Name: submillisecond conformational changes in proteins resolved by photothermal beam deflection
Uploaded: 2014-02-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Science Foundation (MCB 1.021.831, JM) och J. &amp; E. Biomedical Research Program (Florida Department of Health, JM).

1. Exempel Beredningar <ol><li> Utför provpreparering och alla prov manipulationer i ett mörkt rum för att förhindra en oönskad uncaging. </li><li> Solubilisera DM-nitrophen ((1 - (2-nitro-4 ,5-dimetoxifenyl) - N, N, N &#39;, N&#39;-tetrakis [(oxi-karbonyl) metyl] -1,2-etandiamin) i 50 mM HEPES buffert, 100 mM KCl, pH 7,0 till en slutlig koncentration av 400 ^ M (ε 350nm = 4330 M -1 cm -1 9). </li><li> Lägg CaCl2 från 0,1 M stamlösning för att uppnå ett ?...

<ol>
	<li>Gensch, T., Viappiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+photothermal+methods:+accessing+time-resolved+thermodynamics+of+photoinduced+processes+in+chemistry+and+biology.">Time-resolved photothermal methods: accessing time-resolved thermodynamics of photoinduced processes in chemistry and biology.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 2, 699-721 (2003).</li><li>Larsen, R. W., Mik&#353;ovsk&#225;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+resolved+thermodynamics+of+ligand+binding+to+heme+proteins.">Time resolved thermodynamics of ligand binding to heme proteins.</a> Coord. Chem. Rev. 251 (9-10), 1101-1127 (2007).</li><li>Westrick, J. A., Peters, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoacoustic+calorimetric+study+of+horse+myoglobin.">A photoacoustic calorimetric study of horse myoglobin.</a> Bioph. Chem. 37 (1-3), 73-79 (1990).</li><li>Belogortseva, N., Rubio, M., Terrell, W., Miksovska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+heme+propionate+groups+to+the+conformational+dynamics+associated+with+CO+photodissociation+from+horse+heart+myoglobin.">The contribution of heme propionate groups to the conformational dynamics associated with CO photodissociation from horse heart myoglobin.</a> J. Inorg. Biochem. 101 (7), 977-986 (2007).</li><li>Mik&#353;ovsk&#225;, J., Suquet, C., Satterlee, J. D., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Conformational+Changes+Coupled+to+Ligand+Photodissociation+from+the+Heme+Binding+Domain+of+FixL.">Characterization of Conformational Changes Coupled to Ligand Photodissociation from the Heme Binding Domain of FixL.</a> Biochemistry. 44 (30), 10028-10036 (2005).</li><li>Miksovska, J., Gennis, R. B., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photothermal+studies+of+CO+photodissociation+from+mixed+valence+Escherichia+coli+cytochrome+bo3.">Photothermal studies of CO photodissociation from mixed valence Escherichia coli cytochrome bo3.</a> FEBS Lett. 579 (14), 3014-3018 (2005).</li><li>Losi, A., Michler, I., G&#228;rtner, W., Braslavsky, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+Thermodynamic+Changes+Photoinduced+in+5,12-trans-locked+Bacteriorhodopsin.+Evidence+that+Retinal+Isomerization+is+Required+for+Protein+Activation.">Time-resolved Thermodynamic Changes Photoinduced in 5,12-trans-locked Bacteriorhodopsin. Evidence that Retinal Isomerization is Required for Protein Activation.</a> Photochem. Photobiol. 72, 590-597 (2000).</li><li>Kondoh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-Induced+Conformational+Changes+in+Full-Length+Arabidopsis+thaliana+Cryptochrome.">Light-Induced Conformational Changes in Full-Length Arabidopsis thaliana Cryptochrome.</a> J. Mol. Biol. 413 (1), 128-137 (2011).</li><li>Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolabile+chelators+for+the+rapid+photorelease+of+divalent+cations.">Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (17), 6571-6575 (1988).</li><li>Eisenberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equation+for+the+Refractive+Index+of+Water.">Equation for the Refractive Index of Water.</a> J. Chem. Phys. 43 (11), 3887-3892 (1965).</li><li>Ellis-Davies, G. C., Kaplan, J. H., Barsotti, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+photolysis+of+caged+calcium:+rates+of+calcium+release+by+nitrophenyl-EGTA+and+DM-nitrophen.">Laser photolysis of caged calcium: rates of calcium release by nitrophenyl-EGTA and DM-nitrophen.</a> Biophys. J. 70, 1006-1016 (1996).</li><li>Miksovska, J., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationships+in+metalloproteins.">Structure-function relationships in metalloproteins.</a> Methods Enzymol. 360, 302-329 (2003).</li><li>Miksovska, J., Norstrom, J., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+profiles+for+CO+photodissociation+from+heme+model+compounds:+effect+of+proximal+ligands.">Thermodynamic profiles for CO photodissociation from heme model compounds: effect of proximal ligands.</a> Inorg. Chem. 44 (4), 1006-1014 (2005).</li><li>Dhulipala, G., Rubio, M., Michael, K., Miksovska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+profile+for+urea+photo-release+from+a+N-(2-nitrobenzyl)+caged+urea+compound.">Thermodynamic profile for urea photo-release from a N-(2-nitrobenzyl) caged urea compound.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 8, 1157-1163 (2009).</li></ol>

