteinen auf Mikrosekunde bis zu Zeitskalen, die nicht zugänglich sind Millisekunden mit traditionellen Stop überwachen Flussinstrumenten. Da außerdem Gesamtänderungen und / oder die Enthalpie sondiert werden, diese Techniken zu Proteinen und anderen Biomakromolekülen, die einen Fluorophor oder ein Chromophor Markierung fehlen angewendet werden. Um Dynamik und Energetik von strukturellen Veränderungen verbunden mit Ca 2 +-Bindung zu überwachen, um Kalzium Wandler, wie neuronale Calcium-Sensoren, einem Käfig Calciumverbindung, DM-Nitrophen ist auf Foto-Abzug eine schnelle (τ &lt;20 us) Anstieg der freien Kalzium beschäftigt Konzentration und das zugehörige Volumen und Enthalpie Änderungen werden mit photothermischen Strahlablenkung Technik sondiert.

Ein repräsentatives Beispiel für PBD Spuren für Ca 2 + Foto-Freisetzung aus Ca 2 + DM-Nitrophen ist in Abbildung 3 dargestellt. Die schnelle Phase entspricht der Photospaltung von Ca 2 + DM-Nitrophen und Ca 2 +-Freisetzung, während die langsame Phase reflektiert Ca 2 +-Bindung an den nonphotolysed Käfig. Die Handlung der Probe PBD Amplitude für die auf die Amplitude der Referenzverbindung als Funktion der Temperatur abhängig Faktor [C p<...

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Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection

Eine Anwendung der photothermischen Strahlablenkung Technik in Kombination mit einem Käfig Calciumverbindung, DM-Nitrophen zu Mikrosekunde und Millisekunde Dynamik und Energetik von strukturellen Veränderungen mit dem Calcium-Verband zu einer neuronalen Kalziumsensor, Downstream Regulatory Element Antagonist Modulator verbunden überwachen Hier berichten wir .

Submillisekunden Konformationsänderungen in Proteinen durch Photothermische Ablenkein Gelöst

Photothermal beam deflection together with photo-acoustic calorimetry and thermal grating belongs to the family of photothermal methods that monitor the ...

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