Name: ablation of a single cell from eight-cell embryos of the amphipod crustacean parhyale hawaiensis
Uploaded: 2014-03-16T23:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis at JoVE.com

Ringraziamo Rayhan Arif e Hassaan Shahawy per il lavoro della macchina fotografica, Tripti Gupta e Frederike Alwes per l&#39;assistenza affinando la tecnica di ablazione delle cellule, e membri del laboratorio Extavour per il feedback sui dati, video e manoscritto. Questo lavoro è stato in parte sostenuto dalla Harvard Stem Cell Institute (Seed numero di Grant SG-0057-10-00) Ellison Medical Foundation (New Scholar Award numero AG-NS-07010-10) alla CGE, e premi Harvard programma del college di ricerca per ARN.

Commenti che possono essere utili in esecuzione di alcuni passaggi sono indicati in corsivo. 1. Giorno 1: Preparazione dei Materiali <ol><li> Preparare i seguenti materiali (cfr. tabella dei Materiali e attrezzature): <ul><li> 15 cm e 22 cm pipette Pasteur </li><li> Diamante scriba </li><li> acqua di mare artificiale filtrata (salinità tra 0,0018-0,0020) contenente 1 mg / ml di amfotericina B (1:100 di una soluzione madre di 100 mg / ml), 100 unità / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina ...

<ol>
	<li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3.">Chapter 3.</a> Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual Volume. , 373-404 .</li><li>Sander, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+insect+embryogenesis:+the+evolution+of+concepts+and+mechanisms.">Pattern formation in insect embryogenesis: the evolution of concepts and mechanisms.</a> Int. J.Insect Morphol. Embryol. 25, 349-367 (1997).</li><li>Regier, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arthropod+relationships+revealed+by+phylogenomic+analysis+of+nuclear+protein-coding+sequences.">Arthropod relationships revealed by phylogenomic analysis of nuclear protein-coding sequences.</a> Nature. 463, 1079-1083 (2010).</li><li>Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+isolated+blastomeres+with+respect+to+germ+cell+formation+in+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">The fate of isolated blastomeres with respect to germ cell formation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Biol. 277, 387-402 (2005).</li><li>Browne, W. E., Price, A. L., Gerberding, M., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+in+the+amphipod+crustacean,+Parhyale+hawaiensis.">Stages of embryonic development in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis.</a> Genesis. 42, 124-149 (2005).</li><li>Gerberding, M., Browne, W. E., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lineage+analysis+of+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis+reveals+an+early+restriction+of+cell+fates.">Cell lineage analysis of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis reveals an early restriction of cell fates.</a> Development. 129, 5789-5801 (2002).</li><li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+and+dissection+of+Parhyale+hawaiensis+embryos.">Fixation and dissection of Parhyale hawaiensis embryos.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li><li>Price, A. L., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+divergent+mechanisms+of+mesoderm+development+in+arthropods:+the+expression+of+Ph-twist+and+Ph-mef2+in+Parhyale+hawaiensis.">Investigating divergent mechanisms of mesoderm development in arthropods: the expression of Ph-twist and Ph-mef2 in Parhyale hawaiensis.</a> J. Exp. B. Dev. Evol. 310, 24-40 (2008).</li><li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+of+labeled+RNA+probes+to+fixed+Parhyale+hawaiensis+embryos.">In situ hybridization of labeled RNA probes to fixed Parhyale hawaiensis embryos.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li><li>Browne, W. W., Schmid, B. G. M., Wimmer, E. A., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+otd+orthologs+in+the+amphipod+crustacean,+Parhyale+hawaiensis.">Expression of otd orthologs in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Genes Evol. 216, 581-595 (2006).</li><li>Prpic, N. M., Telford, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+homothorax+and+extradenticle+mRNA+in+the+legs+of+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis:+evidence+for+a+reversal+of+gene+expression+regulation+in+the+pancrustacean+lineage.">Expression of homothorax and extradenticle mRNA in the legs of the crustacean Parhyale hawaiensis: evidence for a reversal of gene expression regulation in the pancrustacean lineage.</a> Dev. Genes Evol. 218, 333-339 (2008).</li><li>Kizil, G., Havemann, J., Gerberding, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cells+in+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis+depend+on+Vasa+protein+for+their+maintenance+but+not+for+their+formation.">Germ cells in the crustacean Parhyale hawaiensis depend on Vasa protein for their maintenance but not for their formation.</a> Dev. Biol. 327, 320-239 (2009).</li><li>Liubicich, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+Parhyale+Ultrabithorax+recapitulates+evolutionary+changes+in+crustacean+appendage+morphology.">Knockdown of Parhyale Ultrabithorax recapitulates evolutionary changes in crustacean appendage morphology.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13892-13896 (2009).</li><li>Pavlopoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+evolution+of+appendage+specialization+by+Hox+gene+misexpression+in+an+emerging+model+crustacean.">Probing the evolution of appendage specialization by Hox gene misexpression in an emerging model crustacean.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13897-13902 (2009).</li><li>Vargas-Vila, M. A., Hannibal, R. L., Parchem, R. J., Liu, P. Z., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+prominent+requirement+for+single-minded+and+the+ventral+midline+in+patterning+the+dorsoventral+axis+of+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">A prominent requirement for single-minded and the ventral midline in patterning the dorsoventral axis of the crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Development. 137, 3469-3476 (2010).</li><li>Simanton, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+arthropod+midline+netrin+accumulation+revealed+with+a+cross-reactive+antibody+provides+evidence+for+midline+cell+homology.">Conservation of arthropod midline netrin accumulation revealed with a cross-reactive antibody provides evidence for midline cell homology.</a> Evol. Dev. 11, 260-268 (2009).</li><li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+staining+of+Parhyale+hawaiensis+embryos.">Antibody staining of Parhyale hawaiensis embryos.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li><li>Pavlopoulos, A., Averof, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+genetic+transformation+for+comparative+developmental+studies+in+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">Establishing genetic transformation for comparative developmental studies in the crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 7888-7893 (2005).</li><li>Kontarakis, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+strategy+for+gene+trapping+and+trap+conversion+in+emerging+model+organisms.">A versatile strategy for gene trapping and trap conversion in emerging model organisms.</a> Development. 138, 2625-2630 (2011).</li><li>Zeng, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+assembly+and+characterization+of+a+maternal+and+developmental+transcriptome+for+the+emerging+model+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">De novo assembly and characterization of a maternal and developmental transcriptome for the emerging model crustacean Parhyale hawaiensis.</a> BMC Genom. 12, 581 (2011).</li><li>Zeng, V., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASGARD:+an+open-access+database+of+annotated+transcriptomes+for+emerging+model+arthropod+species.">ASGARD: an open-access database of annotated transcriptomes for emerging model arthropod species.</a> Database. , (2012).</li><li>Nestorov, P., Battke, F., Levesque, M. P., Gerberding, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Maternal+Transcriptome+of+the+Crustacean+Parhyale+hawaiensis+Is+Inherited+Asymmetrically+to+Invariant+Cell+Lineages+of+the+Ectoderm+and+Mesoderm.">The Maternal Transcriptome of the Crustacean Parhyale hawaiensis Is Inherited Asymmetrically to Invariant Cell Lineages of the Ectoderm and Mesoderm.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li><li>Alwes, F., Hinchen, B., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+cell+lineage,+movement,+and+migration+from+germ+layer+specification+to+gastrulation+in+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">Patterns of cell lineage, movement, and migration from germ layer specification to gastrulation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Biol. 139, 110-123 (2011).</li><li>Ewen-Campen, B., Schwager, E. E., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+machinery+of+germ+line+specification.">The molecular machinery of germ line specification.</a> Mol. Reprod. Dev. 77, 3-18 (2010).</li><li>Price, A. L., Modrell, M. S., Hannibal, R. L., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesoderm+and+ectoderm+lineages+in+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis+display+intra-germ+layer+compensation.">Mesoderm and ectoderm lineages in the crustacean Parhyale hawaiensis display intra-germ layer compensation.</a> Dev. Biol. 341, 256-266 (2010).</li><li>Fraser, S. E., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+metamorphosis+of+experimental+embryology.">The molecular metamorphosis of experimental embryology.</a> Cell. 100, 41-55 (2000).</li><li>Olsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clash+of+traditions:+the+history+of+comparative+and+experimental+embryology+in+Sweden+as+exemplified+by+the+research+of+G&#246;sta+J&#228;gersten+and+Sven+H&#246;rstadius.">A clash of traditions: the history of comparative and experimental embryology in Sweden as exemplified by the research of G&#246;sta J&#228;gersten and Sven H&#246;rstadius.</a> Theory Biosci. 126, 117-129 (2007).</li><li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+Parhyale+hawaiensis+blastomeres+with+fluorescently+labeled+tracers.">Injection of Parhyale hawaiensis blastomeres with fluorescently labeled tracers.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li><li>Chaw, R., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+migration+of+cell+populations+in+the+early+gastrulation+of+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">Independent migration of cell populations in the early gastrulation of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Biol. 371, 94-109 (2012).</li><li>Schmitz, E. H., Harrison, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crustacea+Microscopic+Anatomy+of+Invertebrates.">Crustacea Microscopic Anatomy of Invertebrates.</a> Microscopic Anatomy of Invertebrates. 9, 443-528 (1992).</li></ol>

Descriviamo un protocollo per l&#39;ablazione manuale e rimozione fisica completa di singoli blastomeri dalle fasi iniziali della scissione del anfipode P. hawaiensis. Dimostriamo l&#39;uso di questo protocollo rimuovendo la singola linea germinale cellula precursore g da una fase embrionale di otto cellule, e dimostrare che l&#39;ablazione ha avuto successo, confermando l&#39;assenza di s &#39;g cellule figlie in embriogenesi più tardi. Questo protocollo può essere utilizzat...

Il Parhyale hawaiensis anfipode crostaceo è emerso negli ultimi dieci anni come organismo modello promettente con un grande potenziale per l&#39;uso in biologia dello sviluppo evolutivo di ricerca 1. Tra gli artropodi, la maggior parte dei sistemi modello sono insetti, e il più ampiamente studiati di questi è il moscerino della frutta Drosophila melanogaster. D. melanogaster è un membro dell&#39;ordine dei Ditteri insetti, e come tale visualizza molte caratteristiche embrionali derivate rispetto a quelli degli insetti basally ramificazione 2. Inoltre, gli insetti sono annidati all&#39;interno del subphylum Pancrustacea 3, il che significa che gli insetti hanno i loro parenti più stretti all&#39;interno del gruppo di lunga data &quot;naturale&quot; chiamato pancrustaceans, e che questo gruppo è parafiletico. Ciò suggerisce che oltre alla ramificazione basally modelli insetti, studi di altri crostacei sono necessari per ottenere una visione più ampia della storia evolutiva dei tratti di sviluppo unmeccanismi molecolari nd che sono stati così ben studiate in D. melanogaster. Tuttavia, poche crostacei sono stati ben stabiliti per analisi di laboratorio sperimentale di sviluppo. Il anfipode P. hawaiensis è altamente trattabile sistema modello di laboratorio, suscettibili di una serie di tecniche sperimentali. Anfipodi mostrano molte caratteristiche uniche nel loro superorder genitori Peracarida (tramogge spiaggia, scudi, e gamberetti così), e sono quindi pensati per essere relativamente derivato all&#39;interno di questo gruppo di crostacei. Tuttavia, la relativa facilità di manipolazione genetica embrionale e funzionale offerto da Parhyale rendono questo anfipode una preziosa aggiunta alla corrente inventario di organismi modello. Come un animale da laboratorio, P. hawaiensis offre molti vantaggi. Gli animali sono tolleranti ad una vasta gamma di temperature e salinità, e sopravvivono bene in grandi culture di acqua di mare artificiale 1. E &#39;facile distinguere between maschi e femmine sulla base di differenze morfologiche evidenti, più in particolare, i grandi, uncinate, appendici tronco anteriori che i maschi usano per afferrare le femmine durante l&#39;accoppiamento. Per il lavoro embrionale e dello sviluppo, P. hawaiensis ha diverse caratteristiche molto interessanti. Embriogenesi dura circa 10 giorni e il tempo per la maturità sessuale è di circa sei settimane a 28 ° C (ma si noti che Parhyale sopravvive bene a temperature che variano da circa il 20-30 º C, e che informazioni dettagliate messa in scena dello sviluppo è disponibile per gli embrioni sollevate a 18 º C 4 , 25 ° C 4, e 26 ° C 5,6). Adulti si accoppiano tutto l&#39;anno in laboratorio, in modo da embrioni sono disponibili in qualsiasi periodo dell&#39;anno. Le femmine depongono 2-20 (a seconda dell&#39;età delle donne) uova fecondate in un sacchetto covata ventrale che si trova tra le prime paia di zampe (Figure 1A e 1B), ed è possibile raccogliere questi embrionis molto presto nello sviluppo senza uccidere la femmina o danneggiare gli embrioni (Figura 1C). Gli embrioni sopravvivono in acqua di mare artificiale filtrata fino alla schiusa, possono essere fissati per l&#39;espressione genica o successiva analisi istologica 7, e una tabella dettagliata di gestione temporanea permette l&#39;identificazione precisa dei progressi attraverso lo sviluppo 5. Protocolli robusti sono stati utilizzati per effettuare analisi di espressione genica mediante ibridazione in situ 8-15 o immunoistochimica 4,16,17, knockdown funzionale mediante RNA interference 13,15 o Morpholinos 12, e la linea germinale stabile transgenesi 18. Utilizzando il sistema di transgenesi, espressione inducibile 14 e trappola enhancer 19 metodi possono anche essere usati per studiare la funzione del gene in P. hawaiensis. Mentre una sequenza del genoma a disposizione del pubblico non è al momento disponibile, un trascrittoma contenente le trascrizioni prodotta durante oogenesi e embriogenesi ha apen de novo assemblati e annotati 20, e depositati in un database consultabile 21, facilitando la scoperta del gene. In sintesi, P. hawaiensis è un organismo modello molto maneggevole adatto per molteplici approcci sperimentali e genetici per comprendere lo sviluppo. A differenza delle prime fratture sinciziale di D. melanogaster, P. embrioni hawaiensis fendere holoblastically segue fecondazione (Figura 2A). Lineage tracing analisi ha mostrato che dal terzo clivaggio, ciascuno dei terzi blastomeri scissione è specificamente destinata a dare origine ad uno dei tre strati germinali o la linea germinale 6 (Figura 2B). Questi dati, insieme ai dati di microarray 22, linea cellulare analisi 6,23, e gli esperimenti di isolamento blastomere 4 hanno suggerito che le potenzialità di sviluppo sono separate da almeno alcuni terzi blastomeri scissione di eredità asimmetrica del cell determinanti destino. Pertanto, in esperimenti blastomere ablazione in cui il precursore linea germinale (chiamato &quot;g&quot; nella linea cellulare nomenclatura Parhyale 6) è stato rimosso nella fase otto cellule, embrioni mancavano cellule germinali in successivi stadi di sviluppo 4, come indicato dall&#39;assenza di cellule esprimendo la proteina Vasa, che è un marker germinale nella maggior metazoi 24. Al contrario, somatiche esperimenti ablazione blastomeri hanno mostrato che P. embrioni hawaiensis possiedono anche notevoli capacità di regolamentazione, in modo tale che le sorti del mesoderma o ectoderma blastomeri precursori ablati allo stadio di otto cellule possono essere presi in consegna dai discendenti di alcuni dei restanti 25 blastomeri. Come regolativo sostituzione destino delle cellule può verificarsi, e il grado di autonomia adozione destino delle cellule somatiche da blastomeri, rimane sconosciuto. Sperimentali tecniche embriologiche come blastomere ablazione può essere utile a comprending l&#39;autonomia relativa e nonautonomy delle decisioni destino delle cellule 26,27 e sono quindi di interesse per lo studio di P. hawaiensis embriogenesi. Negli esperimenti che hanno dimostrato la sostituzione regolatore del ectodermici e mesodermici lignaggi, ablazione blastomeri è stata eseguita mediante iniezione 28 e la successiva eccitazione coloranti fototossiche 25. Mentre questa tecnica è efficace a uccidere il blastomeri (s) iniettato, non rimuove completamente il corpo cellula morta dall&#39;embrione. Inoltre, sono state osservate differenze tra i dati raccolti attraverso il lignaggio delle cellule agli stadi gastrulazione dell&#39;embriogenesi iniettando blastomeri con traccianti fluorescenti lignaggio 28,29, ei dati raccolti seguendo blastomeri imperturbati attraverso lo sviluppo degli stessi stadi embrionali 23. Completa rimozione fisica di blastomeri specifici può quindi essere un metodo preferito di ablazione per alcune applicazioni. Abbiamo già pubblicato i risultati della linea cellulare analisi degli embrioni in cui singole cellule sono state asportato manualmente 23. Tuttavia, le delicate operazioni necessarie per rimuovere i singoli blastomeri dai primi scissione embrioni fase non sono ancora state pienamente descritte. Qui vi presentiamo un protocollo per la raccolta di P. embrioni hawaiensis e ablazione manuale di un singolo blastomero da un embrione di otto cellule. L&#39;obiettivo di questo metodo è quello di ottenere la rimozione completa del corpo cellulare dall&#39;embrione, che permette l&#39;osservazione dei comportamenti cellulari e competenze destino cellulare delle restanti cellule durante l&#39;embriogenesi e sviluppo post-embrionale. Il nostro protocollo mostra rimozione del precursore g germinale (Figura 2C), ma può essere applicato a qualsiasi cella nella fase di otto cellule, o di blastomeri di scissione fasi precedenti. In linea di principio, questo protocollo potrebbe essere applicato a rimuovere le singole cellule da embrioni precoci fase scissione di Other holoblastically cleaving invertebrati marini.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1060">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">15 cm Pasteur pipette</td>
			<td style="width:164px;">Wheaton</td>
			<td style="width:123px;">53499-630</td>
			<td style="width:495px;">For transferring intact and blastomere-ablated embryos from dish to dish. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">22 cm Pasteur pipette</td>
			<td style="width:164px;">Wheaton</td>
			<td style="width:123px;">53499-632</td>
			<td style="width:495px;">For making mouth pipette tips. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">3 cm petri dishes</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">25382-334</td>
			<td style="width:495px;">Use some unaltered to collect and store embryos; coat some with a layer of Sylgard (see below) to create a working surface for blastomere ablations. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">48-well plates</td>
			<td style="width:164px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:123px;">82051-004</td>
			<td style="width:495px;">For culturing embryos following ablation. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Bottle top filters 0.2 micron</td>
			<td style="width:164px;">Nalge Nunc International</td>
			<td style="width:123px;">28199-296</td>
			<td style="width:495px;">For creating FASW (See below) 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Bunsen burner</td>
			<td style="width:164px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">89038-530</td>
			<td style="width:495px;">For creating tungsten wire tool and fine tip of mouth pipette. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Diamond scribe</td>
			<td style="width:164px;">Musco Sports Lighting</td>
			<td style="width:123px;">52865-005</td>
			<td style="width:495px;">For creating wide-mouthed Pasteur pipettes for collecting couples. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:164px;">Forceps</td>
			<td style="width:164px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:123px;">11050-10</td>
			<td style="width:495px;">For holding anaesthetized females during removal of embryos from brood pouch. These do not have to be fine-tipped Dumont forceps - the tips can be at least as blunt as that in the forceps for which the catalogue number is listed here. 
			Fine Science Tools</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Fungizone-Amphotericin B</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">A2942</td>
			<td style="width:495px;">Add to FASW to a final concentration of 1mg/ml, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. 
			Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Glass capillaries 4 inches long, 1/0.58 OD/ID (mm)</td>
			<td style="width:164px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:123px;">1B100-4</td>
			<td style="width:495px;">need to include glass capillary and needle puller machine? 
			World Precision Instruments</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Glass watchglass 300 mm diameter</td>
			<td style="width:164px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">70543-30</td>
			<td style="width:495px;">For use in removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. 
			Electron Microscopy Sciences</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Instant Ocean Artificial Sea Water (ASW)</td>
			<td style="width:164px;">Instant Ocean</td>
			<td style="width:123px;">IS160</td>
			<td style="width:495px;">Make ASW by dissolving salt in deionized water to a salinity of X. 
			Aquatic EcoSystems</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Instant Ocean Filtered Artificial Sea Water (FASW)</td>
			<td style="width:164px;">Instant Ocean</td>
			<td style="width:123px;">IS160</td>
			<td style="width:495px;">Use 0.2 micron filters to sterilize ASW. Make up in small amounts (&#60; 250 ml) as needed. 
			Aquatic EcoSystems</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:164px;">Kimberly-Clark</td>
			<td style="width:123px;">21905-026</td>
			<td style="width:495px;">For safely breaking off the fine end of Pasteur pipettes modified for collecting couples. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Mouth pipette adaptor</td>
			<td style="width:164px;">Drummond Labware</td>
			<td style="width:123px;">A5177-5EA</td>
			<td style="width:495px;">Insert the fine pulled pasteur pipette tip into this end, to be used for removing extruded cell contents during the ablation procedure. 
			Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Mouth pipette tubing</td>
			<td style="width:164px;">Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">Z280356</td>
			<td style="width:495px;">Cut this to be long enough to comfortably hang around your neck during the ablation procedure. 
			Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Needle Puller</td>
			<td style="width:164px;">Sutter Instrument Company</td>
			<td style="width:123px;">P97</td>
			<td style="width:495px;">For making needles from glass capillaries for puncturing the blastomere to be ablated. 
			Sutter Instrument Company</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td style="width:164px;">Mediatech</td>
			<td style="width:123px;">45000-650</td>
			<td style="width:495px;">Add to FASW to a final concentration of 100 units/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Rubber bulb</td>
			<td style="width:164px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">100488-418</td>
			<td style="width:495px;">For using Pasteur pipettes to transfer embryos from dish to dish. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Sylgard 184</td>
			<td style="width:164px;">K. R. Anderson, Inc.</td>
			<td style="width:123px;">NC9659604</td>
			<td style="width:495px;">Make up according to manufacturer&#39;s instructions. Pour a layer 2-5 mm thick into a 3cm petri dish to create a working surface for blastomere ablations. 
			Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Tungsten wire 0.004 inches diameter</td>
			<td style="width:164px;">A-M Systems</td>
			<td style="width:123px;">719000</td>
			<td style="width:495px;">Use this to make a tool for removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. 
			A-M Systems</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ablation of a single cell from eight-cell embryos of the amphipod crustacean parhyale hawaiensis

Il hawaiensis anfipode Parhyale è un piccolo crostaceo trovato in intercotidali habitat marini di tutto il mondo. Negli ultimi dieci anni, Parhyale è emerso come organismo modello promettente per studi di laboratorio di sviluppo, fornendo un confronto outgroup utile al ben studiato modello artropodi organismo Drosophila melanogaster. In contrasto con le fratture sinciziale di Drosophila, i primi divisioni di Parhyale sono holoblastic. Mappatura Fate utilizzando coloranti traccianti iniettati nel primi blastomeri hanno dimostrato che tutti e tre i foglietti embrionali e la linea germinale sono stabiliti dallo stadio di otto cellule. In questa fase, tre blastomeri predestinati per dare luogo alla ectoderma, tre sono destinata a dare origine al mesoderma, e gli altri due blastomeri sono rispettivamente i precursori della linea endoderma e germe. Tuttavia, gli esperimenti di ablazione blastomeri hanno dimostrato che gli embrioni Parhyale possiedono anche significativo capabiliti normativoes, in modo tale che i destini di blastomeri ablati allo stadio di otto cellule possono essere presi in consegna dai discendenti di alcuni dei restanti blastomeri. Blastomere ablazione è stato precedentemente descritto da uno dei due metodi: iniezione e successiva attivazione di coloranti fototossiche o ablazione manuale. Tuttavia, fotoablazione uccide blastomeri ma non rimuove il corpo cellulare morto dall&#39;embrione. Completa rimozione fisica di blastomeri specifici può quindi essere un metodo preferito di ablazione per alcune applicazioni. Qui vi presentiamo un protocollo per la rimozione manuale dei singoli blastomeri dalla fase di otto cellule di embrioni Parhyale, illustrando gli strumenti e le procedure manuali necessarie per la rimozione completa del corpo cellulare mantenendo vivo e intatto rimanenti blastomeri. Questo protocollo può essere applicato a qualsiasi cella Parhyale allo stadio di otto cellule, o blastomeri di altre fasi iniziali della scissione. Inoltre, in linea di principio questo protocollo possa essere applicabile ai primi di CleaVage embrioni stadio di altri invertebrati marini holoblastically fendendo.

Dopo il successo ablazione del singolo terzi scissione P. micromeri hawaiensis come descritto in questo protocollo, i restanti micromeri progressivamente spostano le loro posizioni leggermente in modo da occupare parzialmente lo spazio precedentemente occupato dal blastomero ablato. Per esempio, quando g viene rimosso, la vicina blastomeri mr e ML spostare leggermente e venire a condividere i bordi delle celle laterali che erano precedentemente in diretto contatto con ...

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Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis

Il hawaiensis anfipode Parhyale è un organismo modello promettente per studi di embriologia crostacei e sviluppo artropodi comparativa e l&#39;evoluzione. Questo protocollo descrive un metodo per la rimozione manuale dei singoli blastomeri da embrioni precoci stadio di clivaggio Parhyale.

Ablazione di una singola cella da otto cellule embrioni dei crostacei anfipodi<em&gt; Parhyale hawaiensis</em

The amphipod Parhyale hawaiensis is a small crustacean found in intertidal marine habitats worldwide. Over the past decade, Parhyale has emerged as a ...

Research

JoVE Journal

Biology

Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

Dissezione di organizzatore e Espianti Polo animali da embrioni di Xenopus laevis e montaggio di un saggio Adesione Cellulare

Ricerca

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