Name: submillisecond conformational changes in proteins resolved by photothermal beam deflection
Uploaded: 2014-02-18T13:00:00
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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencia (MCB 1.021.831, JM) y J. &amp; E. Programa de Investigación Biomédica (Departamento de Salud de Florida, JM).

1. Preparación de muestra <ol><li> Llevar a cabo la preparación de la muestra y todas las manipulaciones de la muestra en un cuarto oscuro para prevenir un uncaging no deseado. </li><li> Solubilizar DM-nitrofen ((1 - (2-nitro-4 ,5-dimetoxifenil) - N, N, N &#39;, N&#39;-tetrakis [(oxi-carbonilo) metil] -1,2-etanodiamina) en HEPES 50 mM tampón, mM de KCl, pH 7,0 a una concentración final de 400 mM 100 (ε 350 nm = 4330 M -1 cm -1 9). </li><li> Añadir CaCl2 de la ...

<ol>
	<li>Gensch, T., Viappiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+photothermal+methods:+accessing+time-resolved+thermodynamics+of+photoinduced+processes+in+chemistry+and+biology.">Time-resolved photothermal methods: accessing time-resolved thermodynamics of photoinduced processes in chemistry and biology.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 2, 699-721 (2003).</li><li>Larsen, R. W., Mik&#353;ovsk&#225;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+resolved+thermodynamics+of+ligand+binding+to+heme+proteins.">Time resolved thermodynamics of ligand binding to heme proteins.</a> Coord. Chem. Rev. 251 (9-10), 1101-1127 (2007).</li><li>Westrick, J. A., Peters, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoacoustic+calorimetric+study+of+horse+myoglobin.">A photoacoustic calorimetric study of horse myoglobin.</a> Bioph. Chem. 37 (1-3), 73-79 (1990).</li><li>Belogortseva, N., Rubio, M., Terrell, W., Miksovska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+heme+propionate+groups+to+the+conformational+dynamics+associated+with+CO+photodissociation+from+horse+heart+myoglobin.">The contribution of heme propionate groups to the conformational dynamics associated with CO photodissociation from horse heart myoglobin.</a> J. Inorg. Biochem. 101 (7), 977-986 (2007).</li><li>Mik&#353;ovsk&#225;, J., Suquet, C., Satterlee, J. D., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Conformational+Changes+Coupled+to+Ligand+Photodissociation+from+the+Heme+Binding+Domain+of+FixL.">Characterization of Conformational Changes Coupled to Ligand Photodissociation from the Heme Binding Domain of FixL.</a> Biochemistry. 44 (30), 10028-10036 (2005).</li><li>Miksovska, J., Gennis, R. B., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photothermal+studies+of+CO+photodissociation+from+mixed+valence+Escherichia+coli+cytochrome+bo3.">Photothermal studies of CO photodissociation from mixed valence Escherichia coli cytochrome bo3.</a> FEBS Lett. 579 (14), 3014-3018 (2005).</li><li>Losi, A., Michler, I., G&#228;rtner, W., Braslavsky, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+Thermodynamic+Changes+Photoinduced+in+5,12-trans-locked+Bacteriorhodopsin.+Evidence+that+Retinal+Isomerization+is+Required+for+Protein+Activation.">Time-resolved Thermodynamic Changes Photoinduced in 5,12-trans-locked Bacteriorhodopsin. Evidence that Retinal Isomerization is Required for Protein Activation.</a> Photochem. Photobiol. 72, 590-597 (2000).</li><li>Kondoh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-Induced+Conformational+Changes+in+Full-Length+Arabidopsis+thaliana+Cryptochrome.">Light-Induced Conformational Changes in Full-Length Arabidopsis thaliana Cryptochrome.</a> J. Mol. Biol. 413 (1), 128-137 (2011).</li><li>Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolabile+chelators+for+the+rapid+photorelease+of+divalent+cations.">Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (17), 6571-6575 (1988).</li><li>Eisenberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equation+for+the+Refractive+Index+of+Water.">Equation for the Refractive Index of Water.</a> J. Chem. Phys. 43 (11), 3887-3892 (1965).</li><li>Ellis-Davies, G. C., Kaplan, J. H., Barsotti, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+photolysis+of+caged+calcium:+rates+of+calcium+release+by+nitrophenyl-EGTA+and+DM-nitrophen.">Laser photolysis of caged calcium: rates of calcium release by nitrophenyl-EGTA and DM-nitrophen.</a> Biophys. J. 70, 1006-1016 (1996).</li><li>Miksovska, J., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationships+in+metalloproteins.">Structure-function relationships in metalloproteins.</a> Methods Enzymol. 360, 302-329 (2003).</li><li>Miksovska, J., Norstrom, J., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+profiles+for+CO+photodissociation+from+heme+model+compounds:+effect+of+proximal+ligands.">Thermodynamic profiles for CO photodissociation from heme model compounds: effect of proximal ligands.</a> Inorg. Chem. 44 (4), 1006-1014 (2005).</li><li>Dhulipala, G., Rubio, M., Michael, K., Miksovska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+profile+for+urea+photo-release+from+a+N-(2-nitrobenzyl)+caged+urea+compound.">Thermodynamic profile for urea photo-release from a N-(2-nitrobenzyl) caged urea compound.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 8, 1157-1163 (2009).</li></ol>

El principio físico detrás de métodos fototérmica es que una molécula fotoexcitado disipa el exceso de energía a través de la relajación vibracional al estado fundamental, lo que resulta en el calentamiento térmico de la 1,12 disolvente circundante. Para disolventes tales como agua, esto produce una rápida expansión de volumen (? V ª). Moléculas en estado excitado también pueden someterse a procesos fotoquímicos que producen cambios de volumen no térmicos (nonth? V) debid...

Métodos foto-térmica, como la calorimetría fotoacústica, desviación del rayo fototérmica (PDB), y rallado transitorias acoplado con excitación láser de nanosegundos representan una poderosa alternativa a los transitorios espectroscopias ópticas para los estudios con resolución temporal de los intermedios de corta duración 1,2. En contraste con las técnicas ópticas, como la absorción transitoria y espectroscopia de IR, que supervisan el perfil de tiempo de los cambios de absorción en el cromóforo circundante; técnicas fototérmicos detectar la dependencia del tiempo de los cambios de calor / volumen y por lo tanto son herramientas valiosas para la investigación de los perfiles de tiempo de ópticamente procesos &quot;silenciosos&quot;. Hasta el momento, la calorimetría fotoacústica y rallado transitoria se ha aplicado con éxito para estudiar la dinámica de conformación de procesos foto-inducidos, incluyendo la migración ligando diatómico en globinas 3,4, ligando con la proteína sensor de oxígeno FixL 5, electrón y el transporte de protones en hemo-cobre oxidasas 6 unND fotosistema II, así como la foto-isomerización en la rodopsina 7 y dinámica de conformación en criptocromo 8. Para ampliar la aplicación de técnicas fototérmica a los sistemas biológicos que se carece de un cromóforo y / o fluoróforo interna, la técnica de PBD se combinó con el uso del compuesto enjaulado a la foto-gatillo de un aumento en la concentración de ligando / sustrato dentro de unos pocos microsegundos o más rápido, dependiendo en el compuesto enjaulado. Este enfoque permite el monitoreo de la dinámica y de la energética de los cambios estructurales asociados con el ligando / sustrato unión a las proteínas que se carece de un fluoróforo interna o cromóforo y en escala de tiempo que no es accesible con instrumentos de parada de flujo comercial. Aquí una aplicación de PBD para supervisar la termodinámica del compuesto jaula, Ca 2 + DM-nitrofen, foto-escisión, así como la cinética del Ca 2 + asociación para el dominio C-terminal del sensor de calcio neuronal de Downcorriente Reguladora Element Antagonista Modulador (SUEÑO) se presenta. El Ca 2 + es foto-liberado de Ca 2 + DM-nitrofen dentro de 10 microsegundos y vuelve a enlazar a una jaula unphotolysed con una constante de tiempo de ~ 300 microsegundos. Por otro lado, en la presencia de apoDREAM se observa una cinética adicional que se produzca en la escala de tiempo de milisegundos y refleja la unión a la proteína ligando. La aplicación de PBD para sondear las transiciones conformacionales en los sistemas biológicos ha sido de alguna manera limitado debido a las dificultades instrumentales, por ejemplo ardua la alineación de la sonda y haz de bombeo para lograr una señal fuerte y reproducible PBD. Sin embargo, un diseño meticuloso de una instrumentación configuración, un control preciso de la temperatura, y una alineación cuidadosa del haz de la sonda y la bomba proporcionan una señal de PBD consistente y robusto que permite la monitorización de volumen resuelta en el tiempo y cambios de entalpía en una amplia escala de tiempo de 10 microsegundos a unos 200 ms. Además, en modificaciónciones del procedimiento experimental para asegurar la detección de muestra y de referencia trazas bajo temperatura idéntica, la composición del tampón, la orientación célula óptica, la potencia del láser, etc reduce significativamente el error experimental en volúmenes y entalpías de reacción medidos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="639">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col /> 
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-N,N,N&#39;,N&#39;-Tetraacetic Acid</td>
			<td style="width:84px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D-6814</td>
			<td style="width:220px;">DM-nitrophen, cage calcium compound, keep stock solutions in dark to prevent photodissociation,</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid)</td>
			<td style="width:84px;">Sigma Adrich</td>
			<td>0909C</td>
			<td>HEPES buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Potassium ferricyanide(III)</td>
			<td style="width:84px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">702587</td>
			<td style="width:220px;">reference compound for PBD measurments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"> </td>
			<td style="width:84px;"> </td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td style="width:220px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sodium chromate</td>
			<td style="width:84px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">307831</td>
			<td style="width:220px;">reference compound for PBD measurments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">He-Ne Laser Diode 5mW 635nm </td>
			<td style="width:84px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:119px;">54-179</td>
			<td style="width:220px;">use as a probe beam for PBD measurments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Oscilloscope, </td>
			<td style="width:84px;">LeCroy</td>
			<td style="width:119px;">Wave Surfer 42Xs</td>
			<td style="width:220px;">400 MHz bandwith</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nd:YAG laser</td>
			<td style="width:84px;">Continuum</td>
			<td style="width:119px;">ML II</td>
			<td>pump beam for PBD measurments</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:216px;">M355; Nd:YAG laser mirror</td>
			<td style="width:84px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:119px;">47-324</td>
			<td>laser mirror for 355 nm laser line</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:216px;">M1 and M2; Laser diode mirror</td>
			<td style="width:84px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:119px;">43-532</td>
			<td>visilbe laser flat mirror, wavelength range 300-700 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">P1 and P2; Iris Diaphragm</td>
			<td style="width:84px;">Edmind Optics</td>
			<td style="width:119px;">62-649</td>
			<td style="width:220px;">pin hole to shape the probe and pum beams</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">L1; bi-convex lens</td>
			<td style="width:84px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:119px;">LB1844</td>
			<td style="width:220px;">a lens to focus the probe beam at the detector, EFL 50 mm, wavelength range 350 - 2000 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DM, dichroic mirror</td>
			<td style="width:84px;">Thorlab </td>
			<td style="width:119px;">DMLP505</td>
			<td style="width:220px;">a longpass dichroic mirror with a cutoff wavelength of 505 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">F1; Edge filter</td>
			<td style="width:84px;">Andower </td>
			<td style="width:119px;">500FH90-25</td>
			<td>a long pass filter with a cutoff wavelength of 500 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Temperature-controlled cuvette holder</td>
			<td style="width:84px;">Quantum Northwest</td>
			<td style="width:119px;">FLASH 300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

submillisecond conformational changes in proteins resolved by photothermal beam deflection

Desviación del rayo fototérmica junto con fotoacústica calorimetría y rallado térmica pertenece a la familia de métodos fototérmicos que controlar el volumen y el tiempo de entalpía perfil cambios de luz inducidos cambios conformacionales en proteínas en microsegundos a milisegundos escalas de tiempo que no son accesibles mediante parada tradicional instrumentos de flujo. Además, puesto que se sondean cambios globales en el volumen y / o entalpía, estas técnicas se pueden aplicar a las proteínas y otras biomacromoléculas que carecen de un fluoróforo y una etiqueta o cromóforo. Para monitorear la dinámica y energética de los cambios estructurales asociados con Ca 2 + vinculante a los transductores de calcio, tales sensores de calcio neuronales, un compuesto de calcio enjaulado, DM-nitrofen, se emplea para la foto-trigger un rápido aumento (τ &lt;20 microsegundos) en el calcio libre concentración y el volumen asociado y entalpía cambios se probaron utilizando la técnica de deflexión de haz fototérmica.

Un ejemplo representativo de PBD traza de Ca 2 + foto de liberación de Ca 2 + DM-nitrofen se muestra en la Figura 3. La fase rápida corresponde a la foto-disociación de Ca 2 + DM-nitrofen y Ca 2 + liberación, mientras que la fase lenta refleja Ca 2 + vinculante a la jaula nonphotolysed. La trama de la muestra de amplitud PBD para la fase de rápido y lento escala a la amplitud del compuesto de referencia como una función del factor de dependido...

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Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection

Aquí se presenta una aplicación de la técnica de deflexión de haz fototérmica en combinación con un compuesto de calcio enjaulado, DM-nitrofen, para supervisar microsegundos y milisegundos dinámica y de la energética de cambios estructurales asociados con la asociación de calcio a un sensor de calcio neuronal, elemento regulador aguas abajo Antagonista Modulador .

Submillisecond Cambios conformacionales en proteínas resueltas por fototérmica Desviación de haz

Photothermal beam deflection together with photo-acoustic calorimetry and thermal grating belongs to the family of photothermal methods that monitor the ...

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