Den fysikaliska principen bakom fototermiska metoder är att en fotoexciterade molekylen avleder överskottsenergi via vibrational relaxa till grundtillståndet, vilket resulterar i termisk uppvärmning av omgivande 1,12 lösningsmedel. För lösningsmedel, såsom vatten, ger detta en snabb expansion volym (AV: e). Excited state molekyler kan också genomgå fotokemiska processer som resulterar i nonthermal förändringar volym (AV nonth) på grund av att bindningsklyvning / bildning och...

Fototermiska metoder såsom fotoakustisk kalorimetri, fototermisk strålavböjningsenheten (PDB), och övergående galler i kombination med nanosekund laserexcitation representerar ett kraftfullt alternativ till övergående optiska spektroskopier för tidsupplösta studier av kortlivade intermediärer 1,2. I motsats till optiska tekniker, såsom övergående absorption och IR-spektroskopi, att övervaka tidsprofilen för absorption förändringar i kromoforen omgivningen; fototermiska tekniker detektera tidsberoende förändringar värme / volym och därför är värdefulla verktyg för att undersöka tidsprofilerna för optiskt &quot;tysta&quot; processer. Hittills har fotoakustisk kalorimetri och övergående galler med framgång tillämpats för att studera konforma dynamik foto-inducerade processer inklusive diatomic ligand migration i globiner 3,4, ligand interaktioner med syresensor protein FixL 5, elektron-och protontransport i heme-koppar oxidases 6 ennd fotosystem II samt foto-isomerisering i rhodopsin 7 och konforma dynamik i kryptokrom 8. För att utvidga tillämpningen av fototermiska tekniker för biologiska system som saknar en inre kromofor och / eller fluoroforen var PBD-tekniken i kombination med användning av bur förening för foto utlösa en ökning av ligand / substratkoncentration inom några mikrosekunder eller snabbare, beroende på bur förening. Detta tillvägagångssätt möjliggör övervakning av dynamik och energetics av ​​strukturella förändringar i samband med den ligand / substrat bindning till proteiner som saknar en intern fluorofor eller kromofor och om tidsskala som inte är tillgänglig för kommersiella stop-flödesinstrument. Här en tillämpning av PBD att övervaka termodynamik av buren förening, Ca 2 + DM-nitrophen, foto-klyvning samt kinetiken för Ca 2 + förening att den C-terminala domänen av det neuronala kalciumsensor fallandeström Regulatory Element Antagonist Modulator (DREAM) presenteras. Ca 2 + är foto-frisättas från Ca2 + DM-nitrophen inom 10 ps och rebinds till en unphotolysed bur med en tidskonstant av ~ 300 ^ sek. Å andra sidan, i närvaro av apoDREAM ytterligare kinetisk inträffar på millisekundtidsskala observeras och återspeglar den ligand som binder till proteinet. Tillämpningen av PBD att proba konformationsövergångar i biologiska system har på något sätt begränsad på grund av instrumentella svårigheter, t.ex. mödosam justering av sonden och pumpstrålen för att uppnå en stark och reproducerbar PBD signal. Emellertid en noggrann utformning av en instrumenterings set-up, en exakt kontroll av temperaturen, och en noggrann inriktning av sonden och pumpstrålen får en enhetlig och robust PBD signal som medger övervakning av tidsupplöst volym och entalpiförändringar på ett brett tidsskala från 10 ^ sek till cirka 200 msek. Dessutom MODIFICningar av den experimentella proceduren för att säkerställa upptäckt av prov-och referensspår i samma temperatur, buffertsammansättning, optisk cell orientering, lasereffekt, etc. reducerar avsevärt den experimentella fel i uppmätta reaktionsvolymer och entalpier.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="639">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col /> 
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-N,N,N&#39;,N&#39;-Tetraacetic Acid</td>
			<td style="width:84px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D-6814</td>
			<td style="width:220px;">DM-nitrophen, cage calcium compound, keep stock solutions in dark to prevent photodissociation,</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid)</td>
			<td style="width:84px;">Sigma Adrich</td>
			<td>0909C</td>
			<td>HEPES buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Potassium ferricyanide(III)</td>
			<td style="width:84px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">702587</td>
			<td style="width:220px;">reference compound for PBD measurments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"> </td>
			<td style="width:84px;"> </td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td style="width:220px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sodium chromate</td>
			<td style="width:84px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">307831</td>
			<td style="width:220px;">reference compound for PBD measurments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">He-Ne Laser Diode 5mW 635nm </td>
			<td style="width:84px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:119px;">54-179</td>
			<td style="width:220px;">use as a probe beam for PBD measurments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Oscilloscope, </td>
			<td style="width:84px;">LeCroy</td>
			<td style="width:119px;">Wave Surfer 42Xs</td>
			<td style="width:220px;">400 MHz bandwith</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nd:YAG laser</td>
			<td style="width:84px;">Continuum</td>
			<td style="width:119px;">ML II</td>
			<td>pump beam for PBD measurments</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:216px;">M355; Nd:YAG laser mirror</td>
			<td style="width:84px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:119px;">47-324</td>
			<td>laser mirror for 355 nm laser line</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:216px;">M1 and M2; Laser diode mirror</td>
			<td style="width:84px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:119px;">43-532</td>
			<td>visilbe laser flat mirror, wavelength range 300-700 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">P1 and P2; Iris Diaphragm</td>
			<td style="width:84px;">Edmind Optics</td>
			<td style="width:119px;">62-649</td>
			<td style="width:220px;">pin hole to shape the probe and pum beams</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">L1; bi-convex lens</td>
			<td style="width:84px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:119px;">LB1844</td>
			<td style="width:220px;">a lens to focus the probe beam at the detector, EFL 50 mm, wavelength range 350 - 2000 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DM, dichroic mirror</td>
			<td style="width:84px;">Thorlab </td>
			<td style="width:119px;">DMLP505</td>
			<td style="width:220px;">a longpass dichroic mirror with a cutoff wavelength of 505 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">F1; Edge filter</td>
			<td style="width:84px;">Andower </td>
			<td style="width:119px;">500FH90-25</td>
			<td>a long pass filter with a cutoff wavelength of 500 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Temperature-controlled cuvette holder</td>
			<td style="width:84px;">Quantum Northwest</td>
			<td style="width:119px;">FLASH 300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

submillisecond conformational changes in proteins resolved by photothermal beam deflection

Fototermisk strålavböjningsenheten tillsammans med fotoakustisk kalorimetri och termisk galler tillhör familjen av fototermiska metoder som övervakar tidsprofil volym och entalpiförändringar av ljus inducerade konformationsförändringar i proteiner på mikrosekund att millisekund tidsskalor som inte är tillgängliga med hjälp av traditionella stopp flödesinstrument. Eftersom övergripande förändringar i volym och / eller entalpi är sonde, dessa tekniker kan tillämpas på proteiner och andra biomakromolekyler som saknar en fluorofor och eller en kromofor etikett. För att följa dynamiken och energin av strukturella förändringar i samband med Ca2 + binder till kalcium givare, sådana neuronala kalcium sensorer, en bur kalciumförening, DM-nitrophen, används för att foto utlösa en snabb (τ &lt;20 ^ sek) ökning av fritt kalcium koncentration och tillhörande volym och entalpi ändringar sonderas med hjälp av fototermisk strålavböjningsenheten teknik.

Ett representativt exempel på PBD spårar för Ca 2 + foto-frisättning från Ca2 + DM-nitrophen visas i figur 3. Den snabba fasen motsvarar den bild-spjälkning av Ca 2 + DM-nitrophen och Ca 2 + frigörelse, medan den långsamma fasen reflekterar Ca2 +-bindning till nonphotolysed bur. Handlingen av provet PBD amplitud för den snabba och långsamma fasen skalas till amplituden för referensföreningen som en funktion av temperaturen beroende fakto...

Watch this Scientific Journal Video about Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection at JoVE.com

Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection

Här rapporterar vi en tillämpning av den fototermiska strålavböjningsenheten teknik i kombination med en bur kalciumförening, DM-nitrophen att övervaka mikrosekund och millisekund dynamik och energetik av strukturförändringar som är associerade med kalcium association till en neuronal kalciumsensor Nedströms Regulatory Element Antagonist Modulator .

Submillisecond Conformational Förändringar i Proteiner lösas genom fototermisk Beam Nedböjning

Photothermal beam deflection together with photo-acoustic calorimetry and thermal grating belongs to the family of photothermal methods that monitor the ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Chemistry

Biology

Physics

Fundamentals

Unit 1

The First Law of Thermodynamics

Macromolecules

SCIENTISTS IN ACTION

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

Bestämma isbindande plan för frostskyddsproteiner genom fluorescensbaserad isplanstillhörighet

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

The Use of Gas Chromatography to Analyze Compositional Changes of Fatty Acids in Rat Liver Tissue during Pregnancy

Användning av gaskromatografi för att analysera förändringar av sammansättningen av fettsyror i råttlevervävnad under graviditeten

Gas chromatography (GC) is a highly sensitive method used to identify and quantify the fatty acid content of lipids from tissues, cells, and plasma/serum, ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Radiomärkning och kvantifiering av cellulära nivåerna av fosfoinositider från High Performance Liquid Chromatography kopplade Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

In Situ karakterisering av Hydratiserade proteiner i vatten av Salvi och ToF-SIMS

This work demonstrates in situ characterization of protein biomolecules in the aqueous solution using the System for Analysis at the Liquid Vacuum ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

En HS-MRM analysmetod för kvantifiering av värdcellen proteiner i Protein Biopharmaceuticals genom vätskekromatografi Ion rörlighet QTOF masspektrometri

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

Time-resolved Photophysical Characterization of Triplet-harvesting Organic Compounds at an Oxygen-free Environment Using an iCCD Camera

Tid-löst Photophysical karakterisering av triplett-skörd organiska föreningar i en syrefri miljö med en iCCD kamera

Here, we present a sensible method of the acquisition and analysis of time-resolved photoluminescence using an ultrafast iCCD camera. This system enables ...

DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

DNA-magnetiska partikel bindande analys av dynamiska och elektroforetiska ljusspridning

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in an Efficient Way in Plants

Samtidig uttryck av flera chimära fluorescerande fusionsproteinerna på ett effektivt sätt i växter

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent ...

Photoelectron Imaging of Anions Illustrated by 310 Nm Detachment of F&#8722;

Photoelectron Imaging of Anions Illustrated by 310 Nm Detachment of FÃƒÆ’Ã‚Â¢Ãƒâ€¹Ã¢â‚¬Â '

Fotoelektronen avbildning av anjoner illustrerad av 310 Nm avlossning av F−

Anion photoelectron imaging is a very efficient method for the study of energy states of bound negative ions, neutral species and interactions of unbound ...

Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers

Att förbättra hög viskositet extrudering av Mikrokristaller för tid-löst seriell femtosekund Crystallography på röntgen lasrar

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray ...