Name: submillisecond conformational changes in proteins resolved by photothermal beam deflection
Uploaded: 2014-02-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection at JoVE.com

この作品は、全米科学財団（MCB 1021831、JM）とJ.＆E.生物医学研究プログラム（保健フロリダ部、JM）によってサポートされていました。

1。試料調製<ol><li>サンプル調製、不要なアンケージングを防ぐために、暗室内のすべてのサンプル操作を行ってください。 </li><li> 50 mMのHEPESでN、N、N &#39;、N&#39; -テトラキス[（オキシカルボニル）メチル] -1,2 -エタンジアミン） - （2 -ニトロ-4,5 -ジメトキシフェニル） - DM-nitrophen（（1を可溶化バッファー、100mMのKCl、400μMの最終濃度pHは7.0（ε350nmで = 4330 M -1 cm -1の<sup...

<ol>
	<li>Gensch, T., Viappiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+photothermal+methods:+accessing+time-resolved+thermodynamics+of+photoinduced+processes+in+chemistry+and+biology.">Time-resolved photothermal methods: accessing time-resolved thermodynamics of photoinduced processes in chemistry and biology.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 2, 699-721 (2003).</li><li>Larsen, R. W., Mik&#353;ovsk&#225;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+resolved+thermodynamics+of+ligand+binding+to+heme+proteins.">Time resolved thermodynamics of ligand binding to heme proteins.</a> Coord. Chem. Rev. 251 (9-10), 1101-1127 (2007).</li><li>Westrick, J. A., Peters, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoacoustic+calorimetric+study+of+horse+myoglobin.">A photoacoustic calorimetric study of horse myoglobin.</a> Bioph. Chem. 37 (1-3), 73-79 (1990).</li><li>Belogortseva, N., Rubio, M., Terrell, W., Miksovska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+heme+propionate+groups+to+the+conformational+dynamics+associated+with+CO+photodissociation+from+horse+heart+myoglobin.">The contribution of heme propionate groups to the conformational dynamics associated with CO photodissociation from horse heart myoglobin.</a> J. Inorg. Biochem. 101 (7), 977-986 (2007).</li><li>Mik&#353;ovsk&#225;, J., Suquet, C., Satterlee, J. D., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Conformational+Changes+Coupled+to+Ligand+Photodissociation+from+the+Heme+Binding+Domain+of+FixL.">Characterization of Conformational Changes Coupled to Ligand Photodissociation from the Heme Binding Domain of FixL.</a> Biochemistry. 44 (30), 10028-10036 (2005).</li><li>Miksovska, J., Gennis, R. B., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photothermal+studies+of+CO+photodissociation+from+mixed+valence+Escherichia+coli+cytochrome+bo3.">Photothermal studies of CO photodissociation from mixed valence Escherichia coli cytochrome bo3.</a> FEBS Lett. 579 (14), 3014-3018 (2005).</li><li>Losi, A., Michler, I., G&#228;rtner, W., Braslavsky, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+Thermodynamic+Changes+Photoinduced+in+5,12-trans-locked+Bacteriorhodopsin.+Evidence+that+Retinal+Isomerization+is+Required+for+Protein+Activation.">Time-resolved Thermodynamic Changes Photoinduced in 5,12-trans-locked Bacteriorhodopsin. Evidence that Retinal Isomerization is Required for Protein Activation.</a> Photochem. Photobiol. 72, 590-597 (2000).</li><li>Kondoh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-Induced+Conformational+Changes+in+Full-Length+Arabidopsis+thaliana+Cryptochrome.">Light-Induced Conformational Changes in Full-Length Arabidopsis thaliana Cryptochrome.</a> J. Mol. Biol. 413 (1), 128-137 (2011).</li><li>Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolabile+chelators+for+the+rapid+photorelease+of+divalent+cations.">Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (17), 6571-6575 (1988).</li><li>Eisenberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equation+for+the+Refractive+Index+of+Water.">Equation for the Refractive Index of Water.</a> J. Chem. Phys. 43 (11), 3887-3892 (1965).</li><li>Ellis-Davies, G. C., Kaplan, J. H., Barsotti, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+photolysis+of+caged+calcium:+rates+of+calcium+release+by+nitrophenyl-EGTA+and+DM-nitrophen.">Laser photolysis of caged calcium: rates of calcium release by nitrophenyl-EGTA and DM-nitrophen.</a> Biophys. J. 70, 1006-1016 (1996).</li><li>Miksovska, J., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationships+in+metalloproteins.">Structure-function relationships in metalloproteins.</a> Methods Enzymol. 360, 302-329 (2003).</li><li>Miksovska, J., Norstrom, J., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+profiles+for+CO+photodissociation+from+heme+model+compounds:+effect+of+proximal+ligands.">Thermodynamic profiles for CO photodissociation from heme model compounds: effect of proximal ligands.</a> Inorg. Chem. 44 (4), 1006-1014 (2005).</li><li>Dhulipala, G., Rubio, M., Michael, K., Miksovska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+profile+for+urea+photo-release+from+a+N-(2-nitrobenzyl)+caged+urea+compound.">Thermodynamic profile for urea photo-release from a N-(2-nitrobenzyl) caged urea compound.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 8, 1157-1163 (2009).</li></ol>

光熱方法の背後にある物理的な原理は、光励起分子は周囲の溶剤1,12の熱加熱で、その結果、基底状態に振動緩和を経由して余分なエネルギーを消費するということです。水などの溶媒の場合、これは急激な体積膨張（ΔVth）を生成する。励起状態の分子はまた、結合開裂/形成および/ ​​または分子の（ファンデ、すなわち変化の分子の大きさを変えることができる分...

このような光音響熱量測定、光熱ビーム偏向（PDB）、およびナノ秒レーザー励起で結合された過渡回折格子などの光熱方法は、短寿命中間体1,2の時間分解研究のための過渡光分光法への強力な代替物である。そのような過渡吸収及びIR分光法などの光学技術とは対照的に、それは周囲の発色団の吸収変化の時間プロファイルを監視、光熱技術は、熱/体積変化の時間依存性を検出し、したがって、光学の時間プロファイルを調べるための貴重なツールである「サイレント」のプロセス。これまでのところ、光音響熱量測定および過渡回折格子が正常グロビン3,4、酸素センサータンパク質とリガンドの相互作用における二原子リガンドの移行を含む光誘起プロセスのコンホメーションのダイナミクスを研究するために適用されているFixL 5、6オキシダーゼ電子とヘム-銅におけるプロトン輸送AND光化学系IIだけでなく、ロドプシン7とクリプトクロム8の立体構造力学の光異性化。 内部発色団および/またはフルオロフォアを欠いている生物学的システムへの光熱技術の適用を拡大するため、PBD技術は依存して、光トリガにケージド化合物を用い、数マイクロ秒以内に、リガンド/基質濃度の増加またはより速いと組み合わせたケージド化合物に関する。このアプローチは、ダイナミクスと内部フルオロフォアまたは発色団を欠いていると商業ストップフロー機器からはアクセスできませんタイムスケール上にあるタンパク質に結合するリガンド/基質に関連する構造変化のエネルギー論のモニタリングを可能にする。ここではダウンニューロンのカルシウムセンサーのC末端ドメインにケージ化合物の熱力学を監視するためのPBDのアプリケーション、Ca 2 +のDM-nitrophen、光切断だけでなく、Ca 2 +の関連についての動態ストリーム調節エレメント拮抗モジュレータ（DREAM）が提示されている。 Ca 2 +を、光にリリース〜300秒の時定数でunphotolysedケージにCa 2 +を 10秒と再バインド内のDM-nitrophenからのものである。一方、apoDREAMの存在下で、ミリ秒の時間スケールで発生する追加の運動を観察し、タンパク質へのリガンド結合を反映している。生物系の高次構造遷移をプローブするPBDの適用は、何らかの形で楽器の難しさのために制限されている、強力かつ再現性のPBD信号を達成するためのプローブとポンプ光の例えば骨の折れる整列。しかし、計測機器のセットアップの綿密な設計、温度の正確な制御、およびプローブとポンプ光の慎重な位置合わせは、広範な上、時間分解体積とエンタルピー変化のモニタリングを可能にする一貫性と堅牢PBD信号を提供10秒で約200ミリ秒の時間スケール。また、modificなど 、同一温度、緩衝液組成、光学セルの向き、レーザパワー、下のサンプルとリファレンストレースの検出を確実にする実験手順の管理ポイントを大幅に測定された反応容量およびエンタルピーでの実験誤差を低減します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="639">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col /> 
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-N,N,N&#39;,N&#39;-Tetraacetic Acid</td>
			<td style="width:84px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D-6814</td>
			<td style="width:220px;">DM-nitrophen, cage calcium compound, keep stock solutions in dark to prevent photodissociation,</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid)</td>
			<td style="width:84px;">Sigma Adrich</td>
			<td>0909C</td>
			<td>HEPES buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Potassium ferricyanide(III)</td>
			<td style="width:84px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">702587</td>
			<td style="width:220px;">reference compound for PBD measurments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"> </td>
			<td style="width:84px;"> </td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td style="width:220px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sodium chromate</td>
			<td style="width:84px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">307831</td>
			<td style="width:220px;">reference compound for PBD measurments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">He-Ne Laser Diode 5mW 635nm </td>
