Name: cecal ligation and puncture-induced sepsis as a model to study autophagy in mice
Uploaded: 2014-02-09T22:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice at JoVE.com

この作品は、AMK崔に、NIHの助成金P01のHL108801、R01-HL60234、R01-HL55330、R01-HL079904によってサポートされていました。 S. Ryterはラブレース呼吸研究所から給料のサポートを受けた。

注意：ブリガムアンドウィメンズ病院/ハーバード大学医学部地域での施設内動物管理使用委員会では、次の手順を承認した。 1。盲腸結紮穿刺同じ背景（C57BL / 6）、8〜10週齢の雄性のマウスを使用してください。雌マウスは、敗血症誘発致死に対する男性よりも耐性がある。 8週間以上経過したマウスは、CLP後の生存の点で若いマウスよ?...

<ol>
	<li>Hotchkiss, R. S., Karl, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathology+and+treatment+of+sepsis.">The pathology and treatment of sepsis.</a> N. Engl. J. Med. 348, 138-150 (2003).</li><li>Anaya, D. A., Nathens, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+severe+sepsis+in+secondary+peritonitis.">Risk factors for severe sepsis in secondary peritonitis.</a> Surg. Infect. 4, 355-362 (2003).</li><li>Bone, R. C., Grodzin, C. J., Balk, R. 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CLPの主な利点は、（低-中·ハイグレードからIE）異なる重大度の敗血症を調査する研究者を可能にすることである。誘導された敗血症の重症度は、盲腸結紮の長さ（最も重要な決定因子）に影響され、穿刺に使用される針のサイズ及び孔の数が15を行った。また、マウス系統、性別、敗血症の重症度に影響を与えることができる、いくつかの株は、他のものよりも影響を受けや...

敗血症、感染に対する全身性炎症反応は、批判的に、重症患者1における主な死亡原因を表します。最大60％ の2の相当な死亡率を持っていることが多い複数菌敗血症につながる腹腔内感染症、敗血症症例の20％を占め、。敗血症関連死亡率は、主に、その後の臓器不全3,4で多臓器不全に起因する。この病気の発症メカニズムへの追加調査が緊急に新規でより効果的な治療法の開発を促進するために必要とされる。 盲腸結紮穿刺（CLP）法は、 生体内で敗血症をモデル化するための一般的に使用される手順です。盲腸のように、複数菌腹膜炎、血液（菌血症）、敗血症性ショック、多臓器不全への細菌の移動と、最終的には死を5年の穿刺の結果、細菌がいっぱいです。一般的には、CLPが臨床反映していると認められている現実をより正確なげっ歯類へのエンドトキシンあるいは精製された細菌の注射などの従来の技術よりも、このように、CLPは、したがって実験的誘導と、敗血症の発症機序の調査のためのゴールドスタンダード（非制限なくが）6と考えられている。このモノグラフでは、敗血症の発症機序は、オートファジーを含めるかどうかを評価するために設計されたプロトコルを記述します。 オートファジー、進化的に保存された細胞プロセスは、損傷を受けたタンパク質やミトコンドリアなどの細胞小器官のターンオーバーを促進し、細菌7,8を含む細胞内病原体のクリアランスに重要な役割を果たしている。オートファジーの際に細胞質タンパク質または細胞小器官は、その後、分解9リソソームに送られるオートファゴソームと呼ばれる二重膜結合小胞の中に隔離されている。多くのタンパク質は、オートファジー関連遺伝子の哺乳類相同体（ATG）として同定されている、もともとオートファジーの過程を制御する酵母で同定された。微小管関連タンパク質-1軽鎖3B（ホスファチジルエタノールアミン抱合体）-IIをLC3BするLC3B-I（フリー体）から（LC3B）（Atg8のホモログ）の変換は、オートファゴソームの形成9の主要なステップである。オートファジー機能不全は老化と癌や神経変性疾患10を含むヒトの疾患と関連している。さらに、オートファジーは、免疫細胞8による抗原提示、リンパ球の開発、サイトカイン分泌などの自然免疫と獲得免疫に影響を与えます。これにより、オートファジーはまた、感染に対する全身性炎症反応（ すなわち、敗血症における）において役割を果たし得ることが合理的と思われる。 現在までにいくつかの方法は、 インビボでの組織損傷におけるオートファジーの役割を評価するために記載されている。これらは、緑色蛍光タンパク質（GFP）-LC3発現マウスや車の定量化の使用を含む電子顕微鏡による組織内のファゴソーム（これらの2つの方法が、このモノグラフで説明します）。追加の方法は、組織ホモジネートにおけるオートファジータンパク質発現の定量化、および（他の箇所に記載されるように）自食フラックスの解析11-13を含む。このレビューの目的は、実験的敗血症のコンテキストで、生体内でオートファジーを評価するための現在のプロトコルを提供することです。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" >
	<tbody>
		<tr >
			<td >GFP-LC3 Transgenic Mice</td>
			<td >Riken (Japan)</td>
			<td >RBRC00806</td>
			<td >GFP-LC3#53</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Xylazine</td>
			<td >Henry-Schein</td>
			<td >568-0606</td>
			<td>Xylazine HCl Injection Vet</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ketamine</td>
			<td >Henry-Schein</td>
			<td >995-2949</td>
			<td>Ketaset Inj 100 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EtOH</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>A405-20</td>
			<td>Histology Grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EtOH</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>A407-1</td>
			<td>For Sterilizatiion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >silk surgical sutures 6-0</td>
			<td >Owens &#38; Minor</td>
			<td >2300-0078OG, 017624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >buprenorphine-HCl</td>
			<td >Henry-Schein</td>
			<td >614-5157</td>
			<td>Buprenex Ampules</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >paraformaldehyde (37%) solution</td>
			<td >JT Baker</td>
			<td >S898-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >xylenes</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>X3P-1GAL </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >anti-GFP monoclonal antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>G10362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hoescht</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>944403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >OCT</td>
			<td >VWR scientific</td>
			<td >25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sudan Black</td>
			<td >Santa Cruz</td>
			<td >sc-203760</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EM grade Glutaraldehyde 2.5% in sodium cacodylate</td>
			<td >Electron microscopy Sciences</td>
			<td>15960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >propylene oxide</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>240397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Agar 100 resin</td>
			<td >Agar scientific</td>
			<td > R1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >dodecenylsuccinic anhydride</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>46346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >methylnadic anhydride</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>45359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >N-benzyldimethylamine</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>185582</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cecal ligation and puncture-induced sepsis as a model to study autophagy in mice

実験的敗血症は、盲腸結紮および穿刺複数菌による敗血症を引き起こす（CLP）法を用いて、マウスにおいて誘発することができる。ここで、プロトコルは、CLPの技術を用いて、マウスにおいて様々な重症度の敗血症を誘発するために設けられている。オートファジーは、ストレスや病原体の侵入に対する基本的な組織反応である。実験的敗血症のコンテキストで、生体内でオートファジーを評価するには、2つの現在のプロトコルもここで提示されています。 （I）緑色蛍光タンパク質（GFP）-LC3融合タンパク質を発現するトランスジェニックマウスは、CLPに供される。 GFPシグナルの局所的な増強（斑点）、免疫組織化学的アッセイ法または共焦点のいずれかによってアッセイされるように、このようにして、オートファジー経路の改変された活性化を増強オートファゴソームの形成を検出するために使用することができる。 （オートファジー刺激のマーカーとしての）単位面積当たりの組織（II）の強化自己貪食液胞（オートファゴソーム）の形成は、電子顕微鏡を用いて定量することができる。敗血症に対するオートファジー応答の研究が重要であるCOMP組織が感染に反応するメカニズムを理解することのonent。この分野の研究成果は、最終的に救命医療における大きな問題である敗血症の病因を理解に貢献することができる。

菌血症は、CLP誘発性敗血症14の後には早くも6時間などのマウスに存在する。 （悪寒、頻呼吸および損なわれた運動活性を含む）、敗血症の臨床徴候は、処置後、約12時間後に表示されます。 CLPを受けたマウスは、腹膜炎の誘導後約18時間で死に始める。より深刻な、より増加し、敗血症で致死15です。 CLP後7日目で約60％の死亡率のミッドグレードの敗血症の結果は（この時間...

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Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

実験的敗血症は盲腸結紮穿刺（CLP）の方法を用いて、マウスにおいて誘発することができる。 CLP誘発性敗血症の文脈においてインビボでオートファジーを評価するための現在のプロトコルがここに提示されている：（GFP）-LC3マウスを用いたオートファジーを測定するためのプロトコル、および電子顕微鏡法によってオートファゴソームの形成を測定するためのプロトコル。

マウスにおけるオートファジーを研究するためのモデルとして、盲腸結紮穿刺誘発性敗血症

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