Name: submillisecond conformational changes in proteins resolved by photothermal beam deflection
Uploaded: 2014-02-18T13:00:00
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이 작품은 국립 과학 재단 (MCB 1,021,831, JM)와 J. &amp; E. 바이오 메디컬 연구 프로그램 (건강의 플로리다학과, JM)에 의해 지원되었다.

1. 샘플 준비 <ol><li> 샘플 준비하고 원하지 않는 uncaging을 방지하기 위해 어두운 방에있는 모든 샘플 조작을 수행하십시오. </li><li> 50 mM의 HEPES에 N, N, N &#39;, N&#39;- 테트라 키스 [(옥시 카르 보닐) 메틸] -1,2 - 에탄 디아민) - (2 - 니트로 -4,5 - 디메 톡시 페닐) - DM-nitrophen ((1 가용화 버퍼, 100 ㎜의 KCl, 400 μM의 최종 농도로 pH를 7.0 (= 350 ㎚ ε 4,330 M -1 cm -1 9). </li><li> [DM-nitrophe...

<ol>
	<li>Gensch, T., Viappiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+photothermal+methods:+accessing+time-resolved+thermodynamics+of+photoinduced+processes+in+chemistry+and+biology.">Time-resolved photothermal methods: accessing time-resolved thermodynamics of photoinduced processes in chemistry and biology.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 2, 699-721 (2003).</li><li>Larsen, R. W., Mik&#353;ovsk&#225;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+resolved+thermodynamics+of+ligand+binding+to+heme+proteins.">Time resolved thermodynamics of ligand binding to heme proteins.</a> Coord. Chem. Rev. 251 (9-10), 1101-1127 (2007).</li><li>Westrick, J. A., Peters, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoacoustic+calorimetric+study+of+horse+myoglobin.">A photoacoustic calorimetric study of horse myoglobin.</a> Bioph. Chem. 37 (1-3), 73-79 (1990).</li><li>Belogortseva, N., Rubio, M., Terrell, W., Miksovska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+heme+propionate+groups+to+the+conformational+dynamics+associated+with+CO+photodissociation+from+horse+heart+myoglobin.">The contribution of heme propionate groups to the conformational dynamics associated with CO photodissociation from horse heart myoglobin.</a> J. Inorg. Biochem. 101 (7), 977-986 (2007).</li><li>Mik&#353;ovsk&#225;, J., Suquet, C., Satterlee, J. D., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Conformational+Changes+Coupled+to+Ligand+Photodissociation+from+the+Heme+Binding+Domain+of+FixL.">Characterization of Conformational Changes Coupled to Ligand Photodissociation from the Heme Binding Domain of FixL.</a> Biochemistry. 44 (30), 10028-10036 (2005).</li><li>Miksovska, J., Gennis, R. B., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photothermal+studies+of+CO+photodissociation+from+mixed+valence+Escherichia+coli+cytochrome+bo3.">Photothermal studies of CO photodissociation from mixed valence Escherichia coli cytochrome bo3.</a> FEBS Lett. 579 (14), 3014-3018 (2005).</li><li>Losi, A., Michler, I., G&#228;rtner, W., Braslavsky, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+Thermodynamic+Changes+Photoinduced+in+5,12-trans-locked+Bacteriorhodopsin.+Evidence+that+Retinal+Isomerization+is+Required+for+Protein+Activation.">Time-resolved Thermodynamic Changes Photoinduced in 5,12-trans-locked Bacteriorhodopsin. Evidence that Retinal Isomerization is Required for Protein Activation.</a> Photochem. Photobiol. 72, 590-597 (2000).</li><li>Kondoh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-Induced+Conformational+Changes+in+Full-Length+Arabidopsis+thaliana+Cryptochrome.">Light-Induced Conformational Changes in Full-Length Arabidopsis thaliana Cryptochrome.</a> J. Mol. Biol. 413 (1), 128-137 (2011).</li><li>Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolabile+chelators+for+the+rapid+photorelease+of+divalent+cations.">Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (17), 6571-6575 (1988).</li><li>Eisenberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equation+for+the+Refractive+Index+of+Water.">Equation for the Refractive Index of Water.</a> J. Chem. Phys. 43 (11), 3887-3892 (1965).</li><li>Ellis-Davies, G. C., Kaplan, J. H., Barsotti, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+photolysis+of+caged+calcium:+rates+of+calcium+release+by+nitrophenyl-EGTA+and+DM-nitrophen.">Laser photolysis of caged calcium: rates of calcium release by nitrophenyl-EGTA and DM-nitrophen.</a> Biophys. J. 70, 1006-1016 (1996).</li><li>Miksovska, J., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationships+in+metalloproteins.">Structure-function relationships in metalloproteins.</a> Methods Enzymol. 360, 302-329 (2003).</li><li>Miksovska, J., Norstrom, J., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+profiles+for+CO+photodissociation+from+heme+model+compounds:+effect+of+proximal+ligands.">Thermodynamic profiles for CO photodissociation from heme model compounds: effect of proximal ligands.</a> Inorg. Chem. 44 (4), 1006-1014 (2005).</li><li>Dhulipala, G., Rubio, M., Michael, K., Miksovska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+profile+for+urea+photo-release+from+a+N-(2-nitrobenzyl)+caged+urea+compound.">Thermodynamic profile for urea photo-release from a N-(2-nitrobenzyl) caged urea compound.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 8, 1157-1163 (2009).</li></ol>

광열 방법 뒤에 물리적 원리는 광 여기 분자 주위 용매 1,12 열적 가열의 결과, 바닥 상태로 이완 진동을 통해 과량의 에너지를 소산이다. 물과 같은 용매, 이것은 급격한 체적 팽창 (ΔV 번째)를 생성한다. 여기 상태의 분자 인해 결합 벽개 / 형성 및 / 또는 분자 (들) (반 데르 소재 즉 변화의 분자 크기를 변경할 수있는 분자 구조의 변화에 비열 부피 변화 (ΔV의 nonth) 발...

이러한 광 음향 열량, 광열 빔 편향 (PDB) 및 나노초 레이저 여기와 결합 과도 격자로 광열 방법은 일시적인 중간체 1,2의 시간 분해 연구를위한 광학 분광기를 과도 할 수있는 강력한 대안을 나타냅니다. 이러한 과도 흡수 및 IR 분광법 등의 광학 기법과 대조적으로, 그 주위의 발색단의 흡수 변화의 시간 프로파일을 모니터링; 광열 기술은 광학적으로의 시간 프로파일을 조사 할 가치있는 도구를 히트 / 부피 변화의 시간 의존성을 감지하고, 따라서 아르 &quot;침묵&quot;처리합니다. 지금까지, 광 음향 열량 과도 격자가 성공적으로 글로빈 3,4, 산소 센서 단백질과 리간드의 상호 작용에 이원자 리간드의 마이그레이션을 포함하여 사진에 의한 프로세스의 구조적 역학을 연구하기 위해 적용되었습니다 FixL 5, 6 산화 효소 전자와 헴 - 구리의 양자 전송차 광계 II뿐만 아니라 로돕신 7 크립토 8 구조적 역학의 광 이성화. 내부 발색단 및 / 또는 형광 물질이 결여되어 생물학적 시스템에 광열 기술의 애플리케이션을 확장, PBD 기법 따라 광 트리거 갇힌 화합물의 용도 몇 마이크로 초 내에 리간드 / 기질 농도의 증가와 함께 또는 빠른 결합시켰다 갇힌 화합물에. 이 방법은 수있는 리간드 / 기판 내부 형광 또는 발색단 부족한 단백질 및 상업 정지 흐름 악기로 액세스 할 수없는 시간 규모에 바인딩과 관련된 구조적인 변화의 역학과 에너지 부문의 모니터링. 여기 케이지 화합물, 칼슘의 열역학 2 + DM-nitrophen, 사진 - 분열뿐만 아니라 신경 세포의 칼슘 센서의 C-말단 도메인에 칼슘 2 + 협회에 대한 반응 속도 아래로 모니터링 할 PBD의 응용 프로그램스트림 규제 요소 길항제 변조기 (DREAM)가 제공됩니다. CA는 2 +는 10 마이크로 초 이내에 사진 출시 된 CA로부터 2 + DM-nitrophen하고 ~ 300 마이크로 초의 시간 상수 unphotolysed 케이지에 다시 바인딩합니다. 한편, apoDREAM의 존재 밀리 초의 시간 단위로 발생하는 추가적인 운동은 관찰하고 단백질에 결합하는 리간드를 반영한​​다. 생물학적 시스템의 구조적 전환을 조사하는 PBD의 응용 프로그램은 어떻게 든 수단의 어려움으로 인해 제한되었습니다; 강력하고 재현 PBD 신호를 달성하기 위해 프로브와 펌프 빔의 예를 들어 힘든 정렬. 그러나, 계측 셋업의 세심한 디자인, 온도의 정확한 제어, 및 프로브 및 펌프 광의 조심 배향 광범위에 시분 볼륨 및 엔탈피 변화의 모니터링을 허용 일관되고 견고한 PBD 신호를 제공 10 마이크로 초 약 200 밀리 초까지 시간 규모. 또한, modific에서등 동일한 온도, 버퍼 구성, 광 셀 방향, 레이저 파워, 아래 샘플과 참조 흔적의 검출을 보장하기 위해 실험 절차의 관리 포인트는 크게 측정 반응 볼륨과 열량의 실험 오차를 줄일 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="639">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col /> 
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-N,N,N&#39;,N&#39;-Tetraacetic Acid</td>
			<td style="width:84px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D-6814</td>
			<td style="width:220px;">DM-nitrophen, cage calcium compound, keep stock solutions in dark to prevent photodissociation,</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid)</td>
			<td style="width:84px;">Sigma Adrich</td>
			<td>0909C</td>
			<td>HEPES buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Potassium ferricyanide(III)</td>
			<td style="width:84px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">702587</td>
			<td style="width:220px;">reference compound for PBD measurments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"> </td>
			<td style="width:84px;"> </td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td style="width:220px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sodium chromate</td>
			<td style="width:84px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">307831</td>
			<td style="width:220px;">reference compound for PBD measurments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">He-Ne Laser Diode 5mW 635nm </td>
			<td style="width:84px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:119px;">54-179</td>
			<td style="width:220px;">use as a probe beam for PBD measurments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Oscilloscope, </td>
			<td style="width:84px;">LeCroy</td>
			<td style="width:119px;">Wave Surfer 42Xs</td>
			<td style="width:220px;">400 MHz bandwith</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nd:YAG laser</td>
			<td style="width:84px;">Continuum</td>
			<td style="width:119px;">ML II</td>
			<td>pump beam for PBD measurments</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:216px;">M355; Nd:YAG laser mirror</td>
			<td style="width:84px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:119px;">47-324</td>
			<td>laser mirror for 355 nm laser line</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:216px;">M1 and M2; Laser diode mirror</td>
			<td style="width:84px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:119px;">43-532</td>
			<td>visilbe laser flat mirror, wavelength range 300-700 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">P1 and P2; Iris Diaphragm</td>
			<td style="width:84px;">Edmind Optics</td>
			<td style="width:119px;">62-649</td>
			<td style="width:220px;">pin hole to shape the probe and pum beams</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">L1; bi-convex lens</td>
			<td style="width:84px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:119px;">LB1844</td>
			<td style="width:220px;">a lens to focus the probe beam at the detector, EFL 50 mm, wavelength range 350 - 2000 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DM, dichroic mirror</td>
			<td style="width:84px;">Thorlab </td>
			<td style="width:119px;">DMLP505</td>
			<td style="width:220px;">a longpass dichroic mirror with a cutoff wavelength of 505 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">F1; Edge filter</td>
			<td style="width:84px;">Andower </td>
			<td style="width:119px;">500FH90-25</td>
			<td>a long pass filter with a cutoff wavelength of 500 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Temperature-controlled cuvette holder</td>
			<td style="width:84px;">Quantum Northwest</td>
			<td style="width:119px;">FLASH 300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

submillisecond conformational changes in proteins resolved by photothermal beam deflection

함께 사진 음향 열량 및 열 격자와 광열 빔 편향은 기존의 정지를 사용하여 액세스 할 수없는 시간 규모를 밀리 초 단위로 마이크로에 단백질의 구조적 변화를 유도 빛의 시간 프로파일 볼륨과 엔탈피 변화를 모니터링 광열 방법의 가족에 속한다 흐름 악기. 양 및 / 또는 전체적인 엔탈피 변화가 프로빙 때문에 또한, 이들 기술은 형광 물질과 또는 발색단 라벨 부족한 단백질 및 다른 생체 고분자에 적용 할 수있다. 칼슘과 관련된 구조적인 변화의 역학과 에너지 부문을 모니터링하려면 + 칼슘 트랜스 듀서, 이러한 신경 세포의 칼슘 센서, 갇힌 칼슘 화합물, DM-nitrophen, 사진 트리거에게 무료로 칼슘의 빠른 (τ &lt;20 마이크로 초) 증가 채용에 바인딩 농도와 연관된 부피 및 엔탈피 변화는 광열 편향 빔 기술을 이용하여 조사됩니다.

PBD의 대표적인 예는 칼슘 2 +의 DM-nitrophen에서 칼슘 2 + 사진 방출에 대한 추적은 그림 3에서 볼 수 있습니다. 느린 단계는 칼슘 2 + nonphotolysed 케이지에 바인딩을 반영하는 반면, 빠른 단계는 칼슘 2 +의 DM-nitrophen 및 CA 2 + 해방의 사진 - 분열에 해당합니다. 온도 의존 인자 [C의 P의 ρ / (DN / DT)]의 함수로서 기준 화합물의 진폭을 확장 빠르고...

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Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection

여기에서 우리는 마이크로 및 밀리 역학 및 신경원 칼슘 센서 하류 조절 요소 길항제 변조기 칼슘 연관과 관련된 구조적 변경의 지학을 모니터링 갇힌 칼슘 화합물, DM-nitrophen과 조합 광열 빔 편향 기술의 응용을보고 .

광열 편향 빔에 의해 해결 단백질의 밀리 초 이하의 구조적 변화

Photothermal beam deflection together with photo-acoustic calorimetry and thermal grating belongs to the family of photothermal methods that monitor the ...

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