			<td style="width:84px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:119px;">54-179</td>
			<td style="width:220px;">use as a probe beam for PBD measurments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Oscilloscope, </td>
			<td style="width:84px;">LeCroy</td>
			<td style="width:119px;">Wave Surfer 42Xs</td>
			<td style="width:220px;">400 MHz bandwith</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nd:YAG laser</td>
			<td style="width:84px;">Continuum</td>
			<td style="width:119px;">ML II</td>
			<td>pump beam for PBD measurments</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:216px;">M355; Nd:YAG laser mirror</td>
			<td style="width:84px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:119px;">47-324</td>
			<td>laser mirror for 355 nm laser line</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:216px;">M1 and M2; Laser diode mirror</td>
			<td style="width:84px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:119px;">43-532</td>
			<td>visilbe laser flat mirror, wavelength range 300-700 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">P1 and P2; Iris Diaphragm</td>
			<td style="width:84px;">Edmind Optics</td>
			<td style="width:119px;">62-649</td>
			<td style="width:220px;">pin hole to shape the probe and pum beams</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">L1; bi-convex lens</td>
			<td style="width:84px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:119px;">LB1844</td>
			<td style="width:220px;">a lens to focus the probe beam at the detector, EFL 50 mm, wavelength range 350 - 2000 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DM, dichroic mirror</td>
			<td style="width:84px;">Thorlab </td>
			<td style="width:119px;">DMLP505</td>
			<td style="width:220px;">a longpass dichroic mirror with a cutoff wavelength of 505 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">F1; Edge filter</td>
			<td style="width:84px;">Andower </td>
			<td style="width:119px;">500FH90-25</td>
			<td>a long pass filter with a cutoff wavelength of 500 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Temperature-controlled cuvette holder</td>
			<td style="width:84px;">Quantum Northwest</td>
			<td style="width:119px;">FLASH 300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

submillisecond conformational changes in proteins resolved by photothermal beam deflection

一緒に光音響熱量測定および熱格子と光熱ビーム偏向は、伝統的なストップを使用してアクセスできない時間スケールをミリ秒、マイクロ秒でのタンパク質の立体構造変化を誘起光の時間プロファイルボリュームとエンタルピー変化を監視する光熱方法のファミリーに属するフローの楽器。さらに、体積および/またはエンタルピーの全体的な変化がプローブされているので、これらの技術は、タンパク質およびフルオロフォアおよび発色団又はラベルを欠く他の生体高分子に適用することができる。カルシウムトランスデューサ、このような神経細胞のカルシウムセンサー、ケージカルシウム化合物、DM-nitrophenへの結合のCa 2 +に関連した構造変化のダイナミクスとエネルギー論を監視するには、フォトトリガーに遊離カルシウムの急速な（τ&lt;20秒）増加して採用されている濃度及び関連するボリュームとエンタルピー変化は、光熱ビーム偏向技術を用いてプローブする。

PBDの代表的な例は、Ca 2 + DM-nitrophenからのCa 2 +放出光は、図3に示されているトレース。遅い位相がCA 2 + nonphotolysedケージとの結合を反映しているのに対し、FASTフェーズは、Ca 2 +のDM は 、nitrophenおよびCa 2 +の解放の光切断に対応しています。温度依存係数[C のpρ/（のdn / dt）が〕の関数として基準化合物の大きさにスケーリ...

Watch this Scientific Journal Video about Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection at JoVE.com

Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection

ここでは、下流の調節エレメント拮抗モジュレータ、マイクロ秒およびミリ秒ダイナミクスおよびニューロンカルシウムセンサーへのカルシウムアソシエーションに関連付けられている構造変化のエネルギー論をモニターするために、DM-nitrophen、ケージドカルシウム化合物と組み合わせて光熱ビーム偏向技術の適用を報告。

光熱ビーム偏向によって分離したタンパク質におけるミリ秒以下構造変化

Photothermal beam deflection together with photo-acoustic calorimetry and thermal grating belongs to the family of photothermal methods that monitor the ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Chemistry

Biology

Physics

Fundamentals

Unit 1

The First Law of Thermodynamics

Macromolecules

SCIENTISTS IN ACTION

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

蛍光ベースの氷面アフィニティーによる不凍タンパク質の氷結合平面の決定

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

The Use of Gas Chromatography to Analyze Compositional Changes of Fatty Acids in Rat Liver Tissue during Pregnancy

妊娠中にラット肝組織中の脂肪酸の組成変化を分析するために、ガスクロマトグラフィーの使用

Gas chromatography (GC) is a highly sensitive method used to identify and quantify the fatty acid content of lipids from tissues, cells, and plasma/serum, ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

高速液体クロマトグラフィー結合フローシンチレーションにより放射性標識およびホスホイノシチドの細胞レベルの定量化

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

サルヴィとTOF-SIMSによる水中で水和タンパク質のその場キャラクタリゼーションで

This work demonstrates in situ characterization of protein biomolecules in the aqueous solution using the System for Analysis at the Liquid Vacuum ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

液体クロマトグラフィーによるイオン移動 QTOF 質量分析法によるタンパク質のバイオ医薬品の宿主細胞蛋白質の定量化のための HS MRM アッセイ

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

Time-resolved Photophysical Characterization of Triplet-harvesting Organic Compounds at an Oxygen-free Environment Using an iCCD Camera

時間分解光物性評価のトリプレット収穫有機化合物無酸素環境使用、iCCD カメラ

Here, we present a sensible method of the acquisition and analysis of time-resolved photoluminescence using an ultrafast iCCD camera. This system enables ...

DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

バインドの動的・電気泳動光散乱による解析 DNA 磁性粒子

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in an Efficient Way in Plants

植物の効率的な方法で複数のキメラ蛍光融合タンパク質の共発現

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent ...

Photoelectron Imaging of Anions Illustrated by 310 Nm Detachment of F&#8722;

Photoelectron Imaging of Anions Illustrated by 310 Nm Detachment of FÃƒÆ’Ã‚Â¢Ãƒâ€¹Ã¢â‚¬Â '

F− 310 Nm 剥離によって示されている陰イオンの光電子イメージング

Anion photoelectron imaging is a very efficient method for the study of energy states of bound negative ions, neutral species and interactions of unbound ...

Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers

微結晶の時間分解フェムト秒シリアル結晶学 x 線レーザーのための高粘度押出を改善

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray ...