Name: retrograde labeling of retinal ganglion cells in adult zebrafish with fluorescent dyes
Uploaded: 2014-05-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes at JoVE.com

This is supported by 973 MOST grant (Grant No. 2011CB504402, 2012CB947602), National Natural Science Foundation of China (Grant No. 91132724, U1332136) and the 'Hundred Talents Project' of Chinese Academy of Science. The protocol was approved by the Committee on the Ethics of Animal Experiments of the USTC (Permit Number: USTCACUC1103013).

1。手術装置を構成注：操作中と後の魚が生きたまま確保するために、魚の口から1滴/秒の速度で半分濃度（0.015％）の点滴麻酔液の3 - アミノ安息香酸エチルメタンスルホン酸塩（MS-222、またはトリカイン） 図1に示される手製のドリップシステムを用いて。 <ol><li> 図1（a）に示すようにボックスを作る（長28センチ、幅は10cmで、高さは5cmであ?...

<ol>
	<li>Wyatt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+astray/robo2+zebrafish+mutant+reveals+that+degenerating+tracts+do+not+provide+strong+guidance+cues+for+regenerating+optic+axons.">Analysis of the astray/robo2 zebrafish mutant reveals that degenerating tracts do not provide strong guidance cues for regenerating optic axons.</a> J Neurosci. 30, 13838-13849 (2010).</li><li>Grieshaber, P., Lagreze, W. A., Noack, C., Boehringer, D., Biermann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+of+fluorogold-prelabeled+retinal+ganglion+cells+with+calcein-AM:+A+new+method+for+assessing+cell+vitality.">Staining of fluorogold-prelabeled retinal ganglion cells with calcein-AM: A new method for assessing cell vitality.</a> J Neurosci Methods. 192, 233-239 (2010).</li><li>Schwalb, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+factors+secreted+by+the+goldfish+optic+nerve+induce+retinal+ganglion+cells+to+regenerate+axons+in+culture.">Two factors secreted by the goldfish optic nerve induce retinal ganglion cells to regenerate axons in culture.</a> J Neurosci. 15, 5514-5525 (1995).</li><li>Watanabe, M., Inukai, N., Fukuda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+retinal+ganglion+cells+after+transection+of+the+optic+nerve+in+adult+cats:+a+quantitative+study+within+two+weeks.">Survival of retinal ganglion cells after transection of the optic nerve in adult cats: a quantitative study within two weeks.</a> Vis Neurosci. 18, 137-145 (2001).</li><li>Chiu, K., Lau, W. M., Yeung, S. C., Chang, R. C., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+labeling+of+retinal+ganglion+cells+by+application+of+fluoro-gold+on+the+surface+of+superior+colliculus.">Retrograde labeling of retinal ganglion cells by application of fluoro-gold on the surface of superior colliculus.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Bakken, T. E., Stevens, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+system+scaling+in+teleost+fish.">Visual system scaling in teleost fish.</a> J Comp Neurol. 520, 142-153 (2012).</li><li>Zhou, L. X., Wang, Z. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+number+and+distribution+of+retinal+ganglion+cells+after+optic+nerve+crush+in+zebrafish.">Changes in number and distribution of retinal ganglion cells after optic nerve crush in zebrafish.</a> Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 35, 159-162 (2002).</li><li>Sherpa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ganglion+cell+regeneration+following+whole-retina+destruction+in+zebrafish.">Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish.</a> Dev Neurobiol. 68, 166-181 (2008).</li><li>Zou, S., Tian, C., Ge, S., Hu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+of+retinal+ganglion+cells+is+not+essential+to+visual+functional+recovery+after+optic+nerve+injury+in+adult+zebrafish.">Neurogenesis of retinal ganglion cells is not essential to visual functional recovery after optic nerve injury in adult zebrafish.</a> PLoS One. 8, (2013).</li><li>Choi, D., Li, D., Raisman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+retrograde+neuronal+tracers+that+label+the+rat+facial+nucleus:+a+comparison+of+Fast+Blue,+Fluoro-ruby,+Fluoro-emerald,+Fluoro-Gold+and+DiI.">Fluorescent retrograde neuronal tracers that label the rat facial nucleus: a comparison of Fast Blue, Fluoro-ruby, Fluoro-emerald, Fluoro-Gold and DiI.</a> J Neurosci Methods. 117, 167-172 (2002).</li><li>Zou, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+optokinetic+response+to+study+visual+function+of+zebrafish.">Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Tokuoka, H., Yoshida, T., Matsuda, N., Mishina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+by+glycogen+synthase+kinase-3beta+of+the+arborization+field+and+maturation+of+retinotectal+projection+in+zebrafish.">Regulation by glycogen synthase kinase-3beta of the arborization field and maturation of retinotectal projection in zebrafish.</a> J Neurosci. 22, 10324-10332 (2002).</li><li>Xiao, T., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+GFP-based+genetic+screen+reveals+mutations+that+disrupt+the+architecture+of+the+zebrafish+retinotectal+projection.">A GFP-based genetic screen reveals mutations that disrupt the architecture of the zebrafish retinotectal projection.</a> Development. 132, 2955-2967 (2005).</li><li>Li, L., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+olfactoretinal+centrifugal+pathway+may+relate+to+the+visual+system+defect+in+night+blindness+b+mutant+zebrafish.">Disruption of the olfactoretinal centrifugal pathway may relate to the visual system defect in night blindness b mutant zebrafish.</a> Journal of Neuroscience. 20, 1883-1892 (2000).</li><li>Kassing, V., Engelmann, J., Kurtz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+Single-Cell+Responses+in+the+Optic+Tectum+of+Adult+Zebrafish+with+Dextran-Coupled+Calcium+Dyes+Delivered+via+Local+Electroporation.">Monitoring of Single-Cell Responses in the Optic Tectum of Adult Zebrafish with Dextran-Coupled Calcium Dyes Delivered via Local Electroporation.</a> PLoS One. 8, (2013).</li></ol>

RGCの逆行性標識は、哺乳類動物でのRGCの生存を研究することは重要であるが、それはゼブラフィッシュで使用されていなかった。代替の方法は、彼が7と抗体染色8染色 、ラベルされたすべてのRGCでのRGC番号、およびトランスジェニック系統をカウントするための金規定するものではありません、まだ12、13を構築されていません。このビデオでは、大人のゼブラフィ?...

大人のゼブラフィッシュは、視神経損傷1の後に軸索を再生する強力な能力を持っているように、全体のRGCをカウントするための適切な方法は、RGCを生存と再生2を評価することが不可欠である。哺乳類や金魚3の逆行性標識のRGCの方法に基づいて- 5、私たちは、大人のゼブラフィッシュにおける視蓋からのRGCを標識する方法を構築した。大人のゼブラフィッシュの場合は、2の重要な技術的な問題に注意する必要があります。大人のゼブラフィッシュの頭蓋骨は、6非常に小さい。彼らは水環境に住んでいます。ここでは、5掘削に伴う危険を最小限に抑えることがエッチング液で頭蓋骨を扱う。その後、我々は手術後、動物の生存率を改善する光硬化性ボンドで穴を密閉する。 以前は、いくつかの他の技術は、間接的な方法でのRGCの数をカウントするために採用された。網膜切片における染色HEはRGCL 7内のセルのすべてのタイプのラベルを付けます。全体Rでの抗体標識このような膵島-1のようなetinaも、アマクリン細胞8にラベルを付けることができます。視神経の切り株から逆行標識は、網膜内のすべてのRGCにラベルを付けることができますが、それは視神経への追加として傷害の原因になりますので、それはクラッシュモデルで採用することができない。蓋から逆行ラベルを利用して、我々は視神経挫滅でのRGCの生存と再生を研究している。結果は、ほとんどすべてのRGCが生存し、RGCの90％以上がクラッシュモデル9の最初の週で蓋を再生成することを示している。 正常にすべてのRGCを標識するために、DiIをペーストは、他のいくつかの市販の染料10との比較後に選択されました。第一に、これは特にin vivoでの組織標識のために設計されている。第二に、それは、水に拡散することができない、親油性染料である。さらに、この蛍光はそれのRGC生存研究のための優れた候補になり、長時間持続することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="608">
	<tbody>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:152px;">MS222</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:152px;">E10521</td>
			<td style="width:152px;">USA</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:152px;">DiI</td>
			<td style="width:152px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:152px;">N22880</td>
			<td style="width:152px;">USA</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:152px;">lightcuring bond</td>
			<td style="width:152px;">Heraeus Kulzer&#160;</td>
			<td style="width:152px;">Durafill bond</td>
			<td style="width:152px;">Germany</td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;width:152px;">Gluma Etch</td>
			<td style="width:152px;">Heraeus Kulzer&#160;</td>
			<td style="width:152px;">Gluma Etch 35 Gel</td>
			<td style="width:152px;">Germany</td>
		</tr>
		<tr height="73">
			<td height="73" style="height:73px;width:152px;">Blue LED</td>
			<td style="width:152px;">Shenruo Medical Equipment Co.</td>
			<td style="width:152px;">Power Blue Light Curing Unit</td>
			<td style="width:152px;">China</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retrograde labeling of retinal ganglion cells in adult zebrafish with fluorescent dyes

逆行性標識網膜神経節細胞（RGC）がサイトを死んでからのRGC細胞体を分離することができるように、それはのRGCの生存と再生の実験でのRGCをカウントするためのゴールドスタンダードとなっている。多くの研究は、視神経損傷後のRGC生存を検索するには哺乳類動物において行われている。いくつかの代替の方法は、網膜神経節細胞層（RGCL）で細胞数をカウントすることができますがしかし、成人のゼブラフィッシュにおけるRGCの逆行性標識はまだ報告されていない。成体ゼブラフィッシュ頭蓋骨のサイ​​ズが小さく、頭蓋骨にドリル後の死亡の高いリスクを考慮すると、我々は、酸エッチングを利用して頭蓋骨を開いて、有意に生存率を改善することができる光硬化性ボンドで穴を密封する。 5日間の染料を吸収した後、ほぼすべてのRGCをラベル付けされている。このメソッドは、視神経を横断する必要がないとして、それは大人のゼブラフィッシュにおける視神経挫滅した後のRGC生存の研究にかけがえのないです。ここではご紹介この方法ステップバイステップとは、代表的な結果を提供します。

図4B-Dが示すように 、のDiI +細胞の数は、RGCLにおけるDAPI +細胞の三分の二である。通常の網膜では、全体の網膜（ 図4E）のモンタージュ画像は中央エリアでのRGCがで彼らのターゲットに再生成されていないようにDiI +のRGCは、網膜全体にわたってますが、再生された網膜（ 図4F）に分布していることを示してい最初の...

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Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

蛍光色素で大人のゼブラフィッシュの網膜神経節細胞の逆行性標識

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

ゼブラフィッシュ後脳における標識およびイメージング細胞

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish ...

神経科学

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

遺伝的に標識された網膜神経節細胞からの光は応答を記録するために隔離された網膜の準備

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

電位感受性色素を持つカニ口と胃の神経節における神経細胞の光学的イメージング

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

によるマウス網膜神経節細胞のトランスフェクション in vivoでエレクトロポレーション

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

逆行性蛍光標識は、特定された神経細胞から標的細胞外シングルユニット記録を可能にします<em生体内で&gt;</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Retrograde Loading of Nerves, Tracts, and Spinal Roots with Fluorescent Dyes

神経、地帯、および蛍光色素で脊髄根の逆行ローディング

Retrograde labeling of neurons is a standard anatomical method1,2 that has also been used to load calcium and voltage-sensitive dyes into neurons3-6. ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

培養大人の背根神経節ニューロンの軸索再生の遺伝学的研究

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

マウスの網膜神経節細胞におけるシナプスと人工コンダクタンスによるダイナミッククランプの実装

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish

大人のゼブラフィッシュにおける網膜再生研究で使用するための新規な光ダメージパラダイム

Light-induced retinal degeneration (LIRD) is commonly used in both rodents and zebrafish to damage rod and cone photoreceptors. In adult zebrafish, ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

網膜神経節細胞の定義されたサブセットの単一細胞RNA-Seq

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...