Name: ablation of a single cell from eight-cell embryos of the amphipod crustacean parhyale hawaiensis
Uploaded: 2014-03-16T23:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis at JoVE.com

نشكر الريحان وعارف حسان الشهاوى للعمل الكاميرا، Tripti غوبتا وFrederike Alwes للحصول على المساعدة صقل تقنية الاجتثاث الخلية، وأعضاء المختبر Extavour لردود الفعل على البيانات والفيديو والمخطوطة. وأيد هذا العمل جزئيا من قبل معهد الخلايا الجذعية في جامعة هارفارد (البذور غرانت عدد SG-0057-10-00) مؤسسة إليسون الطبية (جديد الباحث جائزة عدد AG-NS-07010-10) لفريق الخبراء الاستشاري، وجوائز برنامج بحوث كلية هارفارد ل ARN.

يشار إلى التعليقات التي قد تكون مفيدة في تنفيذ بعض الخطوات بخط مائل. 1. اليوم 1: إعداد مواد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المواد التالية (انظر الجدول المواد والمعدات): <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction...

<ol>
	<li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3.">Chapter 3.</a> Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual Volume. , 373-404 .</li><li>Sander, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+insect+embryogenesis:+the+evolution+of+concepts+and+mechanisms.">Pattern formation in insect embryogenesis: the evolution of concepts and mechanisms.</a> Int. J.Insect Morphol. Embryol. 25, 349-367 (1997).</li><li>Regier, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arthropod+relationships+revealed+by+phylogenomic+analysis+of+nuclear+protein-coding+sequences.">Arthropod relationships revealed by phylogenomic analysis of nuclear protein-coding sequences.</a> Nature. 463, 1079-1083 (2010).</li><li>Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+isolated+blastomeres+with+respect+to+germ+cell+formation+in+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">The fate of isolated blastomeres with respect to germ cell formation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Biol. 277, 387-402 (2005).</li><li>Browne, W. E., Price, A. L., Gerberding, M., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+in+the+amphipod+crustacean,+Parhyale+hawaiensis.">Stages of embryonic development in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis.</a> Genesis. 42, 124-149 (2005).</li><li>Gerberding, M., Browne, W. E., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lineage+analysis+of+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis+reveals+an+early+restriction+of+cell+fates.">Cell lineage analysis of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis reveals an early restriction of cell fates.</a> Development. 129, 5789-5801 (2002).</li><li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+and+dissection+of+Parhyale+hawaiensis+embryos.">Fixation and dissection of Parhyale hawaiensis embryos.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li><li>Price, A. L., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+divergent+mechanisms+of+mesoderm+development+in+arthropods:+the+expression+of+Ph-twist+and+Ph-mef2+in+Parhyale+hawaiensis.">Investigating divergent mechanisms of mesoderm development in arthropods: the expression of Ph-twist and Ph-mef2 in Parhyale hawaiensis.</a> J. Exp. B. Dev. Evol. 310, 24-40 (2008).</li><li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+of+labeled+RNA+probes+to+fixed+Parhyale+hawaiensis+embryos.">In situ hybridization of labeled RNA probes to fixed Parhyale hawaiensis embryos.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li><li>Browne, W. W., Schmid, B. G. M., Wimmer, E. A., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+otd+orthologs+in+the+amphipod+crustacean,+Parhyale+hawaiensis.">Expression of otd orthologs in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Genes Evol. 216, 581-595 (2006).</li><li>Prpic, N. M., Telford, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+homothorax+and+extradenticle+mRNA+in+the+legs+of+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis:+evidence+for+a+reversal+of+gene+expression+regulation+in+the+pancrustacean+lineage.">Expression of homothorax and extradenticle mRNA in the legs of the crustacean Parhyale hawaiensis: evidence for a reversal of gene expression regulation in the pancrustacean lineage.</a> Dev. Genes Evol. 218, 333-339 (2008).</li><li>Kizil, G., Havemann, J., Gerberding, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cells+in+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis+depend+on+Vasa+protein+for+their+maintenance+but+not+for+their+formation.">Germ cells in the crustacean Parhyale hawaiensis depend on Vasa protein for their maintenance but not for their formation.</a> Dev. Biol. 327, 320-239 (2009).</li><li>Liubicich, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+Parhyale+Ultrabithorax+recapitulates+evolutionary+changes+in+crustacean+appendage+morphology.">Knockdown of Parhyale Ultrabithorax recapitulates evolutionary changes in crustacean appendage morphology.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13892-13896 (2009).</li><li>Pavlopoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+evolution+of+appendage+specialization+by+Hox+gene+misexpression+in+an+emerging+model+crustacean.">Probing the evolution of appendage specialization by Hox gene misexpression in an emerging model crustacean.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13897-13902 (2009).</li><li>Vargas-Vila, M. A., Hannibal, R. L., Parchem, R. J., Liu, P. Z., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+prominent+requirement+for+single-minded+and+the+ventral+midline+in+patterning+the+dorsoventral+axis+of+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">A prominent requirement for single-minded and the ventral midline in patterning the dorsoventral axis of the crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Development. 137, 3469-3476 (2010).</li><li>Simanton, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+arthropod+midline+netrin+accumulation+revealed+with+a+cross-reactive+antibody+provides+evidence+for+midline+cell+homology.">Conservation of arthropod midline netrin accumulation revealed with a cross-reactive antibody provides evidence for midline cell homology.</a> Evol. Dev. 11, 260-268 (2009).</li><li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+staining+of+Parhyale+hawaiensis+embryos.">Antibody staining of Parhyale hawaiensis embryos.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li><li>Pavlopoulos, A., Averof, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+genetic+transformation+for+comparative+developmental+studies+in+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">Establishing genetic transformation for comparative developmental studies in the crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 7888-7893 (2005).</li><li>Kontarakis, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+strategy+for+gene+trapping+and+trap+conversion+in+emerging+model+organisms.">A versatile strategy for gene trapping and trap conversion in emerging model organisms.</a> Development. 138, 2625-2630 (2011).</li><li>Zeng, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+assembly+and+characterization+of+a+maternal+and+developmental+transcriptome+for+the+emerging+model+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">De novo assembly and characterization of a maternal and developmental transcriptome for the emerging model crustacean Parhyale hawaiensis.</a> BMC Genom. 12, 581 (2011).</li><li>Zeng, V., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASGARD:+an+open-access+database+of+annotated+transcriptomes+for+emerging+model+arthropod+species.">ASGARD: an open-access database of annotated transcriptomes for emerging model arthropod species.</a> Database. , (2012).</li><li>Nestorov, P., Battke, F., Levesque, M. P., Gerberding, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Maternal+Transcriptome+of+the+Crustacean+Parhyale+hawaiensis+Is+Inherited+Asymmetrically+to+Invariant+Cell+Lineages+of+the+Ectoderm+and+Mesoderm.">The Maternal Transcriptome of the Crustacean Parhyale hawaiensis Is Inherited Asymmetrically to Invariant Cell Lineages of the Ectoderm and Mesoderm.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li><li>Alwes, F., Hinchen, B., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+cell+lineage,+movement,+and+migration+from+germ+layer+specification+to+gastrulation+in+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">Patterns of cell lineage, movement, and migration from germ layer specification to gastrulation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Biol. 139, 110-123 (2011).</li><li>Ewen-Campen, B., Schwager, E. E., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+machinery+of+germ+line+specification.">The molecular machinery of germ line specification.</a> Mol. Reprod. Dev. 77, 3-18 (2010).</li><li>Price, A. L., Modrell, M. S., Hannibal, R. L., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesoderm+and+ectoderm+lineages+in+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis+display+intra-germ+layer+compensation.">Mesoderm and ectoderm lineages in the crustacean Parhyale hawaiensis display intra-germ layer compensation.</a> Dev. Biol. 341, 256-266 (2010).</li><li>Fraser, S. E., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+metamorphosis+of+experimental+embryology.">The molecular metamorphosis of experimental embryology.</a> Cell. 100, 41-55 (2000).</li><li>Olsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clash+of+traditions:+the+history+of+comparative+and+experimental+embryology+in+Sweden+as+exemplified+by+the+research+of+G&#246;sta+J&#228;gersten+and+Sven+H&#246;rstadius.">A clash of traditions: the history of comparative and experimental embryology in Sweden as exemplified by the research of G&#246;sta J&#228;gersten and Sven H&#246;rstadius.</a> Theory Biosci. 126, 117-129 (2007).</li><li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+Parhyale+hawaiensis+blastomeres+with+fluorescently+labeled+tracers.">Injection of Parhyale hawaiensis blastomeres with fluorescently labeled tracers.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li><li>Chaw, R., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+migration+of+cell+populations+in+the+early+gastrulation+of+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">Independent migration of cell populations in the early gastrulation of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Biol. 371, 94-109 (2012).</li><li>Schmitz, E. H., Harrison, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crustacea+Microscopic+Anatomy+of+Invertebrates.">Crustacea Microscopic Anatomy of Invertebrates.</a> Microscopic Anatomy of Invertebrates. 9, 443-528 (1992).</li></ol>

نحن تصف بروتوكول للالاجتثاث دليل والإزالة المادية كاملة من واحد عن Blastomeres من مراحل الانقسام في وقت مبكر من amphipod P. hawaiensis. ونحن لشرح استخدام هذا البروتوكول عن طريق إزالة واحدة خط الجرثومية الخلية السلائف ز من ثماني خلايا مرحلة الجنين، وتبين أن الاجتثاث ق?...

برزت Parhyale hawaiensis amphipod القشريات على مدى العقد الماضي كنموذج كائن واعدة مع إمكانات كبيرة لاستخدامها في البحوث التطورية البيولوجيا التطورية 1. بين المفصليات، معظم أنظمة النموذج هي الحشرات، ودرس على نطاق واسع معظم هذه هي ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة السوداء البطن. D. البطن هو عضو من ذوات الجناحين أجل الحشرات، وعلى هذا النحو يعرض العديد من الميزات الجنينية التي يتم اشتقاق فيما يتعلق بتلك المتفرعة من باسالي الحشرات 2. علاوة على ذلك، يتم تداخل الحشرات داخل شعيبة Pancrustacea 3، وهذا يعني أن الحشرات لها أقرب أقربائهم داخل الجماعة منذ فترة طويلة &quot;طبيعية&quot; ودعا pancrustaceans، وأن هذه المجموعة هي paraphyletic. وهذا يشير إلى أنه بالإضافة إلى المتفرعة باسالي نماذج الحشرات، وهناك حاجة لدراسات أخرى لمن القشريات اكتساب نظرة اوسع من التاريخ التطوري للالصفات التنموية والآليات الجزيئية الثانية التي تم دراستها بشكل جيد في D. البطن. ومع ذلك، عدد قليل جدا من القشريات تم راسخة لتحليل المختبر التجريبي للتنمية. وamphipod P. hawaiensis هو نظام نموذجي مختبر لين العريكة للغاية، قابلة لمجموعة من التقنيات التجريبية. عرض مزدوجات الأرجل العديد من المزايا الفريدة داخل فوق رتبة الأم Peracarida (النطاط الشاطئ، وصواريخ سكود، والجمبري جيدا)، ولذلك يعتقد أن تستمد نسبيا ضمن هذه المجموعة من القشريات. ومع ذلك، فإن السهولة النسبية في التلاعب الجيني الجنينية والوظيفية التي توفرها Parhyale جعل هذا amphipod إضافة قيمة إلى المخزون الحالي للكائنات النموذج. كحيوان المختبر، P. hawaiensis توفر العديد من المزايا. الحيوانات متسامحون إلى مجموعة واسعة من درجات الحرارة والملوحة، والبقاء على قيد الحياة بشكل جيد في الثقافات كبيرة من مياه البحر الاصطناعي 1. فمن السهل أن نميز betwالذكور والإناث التابعين على أساس الاختلافات الشكلية واضحة، وعلى الأخص، وكبيرة، مدمن مخدرات، والزوائد الجذع الأمامي أن الذكور استخدامها لفهم الإناث أثناء التزاوج. للعمل الجنينية والتنموية، P. hawaiensis لديها العديد من الميزات جذابة جدا. مرحلة التطور الجنيني تستغرق حوالي 10 يوما والوقت لمرحلة النضج الجنسي ما يقرب من ستة أسابيع عند 28 º C (لكن لاحظ أن Parhyale ينجو جيدا في درجات حرارة تتراوح من حوالي 20-30 º C، وأن معلومات مفصلة التدريج التنموية متاح للأجنة التي أثيرت في 18 º C 4 ، 25 º C 4، و 26 º C 5،6). البالغين تتزاوج على مدار السنة في المختبر، لذلك هي الأجنة متوفرة في أي وقت من السنة. وضع الإناث 2-20 (اعتمادا على عمر الأنثى) البويضات المخصبة في الحقيبة الحضنة بطني الواقعة بين أول عدة أزواج من الأرجل (أرقام 1A و 1B)، وأنه من الممكن لجمع هذه الأجنةق في التنمية في وقت مبكر جدا من دون قتل الأنثى أو إتلاف الأجنة (الشكل 1C). الأجنة البقاء على قيد الحياة في تصفية مياه البحر الاصطناعي حتى الفقس، يمكن ان تكون ثابتة للالتعبير الجيني لاحقة أو التحليل النسيجي 7، ويسمح جدول التدريج مفصلة التحديد الدقيق للتقدم من خلال التنمية 5. وقد استخدمت بروتوكولات قوية لإجراء تحليل التعبير الجيني عن طريق الموقع التهجين أو المناعية 8-15 4،16،17 في، ضربة قاضية الوظيفية التي تدخل الحمض النووي الريبي 13،15 أو 12 morpholinos، ومستقرة خط نقل الجينات الجرثومية 18. باستخدام نظام نقل الجينات والتعبير ومحرض 14 فخ محسن ويمكن أيضا أن تستخدم أساليب 19 للتحقيق وظيفة الجين في P. hawaiensis. في حين أن تسلسل الجينوم للجمهور غير متوفر حاليا، والتي تحتوي على Transcriptome على النصوص التي تنتج أثناء التطور الجنيني وoogenesis والنحلن دي نوفو تجميعها والمشروح 20، وأودعت في قاعدة بيانات يمكن البحث 21، وتسهيل اكتشاف الجينات. باختصار، P. hawaiensis هو كائن نموذج لين العريكة للغاية ومناسبة لمناهج تجريبية وراثية متعددة لفهم التنمية. على عكس الانقسامات المخلوي في وقت مبكر من D. البطن، P. الأجنة hawaiensis يلتصق holoblastically بعد الإخصاب (الشكل 2A). وقد أظهرت نسب تحليل تتبع ذلك عن طريق الانقسام الثالث، والحظ كل من انشقاق عن Blastomeres الثالث على وجه التحديد أن تؤدي إلى واحدة من الطبقات الجرثومية الثلاث أو خط الجرثومية 6 (الشكل 2B). هذه البيانات، جنبا إلى جنب مع بيانات ميكروأري 22، نسب خلية يحلل 6،23، ولقد اقترح التجارب قسيم أرومي العزلة 4 أن الإمكانيات التنموية هي منفصلة على الأقل بعض انشقاق عن Blastomeres الثالث بالميراث غير المتماثلة من سلل المحددات مصير. وفقا لذلك، في التجارب قسيم أرومي الاجتثاث التي تمت إزالة السلائف خط الجرثومية (وهو ما يسمى &quot;ز&quot; في Parhyale النسب الخلية التسميات 6) في مرحلة الخلية الثمانية، تفتقر الأجنة الخلايا الجرثومية في المراحل التنموية في وقت لاحق 4، كما يدل على ذلك عدم وجود خلايا معربا عن البروتين فاسا، الذي هو علامة خط الجرثومية في معظم metazoans 24. في المقابل، أظهرت التجارب الجسدية الاجتثاث قسيم أرومي أن P. الأجنة hawaiensis أيضا تمتلك قدرات تنظيمية كبيرة، مثل أن مصير الأديم المتوسط ​​أو الأديم الظاهر عن Blastomeres السلائف ذاب في مرحلة الثمانية خلايا يمكن الاستيلاء عليها من قبل أحفاد بعض عن Blastomeres المتبقية 25. كيف يمكن أن يحدث التنظيمية استبدال مصير الخلية، ومدى الحكم الذاتي اعتماد مصير خلية جسدية من قبل عن Blastomeres، ما زال مجهولا. تقنيات الجنينية التجريبية مثل قسيم أرومي الاجتثاث يمكن أن تكون مفيدة في فهمهاقرع الاستقلالية النسبية وnonautonomy القرارات مصير الخلية 26،27، وبالتالي فهي ذات أهمية في دراسة P. hawaiensis مرحلة التطور الجنيني. في التجارب التي أثبتت استبدال التنظيمية من الأدمة وأرومية متوسطة الأنساب، تم تنفيذ الاجتثاث قسيم أرومي عن طريق الحقن 28 و الإثارة اللاحقة من الأصباغ الضوئية 25. في حين أن هذا الأسلوب هو فعالة في قتل قسيم أرومي حقن (ق)، فإنه لا إزالة خلايا الجسم الميتة من الجنين. بالإضافة إلى ذلك، لوحظت اختلافات بين البيانات التي تجمع من خلال النسب الخلية إلى مراحل تكون المعيدة من التطور الجنيني عن طريق حقن عن Blastomeres مع استشفاف النسب الفلورسنت 28،29، والبيانات التي جمعتها التالية عن Blastomeres رابط الجأش من خلال تطوير نفس المراحل الجنينية 23. ولذلك قد الإزالة المادية كاملة من عن Blastomeres محددة يكون الأسلوب المفضل الاجتثاث عن بعض التطبيقات. نشرنا سابقا نتائج النسب خلية تحليل الأجنة في الخلايا التي تم واحد ذاب 23 يدويا. ومع ذلك، فإن عمليات حساسة المطلوبة لإزالة واحدة من أوائل عن Blastomeres الانقسام الأجنة المرحلة لم يتم وصفها بشكل كامل. هنا نقدم بروتوكول لجمع P. الأجنة hawaiensis والاجتثاث دليل لقسيم أرومي واحد من ثمانية خلايا الجنين المرحلة. الهدف من هذا الأسلوب هو تحقيق الإزالة الكاملة للجسم خلية من الجنين، مما يتيح مراقبة السلوكيات الخلوية والكفاءات مصير خلية من الخلايا المتبقية خلال مرحلة التطور الجنيني والتنمية في مرحلة ما بعد الجنينية. يظهر لدينا بروتوكول إزالة السلائف ز خط الجرثومية (الشكل 2C)، ولكن يمكن تطبيقها على أي خلية في المرحلة ثماني خلايا، أو عن Blastomeres من مراحل الانقسام في وقت سابق. من حيث المبدأ، يمكن تطبيق هذا البروتوكول لإزالة الخلايا واحد من أوائل الأجنة مرحلة الانقسام من آلات موسيقية أخرىص الشق holoblastically اللافقاريات البحرية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1060">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">15 cm Pasteur pipette</td>
			<td style="width:164px;">Wheaton</td>
			<td style="width:123px;">53499-630</td>
			<td style="width:495px;">For transferring intact and blastomere-ablated embryos from dish to dish. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">22 cm Pasteur pipette</td>
			<td style="width:164px;">Wheaton</td>
			<td style="width:123px;">53499-632</td>
			<td style="width:495px;">For making mouth pipette tips. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">3 cm petri dishes</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">25382-334</td>
			<td style="width:495px;">Use some unaltered to collect and store embryos; coat some with a layer of Sylgard (see below) to create a working surface for blastomere ablations. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">48-well plates</td>
			<td style="width:164px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:123px;">82051-004</td>
			<td style="width:495px;">For culturing embryos following ablation. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Bottle top filters 0.2 micron</td>
			<td style="width:164px;">Nalge Nunc International</td>
			<td style="width:123px;">28199-296</td>
			<td style="width:495px;">For creating FASW (See below) 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Bunsen burner</td>
			<td style="width:164px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">89038-530</td>
			<td style="width:495px;">For creating tungsten wire tool and fine tip of mouth pipette. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Diamond scribe</td>
			<td style="width:164px;">Musco Sports Lighting</td>
			<td style="width:123px;">52865-005</td>
			<td style="width:495px;">For creating wide-mouthed Pasteur pipettes for collecting couples. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:164px;">Forceps</td>
			<td style="width:164px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:123px;">11050-10</td>
			<td style="width:495px;">For holding anaesthetized females during removal of embryos from brood pouch. These do not have to be fine-tipped Dumont forceps - the tips can be at least as blunt as that in the forceps for which the catalogue number is listed here. 
			Fine Science Tools</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Fungizone-Amphotericin B</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">A2942</td>
			<td style="width:495px;">Add to FASW to a final concentration of 1mg/ml, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. 
			Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Glass capillaries 4 inches long, 1/0.58 OD/ID (mm)</td>
			<td style="width:164px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:123px;">1B100-4</td>
			<td style="width:495px;">need to include glass capillary and needle puller machine? 
			World Precision Instruments</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Glass watchglass 300 mm diameter</td>
			<td style="width:164px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">70543-30</td>
			<td style="width:495px;">For use in removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. 
			Electron Microscopy Sciences</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Instant Ocean Artificial Sea Water (ASW)</td>
			<td style="width:164px;">Instant Ocean</td>
			<td style="width:123px;">IS160</td>
			<td style="width:495px;">Make ASW by dissolving salt in deionized water to a salinity of X. 
			Aquatic EcoSystems</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Instant Ocean Filtered Artificial Sea Water (FASW)</td>
			<td style="width:164px;">Instant Ocean</td>
			<td style="width:123px;">IS160</td>
			<td style="width:495px;">Use 0.2 micron filters to sterilize ASW. Make up in small amounts (&#60; 250 ml) as needed. 
			Aquatic EcoSystems</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:164px;">Kimberly-Clark</td>
			<td style="width:123px;">21905-026</td>
			<td style="width:495px;">For safely breaking off the fine end of Pasteur pipettes modified for collecting couples. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Mouth pipette adaptor</td>
			<td style="width:164px;">Drummond Labware</td>
			<td style="width:123px;">A5177-5EA</td>
			<td style="width:495px;">Insert the fine pulled pasteur pipette tip into this end, to be used for removing extruded cell contents during the ablation procedure. 
			Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Mouth pipette tubing</td>
			<td style="width:164px;">Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">Z280356</td>
			<td style="width:495px;">Cut this to be long enough to comfortably hang around your neck during the ablation procedure. 
			Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Needle Puller</td>
			<td style="width:164px;">Sutter Instrument Company</td>
			<td style="width:123px;">P97</td>
			<td style="width:495px;">For making needles from glass capillaries for puncturing the blastomere to be ablated. 
			Sutter Instrument Company</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td style="width:164px;">Mediatech</td>
			<td style="width:123px;">45000-650</td>
			<td style="width:495px;">Add to FASW to a final concentration of 100 units/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Rubber bulb</td>
			<td style="width:164px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">100488-418</td>
			<td style="width:495px;">For using Pasteur pipettes to transfer embryos from dish to dish. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Sylgard 184</td>
			<td style="width:164px;">K. R. Anderson, Inc.</td>
			<td style="width:123px;">NC9659604</td>
			<td style="width:495px;">Make up according to manufacturer&#39;s instructions. Pour a layer 2-5 mm thick into a 3cm petri dish to create a working surface for blastomere ablations. 
			Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Tungsten wire 0.004 inches diameter</td>
			<td style="width:164px;">A-M Systems</td>
			<td style="width:123px;">719000</td>
			<td style="width:495px;">Use this to make a tool for removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. 
			A-M Systems</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ablation of a single cell from eight-cell embryos of the amphipod crustacean parhyale hawaiensis

وhawaiensis amphipod Parhyale هو القشريات الصغيرة وجدت في الموائل البحرية المد والجزر في جميع أنحاء العالم. على مدى العقد الماضي، برز Parhyale كما كائن نموذج واعد للدراسات المختبرية للتنمية، وتوفير المقارنة outgroup مفيدة للمدروسة نموذج المفصلية الحي ذبابة الفاكهة السوداء البطن. وعلى النقيض من الانشقاقات المخلوي من ذبابة الفاكهة، والانشقاقات في وقت مبكر من Parhyale هي شمولي التنسج. تعيين مصير باستخدام الأصباغ التتبع حقنها في وقت مبكر عن Blastomeres أظهرت أن وضعت كل الطبقات الجرثومية الثلاث وخط الجرثومية التي كتبها المرحلة ثمانية الخلايا. في هذه المرحلة، والحظ ثلاثة عن Blastomeres أن تؤدي إلى الأديم الظاهر، ومقدر لثلاثة تؤدي إلى الأديم المتوسط، وعن Blastomeres المتبقيين هي السلائف من الأديم الباطن والجرثومية خط على التوالي. ومع ذلك، فقد أظهرت التجارب الاجتثاث قسيم أرومي أن الأجنة Parhyale أيضا تمتلك قابليات تنظيمية كبيرةوفاق، مثل أن مصائر عن Blastomeres ذاب في مرحلة ثماني خلايا يمكن الاستيلاء عليها من قبل أحفاد بعض عن Blastomeres المتبقية. وقد سبق وصفها قسيم أرومي الاجتثاث من جانب واحد من طريقتين: حقن وتفعيل لاحقة من الأصباغ الضوئية أو الاجتثاث اليدوي. ومع ذلك، جذ بالضوء يقتل عن Blastomeres ولكنه لا يزيل خلايا الجسم الميتة من الجنين. ولذلك قد الإزالة المادية كاملة من عن Blastomeres محددة يكون الأسلوب المفضل الاجتثاث عن بعض التطبيقات. هنا نقدم بروتوكول للالإزالة اليدوية للعن Blastomeres واحدة من مرحلة الثمانية خلايا الأجنة Parhyale، مما يدل على الأدوات والإجراءات اليدوية اللازمة لإزالة كاملة من خلايا الجسم مع الحفاظ على ما تبقى على قيد الحياة عن Blastomeres وسليمة. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول إلى أي خلية Parhyale في مرحلة الثمانية خلايا، أو عن Blastomeres الأخرى مراحل الانقسام في وقت مبكر. بالإضافة إلى ذلك، من حيث المبدأ هذا البروتوكول يمكن أن تطبق على الحريه في وقت مبكرvage الأجنة مرحلة أخرى اللافقاريات البحرية الشق holoblastically.

التالية الاجتثاث ناجحة من الانقسام ثالث واحد P. micromeres hawaiensis كما هو موضح في هذا البروتوكول، وmicromeres المتبقية التحول تدريجيا مواقعها قليلا وذلك لتحتل جزئيا المساحة المحتلة سابقا من قبل قسيم أرومي ذاب. على سبيل المثال، عندما تتم إزالة غرام، المجاورة ع...

Watch this Scientific Journal Video about Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis at JoVE.com

Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis

وhawaiensis amphipod Parhyale هو كائن نموذج واعد للدراسات علم الأجنة القشريات والتنمية المفصلية المقارن والتطور. يصف هذا البروتوكول وسيلة لإزالة دليل عن Blastomeres احد من بداية مرحلة الانقسام الأجنة من Parhyale.

الاجتثاث من خلية واحدة من خلايا الأجنة ثمانية من القشريات Amphipod<em&gt; Parhyale hawaiensis</em

The amphipod Parhyale hawaiensis is a small crustacean found in intertidal marine habitats worldwide. Over the past decade, Parhyale has emerged as a ...

Research

JoVE Journal

Biology

Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

تشريح المنظم وExplants القطب الحيواني من أجنة القيطم المورق وجمعية خلية الفحص الالتصاق

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

التحضير للثقافات متعلق بالخلايا العصبية من أجنة ذبابة الفاكهة المرحلة Midgastrula

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

إعداد وحيدة الخلية معلقات من الطحال ماوس مع Dissociator gentleMACS

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual ...

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

جيل وحيدة الخلية معلقات من الأنسجة العصبية ماوس

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Single Cell Transfection in Chick Embryos

وحيد الخلية في الأجنة ترنسفكأيشن الفرخ

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

الخلية الأولية من الثقافات ذبابة الفاكهة الأجنة المعيدة

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

تذرية الليزر للاسماك الزرد سليفة الكلوة لدراسة التجديد طلائي الكلوي

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

العزلة وتنقية كينيسين من ذبابة الفاكهة الأجنة

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos

مجموعة خلايا واحدة من الخلايا الأرومية الترونفوبلاست في مرحلة زرع الأجنة البشرية

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a ...

Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing

تحضير معلق أحادي الخلية من أمعاء البلطي النيلي لتسلسل الخلية الواحدة

Nile tilapia is one of the most commonly cultured freshwater fish species worldwide and is a widely used research model for aquaculture fish studies. The ...