Name: submillisecond conformational changes in proteins resolved by photothermal beam deflection
Uploaded: 2014-02-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Science Foundation (MCB 1.021.831, JM) e J. &amp; E. Biomedical Research Program (Florida Department of Health, JM).

1. Preparazioni di esempio <ol><li> Eseguire la preparazione dei campioni e tutte le manipolazioni del campione in una stanza buia per evitare un uncaging indesiderato. </li><li> Solubilizzare DM-nitrophen ((1 - (2-nitro-4 ,5-dimetossifenil) - N, N, N &#39;, N&#39;-tetrakis [(ossi-carbonile) metil] -1,2-ethanediamine) in HEPES 50 mM tampone, KCl 100 mM, pH 7,0 ad una concentrazione finale di 400 pM (ε = 350nm 4330 m -1 cm -1 9). </li><li> Aggiungere CaCl 2 dalla so...

<ol>
	<li>Gensch, T., Viappiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+photothermal+methods:+accessing+time-resolved+thermodynamics+of+photoinduced+processes+in+chemistry+and+biology.">Time-resolved photothermal methods: accessing time-resolved thermodynamics of photoinduced processes in chemistry and biology.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 2, 699-721 (2003).</li><li>Larsen, R. W., Mik&#353;ovsk&#225;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+resolved+thermodynamics+of+ligand+binding+to+heme+proteins.">Time resolved thermodynamics of ligand binding to heme proteins.</a> Coord. Chem. Rev. 251 (9-10), 1101-1127 (2007).</li><li>Westrick, J. A., Peters, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoacoustic+calorimetric+study+of+horse+myoglobin.">A photoacoustic calorimetric study of horse myoglobin.</a> Bioph. Chem. 37 (1-3), 73-79 (1990).</li><li>Belogortseva, N., Rubio, M., Terrell, W., Miksovska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+heme+propionate+groups+to+the+conformational+dynamics+associated+with+CO+photodissociation+from+horse+heart+myoglobin.">The contribution of heme propionate groups to the conformational dynamics associated with CO photodissociation from horse heart myoglobin.</a> J. Inorg. Biochem. 101 (7), 977-986 (2007).</li><li>Mik&#353;ovsk&#225;, J., Suquet, C., Satterlee, J. D., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Conformational+Changes+Coupled+to+Ligand+Photodissociation+from+the+Heme+Binding+Domain+of+FixL.">Characterization of Conformational Changes Coupled to Ligand Photodissociation from the Heme Binding Domain of FixL.</a> Biochemistry. 44 (30), 10028-10036 (2005).</li><li>Miksovska, J., Gennis, R. B., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photothermal+studies+of+CO+photodissociation+from+mixed+valence+Escherichia+coli+cytochrome+bo3.">Photothermal studies of CO photodissociation from mixed valence Escherichia coli cytochrome bo3.</a> FEBS Lett. 579 (14), 3014-3018 (2005).</li><li>Losi, A., Michler, I., G&#228;rtner, W., Braslavsky, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+Thermodynamic+Changes+Photoinduced+in+5,12-trans-locked+Bacteriorhodopsin.+Evidence+that+Retinal+Isomerization+is+Required+for+Protein+Activation.">Time-resolved Thermodynamic Changes Photoinduced in 5,12-trans-locked Bacteriorhodopsin. Evidence that Retinal Isomerization is Required for Protein Activation.</a> Photochem. Photobiol. 72, 590-597 (2000).</li><li>Kondoh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-Induced+Conformational+Changes+in+Full-Length+Arabidopsis+thaliana+Cryptochrome.">Light-Induced Conformational Changes in Full-Length Arabidopsis thaliana Cryptochrome.</a> J. Mol. Biol. 413 (1), 128-137 (2011).</li><li>Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolabile+chelators+for+the+rapid+photorelease+of+divalent+cations.">Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (17), 6571-6575 (1988).</li><li>Eisenberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equation+for+the+Refractive+Index+of+Water.">Equation for the Refractive Index of Water.</a> J. Chem. Phys. 43 (11), 3887-3892 (1965).</li><li>Ellis-Davies, G. C., Kaplan, J. H., Barsotti, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+photolysis+of+caged+calcium:+rates+of+calcium+release+by+nitrophenyl-EGTA+and+DM-nitrophen.">Laser photolysis of caged calcium: rates of calcium release by nitrophenyl-EGTA and DM-nitrophen.</a> Biophys. J. 70, 1006-1016 (1996).</li><li>Miksovska, J., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationships+in+metalloproteins.">Structure-function relationships in metalloproteins.</a> Methods Enzymol. 360, 302-329 (2003).</li><li>Miksovska, J., Norstrom, J., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+profiles+for+CO+photodissociation+from+heme+model+compounds:+effect+of+proximal+ligands.">Thermodynamic profiles for CO photodissociation from heme model compounds: effect of proximal ligands.</a> Inorg. Chem. 44 (4), 1006-1014 (2005).</li><li>Dhulipala, G., Rubio, M., Michael, K., Miksovska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+profile+for+urea+photo-release+from+a+N-(2-nitrobenzyl)+caged+urea+compound.">Thermodynamic profile for urea photo-release from a N-(2-nitrobenzyl) caged urea compound.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 8, 1157-1163 (2009).</li></ol>

Il principio fisico dietro metodi fototermiche è che una molecola fotoeccitati dissipa l&#39;energia in eccesso tramite vibrazionale rilassamento allo stato fondamentale, con conseguente riscaldamento termico del 1,12 solvente circostante. Per solventi come acqua, questo produce una rapida espansione del volume (ΔV th). Molecole Eccitato statali possono anche subire processi fotochimici che si traducono in variazioni di volume non termici (ΔV nonth) a causa di legame scissione / forma...

Photo-thermal metodi come la calorimetria fotoacustica, deflessione del fascio fototermica (PDB), e griglia transitoria accoppiato con eccitazione laser nanosecondo rappresentano una potente alternativa a transitori spettroscopie ottiche per gli studi risolta in tempo di breve durata intermedi 1,2. Contrariamente alle tecniche ottiche, come l&#39;assorbimento transiente e spettroscopia IR, che monitorano il profilo temporale delle variazioni di assorbimento nella cromoforo circostante; tecniche fototermiche rilevano la dipendenza dal tempo delle variazioni di calore / volume e quindi sono strumenti preziosi per lo studio di profili temporali otticamente processi &quot;silenti&quot;. Finora, calorimetria fotoacustica e griglia transitorio è stato applicato con successo per studiare la dinamica conformazionale dei processi foto-indotto compreso diatomic migrazione ligando in globine 3,4, interazioni ligando con proteine ​​sensore di ossigeno FixL 5, elettrone e trasporto di protoni in eme-rame ossidasi 6 unnd fotosistema II così come foto-isomerizzazione in rodopsina 7 e dinamica conformazionale in cryptochrome 8. Per espandere l&#39;applicazione di tecniche fototermiche a sistemi biologici che mancano un cromoforo interno e / o fluoroforo, la tecnica PBD è stato combinato con l&#39;uso di composti gabbia a foto-trigger un aumento della concentrazione di ligando / substrato giro di pochi microsecondi o superiore, a seconda sul composto gabbia. Questo approccio consente il monitoraggio delle dinamiche e l&#39;energetica dei cambiamenti strutturali connessi con il ligando / substrato legame alle proteine ​​che mancano di un fluoroforo interno o cromofori e scala temporale che non sono accessibili con strumenti stop-flow commerciali. Qui un&#39;applicazione di PBD per monitorare la termodinamica del composto gabbia, Ca 2 + DM-nitrophen, foto-scissione e la cinetica di Ca 2 + associazione al dominio C-terminale del sensore calcio neuronale Giùflusso di regolamentazione Elemento Antagonista modulatore (Dream) è presentato. Il Ca 2 + è foto-rilasciato da Ca 2 + DM-nitrophen entro 10 msec e riassocia a una gabbia unphotolysed con una costante di tempo di ~ 300 msec. D&#39;altra parte, in presenza di apoDREAM si osserva una cinetica supplementare che si verificano sul millisecondo scala temporale e riflette il legame alla proteina ligando. L&#39;applicazione del PBD per sondare transizioni conformazionali nei sistemi biologici è stata in qualche modo limitato a causa delle difficoltà strumentali; allineamento es arduo della sonda e fascio di pompa per ottenere un segnale forte e riproducibile PBD. Tuttavia, una progettazione meticolosa di una strumentazione set-up, un controllo preciso della temperatura, e un attento allineamento del fascio sonda e pompa forniscono un segnale coerente e robusto PBD che consente il monitoraggio di volume-tempo risolto e variazioni di entalpia su un ampio scala temporale da 10 msec a circa 200 msec. Inoltre, modificzioni della procedura sperimentale per assicurare la rilevazione di campione e di riferimento tracce sotto temperatura identica composizione del tampone, orientamento cella ottica, potenza del laser, ecc riduce significativamente l&#39;errore sperimentale in volumi di reazione misurati ed entalpie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="639">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col /> 
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-N,N,N&#39;,N&#39;-Tetraacetic Acid</td>
			<td style="width:84px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D-6814</td>
			<td style="width:220px;">DM-nitrophen, cage calcium compound, keep stock solutions in dark to prevent photodissociation,</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid)</td>
			<td style="width:84px;">Sigma Adrich</td>
			<td>0909C</td>
			<td>HEPES buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Potassium ferricyanide(III)</td>
			<td style="width:84px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">702587</td>
			<td style="width:220px;">reference compound for PBD measurments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"> </td>
			<td style="width:84px;"> </td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td style="width:220px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sodium chromate</td>
			<td style="width:84px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">307831</td>
			<td style="width:220px;">reference compound for PBD measurments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">He-Ne Laser Diode 5mW 635nm </td>
			<td style="width:84px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:119px;">54-179</td>
			<td style="width:220px;">use as a probe beam for PBD measurments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Oscilloscope, </td>
			<td style="width:84px;">LeCroy</td>
			<td style="width:119px;">Wave Surfer 42Xs</td>
			<td style="width:220px;">400 MHz bandwith</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nd:YAG laser</td>
			<td style="width:84px;">Continuum</td>
			<td style="width:119px;">ML II</td>
			<td>pump beam for PBD measurments</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:216px;">M355; Nd:YAG laser mirror</td>
			<td style="width:84px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:119px;">47-324</td>
			<td>laser mirror for 355 nm laser line</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:216px;">M1 and M2; Laser diode mirror</td>
			<td style="width:84px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:119px;">43-532</td>
			<td>visilbe laser flat mirror, wavelength range 300-700 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">P1 and P2; Iris Diaphragm</td>
			<td style="width:84px;">Edmind Optics</td>
			<td style="width:119px;">62-649</td>
			<td style="width:220px;">pin hole to shape the probe and pum beams</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">L1; bi-convex lens</td>
			<td style="width:84px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:119px;">LB1844</td>
			<td style="width:220px;">a lens to focus the probe beam at the detector, EFL 50 mm, wavelength range 350 - 2000 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DM, dichroic mirror</td>
			<td style="width:84px;">Thorlab </td>
			<td style="width:119px;">DMLP505</td>
			<td style="width:220px;">a longpass dichroic mirror with a cutoff wavelength of 505 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">F1; Edge filter</td>
			<td style="width:84px;">Andower </td>
			<td style="width:119px;">500FH90-25</td>
			<td>a long pass filter with a cutoff wavelength of 500 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Temperature-controlled cuvette holder</td>
			<td style="width:84px;">Quantum Northwest</td>
			<td style="width:119px;">FLASH 300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

submillisecond conformational changes in proteins resolved by photothermal beam deflection

Deflessione del fascio Photothermal insieme con la foto-acustica calorimetria e griglia termica appartiene alla famiglia dei metodi fototermiche che controllano il volume e il tempo di entalpia profilo cambiamenti di luce indotti cambiamenti conformazionali nelle proteine ​​sulla microsecondo per millisecondo scale temporali che non sono accessibili con fermata tradizionale -flow strumenti. Inoltre, poiché le variazioni complessiva del volume e / o entalpia vengono sondati, queste tecniche possono essere applicate a proteine ​​e altre biomacromolecole che mancano di un fluoroforo e o un&#39;etichetta cromoforo. Per monitorare la dinamica ed energetica dei cambiamenti strutturali connessi con Ca 2 + vincolante ai trasduttori di calcio, tali sensori di calcio neuronali, un composto di calcio in gabbia, DM-nitrophen, è impiegato per foto-trigger un facile (τ &lt;20 msec) aumento del calcio libero variazioni di concentrazione e il volume associato e entalpia vengono sondati con fascio fototermica tecnica di deflessione.

Un esempio rappresentativo di PBD tracce di Ca 2 + photo-release di Ca 2 + DM-nitrophen è mostrata in figura 3. La fase veloce corrisponde alla foto-scissione di Ca 2 + DM-nitrophen e Ca 2 + liberazione, mentre la fase lenta riflette Ca 2 + legame alla gabbia nonphotolysed. La trama del PBD ampiezza campione per la fase veloce e lento scalato all&#39;ampiezza del composto di riferimento in funzione del fattore dipendeva temperatura [C p ...

Watch this Scientific Journal Video about Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection at JoVE.com

Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection

Qui riportiamo un&#39;applicazione della tecnica deflessione del fascio photothermal in combinazione con un composto di calcio in gabbia, DM-nitrophen, per monitorare microsecondi e millisecondi dinamica ed energetica di cambiamenti strutturali connessi con l&#39;associazione calcio per un sensore calcio neuronale, Downstream elemento di regolazione Antagonista Modulator .

Millisecondo conformazionali Variazioni proteine ​​risolti dal Photothermal Rinvio del raggio

Photothermal beam deflection together with photo-acoustic calorimetry and thermal grating belongs to the family of photothermal methods that monitor the ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Chemistry

Biology

Physics

Fundamentals

Unit 1

The First Law of Thermodynamics

Macromolecules

SCIENTISTS IN ACTION

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

Determinazione dei piani di legame del ghiaccio delle proteine antigelo mediante affinità del piano di ghiaccio basata sulla fluorescenza

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

Ricerca

Chimica

The Use of Gas Chromatography to Analyze Compositional Changes of Fatty Acids in Rat Liver Tissue during Pregnancy

L&#39;uso di gas cromatografia per analizzare compositivo Variazioni degli acidi grassi nel fegato di ratto tessuto durante la gravidanza

Gas chromatography (GC) is a highly sensitive method used to identify and quantify the fatty acid content of lipids from tissues, cells, and plasma/serum, ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Radiomarcatura e quantificazione dei livelli cellulari di fosfoinositidi da alte prestazioni cromatografia liquida accoppiata flusso scintillazione

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

In Situ Caratterizzazione di idrate proteine ​​in acqua da Salvi e TOF-SIMS

This work demonstrates in situ characterization of protein biomolecules in the aqueous solution using the System for Analysis at the Liquid Vacuum ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

Un saggio di HS-MRM per la quantificazione delle proteine di cellula ospite in biofarmaceutica di proteine mediante spettrometria di massa di liquido cromatografia dello ione mobilità QTOF

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

Time-resolved Photophysical Characterization of Triplet-harvesting Organic Compounds at an Oxygen-free Environment Using an iCCD Camera

Tempo-risolta caratterizzazione fotofisica di tripletto-raccoglitrici composti organici a un utilizzo di ambiente privo di ossigeno un iCCD telecamera

Here, we present a sensible method of the acquisition and analysis of time-resolved photoluminescence using an ultrafast iCCD camera. This system enables ...

DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

DNA-magnetoscopico associazione analisi di dispersione della luce dinamica ed elettroforetica

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in an Efficient Way in Plants

Co-espressione delle proteine chimeriche fluorescenti Fusion Multiple in modo efficiente nelle piante

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent ...

Photoelectron Imaging of Anions Illustrated by 310 Nm Detachment of F&#8722;

Photoelectron Imaging of Anions Illustrated by 310 Nm Detachment of FÃƒÆ’Ã‚Â¢Ãƒâ€¹Ã¢â‚¬Â '

Imaging di fotoelettroni di anioni illustrato da 310 Nm distaccamento di F−

Anion photoelectron imaging is a very efficient method for the study of energy states of bound negative ions, neutral species and interactions of unbound ...

Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers

Miglioramento di estrusione ad alta viscosità di microcristalli per Time-resolved Serial Femtosecond cristallografia a raggi x laser

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray ...

Millisecondo conformazionali Variazioni proteine ​​risolti dal Photothermal Rinvio del raggio

Millisecondo conformazionali Variazioni proteine risolti dal Photothermal Rinvio del raggio