Name: submillisecond conformational changes in proteins resolved by photothermal beam deflection
Uploaded: 2014-02-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation (MCB 1.021.831, JM) og J. &amp; E. Biomedical Research Program (Florida Department of Health, JM).

En. Eksempel Forberedelser <ol><li> Gjennomføre prøveopparbeidelse og alle prøve manipulasjoner i et mørkt rom for å hindre en uønsket uncaging. </li><li> Solubilisere DM-nitrophen ((1 - (2-nitro-4 ,5-dimetoksyfenyl) - N, N, N &#39;, N&#39;-tetrakis-[(oksy-karbonyl)-metyl] -1,2-etandiamin) i 50 mM HEPES buffer, 100 mM KCl, pH 7,0 til en endelig konsentrasjon på 400 pM (ε 350nm = 4,330 M -1 cm -1 9). </li><li> Legg CaCl 2 fra 0,1 M stamløsning for å oppnå ...

<ol>
	<li>Gensch, T., Viappiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+photothermal+methods:+accessing+time-resolved+thermodynamics+of+photoinduced+processes+in+chemistry+and+biology.">Time-resolved photothermal methods: accessing time-resolved thermodynamics of photoinduced processes in chemistry and biology.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 2, 699-721 (2003).</li><li>Larsen, R. W., Mik&#353;ovsk&#225;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+resolved+thermodynamics+of+ligand+binding+to+heme+proteins.">Time resolved thermodynamics of ligand binding to heme proteins.</a> Coord. Chem. Rev. 251 (9-10), 1101-1127 (2007).</li><li>Westrick, J. A., Peters, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoacoustic+calorimetric+study+of+horse+myoglobin.">A photoacoustic calorimetric study of horse myoglobin.</a> Bioph. Chem. 37 (1-3), 73-79 (1990).</li><li>Belogortseva, N., Rubio, M., Terrell, W., Miksovska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+heme+propionate+groups+to+the+conformational+dynamics+associated+with+CO+photodissociation+from+horse+heart+myoglobin.">The contribution of heme propionate groups to the conformational dynamics associated with CO photodissociation from horse heart myoglobin.</a> J. Inorg. Biochem. 101 (7), 977-986 (2007).</li><li>Mik&#353;ovsk&#225;, J., Suquet, C., Satterlee, J. D., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Conformational+Changes+Coupled+to+Ligand+Photodissociation+from+the+Heme+Binding+Domain+of+FixL.">Characterization of Conformational Changes Coupled to Ligand Photodissociation from the Heme Binding Domain of FixL.</a> Biochemistry. 44 (30), 10028-10036 (2005).</li><li>Miksovska, J., Gennis, R. B., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photothermal+studies+of+CO+photodissociation+from+mixed+valence+Escherichia+coli+cytochrome+bo3.">Photothermal studies of CO photodissociation from mixed valence Escherichia coli cytochrome bo3.</a> FEBS Lett. 579 (14), 3014-3018 (2005).</li><li>Losi, A., Michler, I., G&#228;rtner, W., Braslavsky, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+Thermodynamic+Changes+Photoinduced+in+5,12-trans-locked+Bacteriorhodopsin.+Evidence+that+Retinal+Isomerization+is+Required+for+Protein+Activation.">Time-resolved Thermodynamic Changes Photoinduced in 5,12-trans-locked Bacteriorhodopsin. Evidence that Retinal Isomerization is Required for Protein Activation.</a> Photochem. Photobiol. 72, 590-597 (2000).</li><li>Kondoh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-Induced+Conformational+Changes+in+Full-Length+Arabidopsis+thaliana+Cryptochrome.">Light-Induced Conformational Changes in Full-Length Arabidopsis thaliana Cryptochrome.</a> J. Mol. Biol. 413 (1), 128-137 (2011).</li><li>Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolabile+chelators+for+the+rapid+photorelease+of+divalent+cations.">Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (17), 6571-6575 (1988).</li><li>Eisenberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equation+for+the+Refractive+Index+of+Water.">Equation for the Refractive Index of Water.</a> J. Chem. Phys. 43 (11), 3887-3892 (1965).</li><li>Ellis-Davies, G. C., Kaplan, J. H., Barsotti, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+photolysis+of+caged+calcium:+rates+of+calcium+release+by+nitrophenyl-EGTA+and+DM-nitrophen.">Laser photolysis of caged calcium: rates of calcium release by nitrophenyl-EGTA and DM-nitrophen.</a> Biophys. J. 70, 1006-1016 (1996).</li><li>Miksovska, J., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationships+in+metalloproteins.">Structure-function relationships in metalloproteins.</a> Methods Enzymol. 360, 302-329 (2003).</li><li>Miksovska, J., Norstrom, J., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+profiles+for+CO+photodissociation+from+heme+model+compounds:+effect+of+proximal+ligands.">Thermodynamic profiles for CO photodissociation from heme model compounds: effect of proximal ligands.</a> Inorg. Chem. 44 (4), 1006-1014 (2005).</li><li>Dhulipala, G., Rubio, M., Michael, K., Miksovska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+profile+for+urea+photo-release+from+a+N-(2-nitrobenzyl)+caged+urea+compound.">Thermodynamic profile for urea photo-release from a N-(2-nitrobenzyl) caged urea compound.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 8, 1157-1163 (2009).</li></ol>

Den fysiske prinsippet bak fototermiske metoder er at en foto-spent molekyl avleder overskytende energi via vibrasjons avkobling til grunntilstanden resulterer i termisk oppvarming av den omkringliggende oppløsningsmiddel 1,12. For løsningsmidler som vann, gir dette en hurtig volumøkning (ΔV th). Spent-statlige molekyler kan også gjennomgå fotokjemiske prosesser som resulterer i ikke-termiske volumendringer (ΔV nonth) på grunn av bindingen spalting / formasjon og / eller endringe...

Bilde-termiske metoder som fotoakustisk kalorimetri, photothermal stråleavbøyningsspeil (PDB), og forbigående rist kombinert med nanosekund laser eksitasjon representerer et kraftig alternativ til forbigående optiske spectroscopies for tid-løst studier av kortvarige mellom 1,2. I motsetning til optiske teknikker, slik som transient absorpsjon og IR-spektroskopi, som overvåker tidsprofilen for absorpsjon endringer i kromofor omkring; photothermal teknikker detektere den tidsavhengighet av varme / volumendringer og derfor er verdifulle verktøy for å undersøke tidsprofiler av optisk &quot;stille&quot; prosesser. Så langt har fotoakustiske kalorimetri og forbigående rist blitt brukt til å studere conformational dynamikken i foto-indusert prosesser, inkludert diatomic ligand migrasjon i globins 3,4, ligand interaksjoner med oksygen sensor protein FixL 5, elektron og proton transport i heme-kobber oksidase 6 ennd photo II samt foto-isomerization i rhodopsin 7 og conformational dynamikk i cryptochrome åtte. For å utvide anvendelsen av fototermiske teknikker til biologiske systemer som mangler en intern kromofor og / eller fluorofor, ble PBD teknikk i kombinasjon med bruken av bur forbindelsen til foto-trigger en økning av ligand / substrat-konsentrasjon i løpet av noen få mikrosekunder eller raskere, avhengig på bur sammensatte. Denne tilnærmingen tillater overvåking av dynamikk og energetics av ​​strukturelle endringer knyttet til ligand / substrat binding til proteiner som mangler en intern fluoroforen eller kromofor og på tidsskala som ikke er tilgjengelig med kommersielle stop-flow instrumenter. Her en anvendelse av PBD å overvåke termodynamikk av buret forbindelsen, Ca 2 + DM-nitrophen, foto-spaltning, så vel som kinetikken for Ca 2 + tilknytning til det C-terminale domene av de neuronale kalsium sensor nedstream Regulatory Element Antagonist Modulator (DREAM) er presentert. Ca 2 + er foto løslatt fra Ca 2 + DM-nitrophen innen 10 usekunder og rebinds til en unphotolysed bur med en tidskonstant på ~ 300 usekunder. På den annen side, i nærvær av apoDREAM en ytterligere kinetisk inntreffe på millisekund tidsskalaen er observert og reflekterer den ligand-binding til proteinet. Anvendelsen av PBD å sondere konformasjonsforandringer overganger i biologiske systemer har vært noe begrenset på grunn av de instrumentelle vanskeligheter, f.eks krevende innretting av sonden og pumpestråle for å oppnå en sterk og reproduserbar PBD signal. Imidlertid er en nitid utforming av en instrumentering set-up, en nøyaktig kontroll av temperaturen, og en forsiktig justering av sonden og pumpestråle tilveiebringe en konsistent og robust PBD signal som tillater overvåking av tidsoppløst volum-og entalpi-endring på et bredt tidsskala fra 10 usekunder til ca 200 msek. Videre modifiseringsjoner av den eksperimentelle fremgangsmåte for å sikre deteksjon av prøve-og referanse spor under identiske temperatur, buffersammensetning, optisk celle orientering, laserkraft, etc. reduserer den eksperimentelle feil i målte reaksjonsvolumer og enthalpies betydelig.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="639">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col /> 
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-N,N,N&#39;,N&#39;-Tetraacetic Acid</td>
			<td style="width:84px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D-6814</td>
			<td style="width:220px;">DM-nitrophen, cage calcium compound, keep stock solutions in dark to prevent photodissociation,</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid)</td>
			<td style="width:84px;">Sigma Adrich</td>
			<td>0909C</td>
			<td>HEPES buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Potassium ferricyanide(III)</td>
			<td style="width:84px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">702587</td>
			<td style="width:220px;">reference compound for PBD measurments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"> </td>
			<td style="width:84px;"> </td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td style="width:220px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sodium chromate</td>
			<td style="width:84px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">307831</td>
			<td style="width:220px;">reference compound for PBD measurments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">He-Ne Laser Diode 5mW 635nm </td>
			<td style="width:84px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:119px;">54-179</td>
			<td style="width:220px;">use as a probe beam for PBD measurments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Oscilloscope, </td>
			<td style="width:84px;">LeCroy</td>
			<td style="width:119px;">Wave Surfer 42Xs</td>
			<td style="width:220px;">400 MHz bandwith</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nd:YAG laser</td>
			<td style="width:84px;">Continuum</td>
			<td style="width:119px;">ML II</td>
			<td>pump beam for PBD measurments</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:216px;">M355; Nd:YAG laser mirror</td>
			<td style="width:84px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:119px;">47-324</td>
			<td>laser mirror for 355 nm laser line</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:216px;">M1 and M2; Laser diode mirror</td>
			<td style="width:84px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:119px;">43-532</td>
			<td>visilbe laser flat mirror, wavelength range 300-700 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">P1 and P2; Iris Diaphragm</td>
			<td style="width:84px;">Edmind Optics</td>
			<td style="width:119px;">62-649</td>
			<td style="width:220px;">pin hole to shape the probe and pum beams</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">L1; bi-convex lens</td>
			<td style="width:84px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:119px;">LB1844</td>
			<td style="width:220px;">a lens to focus the probe beam at the detector, EFL 50 mm, wavelength range 350 - 2000 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DM, dichroic mirror</td>
			<td style="width:84px;">Thorlab </td>
			<td style="width:119px;">DMLP505</td>
			<td style="width:220px;">a longpass dichroic mirror with a cutoff wavelength of 505 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">F1; Edge filter</td>
			<td style="width:84px;">Andower </td>
			<td style="width:119px;">500FH90-25</td>
			<td>a long pass filter with a cutoff wavelength of 500 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Temperature-controlled cuvette holder</td>
			<td style="width:84px;">Quantum Northwest</td>
			<td style="width:119px;">FLASH 300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

submillisecond conformational changes in proteins resolved by photothermal beam deflection

Photothermal stråleavbøyningsspeil sammen med foto-akustisk kalorimetri og termisk rist tilhører familien av photothermal metoder som overvåker tid profilerte volum og entalpi endringer av lys indusert konformasjonsendringer i proteiner på mikrosekund til millisekund tidsskalaer som ikke er tilgjengelige ved hjelp av tradisjonell stopp -flyt instrumenter. I tillegg, siden generelle endringer i volum og / eller entalpi blir analysert, er disse teknikker kan brukes til proteiner og andre Biomacromolecules som mangler en fluorofor og eller en kromofor etikett. Å overvåke dynamikken og energetics av strukturelle endringer knyttet til Ca 2 + binding til kalsium transdusere, slike nevrale kalsium sensorer, et bur kalsium sammensatte, DM-nitrophen, er ansatt til foto-trigger en rask (τ &lt;20 usekunder) økning i fritt kalsium konsentrasjon og den tilhørende volum-og entalpi-endring blir analysert ved hjelp av fototermiske stråleavbøyningsspeilet teknikk.

Et representativt eksempel på PBD spor for Ca 2 + foto-frigjøring fra Ca 2 + DM-nitrophen er vist i figur 3.. Den raske fasen tilsvarer bildet-spalting av Ca 2 + DM-nitrophen og Ca 2 + frigjøring, mens den langsomme fasen reflekterer Ca 2 + binding til nonphotolysed buret. Plottet av prøven PBD amplitude for den raske og langsomme fase skalert til amplituden av referanseforbindelsen som en funksjon av temperaturen avhengig faktor [C p...

Watch this Scientific Journal Video about Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection at JoVE.com

Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection

Her rapporterer vi en anvendelse av photothermal stråleavbøyningsspeil teknikk i kombinasjon med et bur kalsium sammensatte, DM-nitrophen, for å overvåke mikrosekund og millisekund dynamikk og energetics av ​​strukturelle endringer knyttet til kalsium assosiasjon til en neuronal kalsium sensor, Nedstrøms Regulatory Element Antagonist Modulator .

Submillisecond konformasjonsendring Endringer i Proteiner løst ved Photothermal bjelkenedbøying

Photothermal beam deflection together with photo-acoustic calorimetry and thermal grating belongs to the family of photothermal methods that monitor the ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Chemistry

Biology

Physics

Fundamentals

Unit 1

The First Law of Thermodynamics

Macromolecules

SCIENTISTS IN ACTION

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

Bestemme isbindende fly av frostvæskeproteiner ved fluorescensbasert isplanaffinitet

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

The Use of Gas Chromatography to Analyze Compositional Changes of Fatty Acids in Rat Liver Tissue during Pregnancy

Bruk av gasskromatografi å analysere kompositorisk Endringer av fettsyrer i Rat levervev under graviditet

Gas chromatography (GC) is a highly sensitive method used to identify and quantify the fatty acid content of lipids from tissues, cells, and plasma/serum, ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Radiomerking og Kvantifisering av Cellular Nivåer av Phosphoinositides ved HPLC-coupled Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

In Situ Karakterisering av Hydratiserte Proteiner i vann ved Salvi og TOF-SIMS

This work demonstrates in situ characterization of protein biomolecules in the aqueous solution using the System for Analysis at the Liquid Vacuum ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

HS-MRM analysen for kvantifisering av verten celle proteiner i Protein Biopharmaceuticals av flytende kromatografi Ion mobilitet QTOF massespektrometri

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

Time-resolved Photophysical Characterization of Triplet-harvesting Organic Compounds at an Oxygen-free Environment Using an iCCD Camera

Tid-løst Photophysical karakteristikk av trilling-fangst organiske forbindelser på et oksygenfri miljø ved hjelp av en iCCD kamera

Here, we present a sensible method of the acquisition and analysis of time-resolved photoluminescence using an ultrafast iCCD camera. This system enables ...

DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

DNA-magnetiske partikler bindende analyse av dynamisk og Electrophoretic lysspredning

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in an Efficient Way in Plants

Co uttrykk for flere Chimeric fluorescerende Fusion proteiner på en effektiv måte i planter

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent ...

Photoelectron Imaging of Anions Illustrated by 310 Nm Detachment of F&#8722;

Photoelectron Imaging of Anions Illustrated by 310 Nm Detachment of FÃƒÆ’Ã‚Â¢Ãƒâ€¹Ã¢â‚¬Â '

Photoelectron avbildning av anioner illustrert av 310 Nm avdeling av F−

Anion photoelectron imaging is a very efficient method for the study of energy states of bound negative ions, neutral species and interactions of unbound ...

Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers

Forbedre høy viskositet utelukkelse av Microcrystals for tid-løst føljetong Femtosecond krystallografi på røntgenlasere

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray ...