Name: ablation of a single cell from eight-cell embryos of the amphipod crustacean parhyale hawaiensis
Uploaded: 2014-03-16T23:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis at JoVE.com

Vi takker Rayhan Arif og Hassaan Shahawy for kamera arbeid, Tripti Gupta og Frederike Alwes for assistanse avgrense cellen ablasjon teknikk, og Extavour lab medlemmer for tilbakemelding på data, video og manuskript. Dette arbeidet ble delvis støttet av Harvard Stem Cell Institute (Seed Grant nummer SG-0057-10-00) Ellison Medical Foundation (New Scholar Award nummer AG-NS-07010-10) til CGE, og Harvard College Research Program utmerkelser til ARN.

Kommentarer som kan være nyttig i å gjennomføre visse tiltak er angitt i kursiv. En. Dag 1: Utarbeidelse av materialer <ol><li> Forbered følgende materialer (se tabell av materialer og utstyr): <ul><li> 15 cm og 22 cm Pasteur pipetter </li><li> Diamond spiss </li><li> Filtrert kunstig sjøvann (saltinnhold mellom 0,0018 til 0,0020) inneholdende 1 mg / ml amfotericin B (1:100 av en 100 mg / ml stamløsning), 100 enheter / ml penicillin og 100 mg / ml streptomycin (01:50 av en stamløsning inneholde...

<ol>
	<li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3.">Chapter 3.</a> Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual Volume. , 373-404 .</li><li>Sander, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+insect+embryogenesis:+the+evolution+of+concepts+and+mechanisms.">Pattern formation in insect embryogenesis: the evolution of concepts and mechanisms.</a> Int. J.Insect Morphol. Embryol. 25, 349-367 (1997).</li><li>Regier, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arthropod+relationships+revealed+by+phylogenomic+analysis+of+nuclear+protein-coding+sequences.">Arthropod relationships revealed by phylogenomic analysis of nuclear protein-coding sequences.</a> Nature. 463, 1079-1083 (2010).</li><li>Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+isolated+blastomeres+with+respect+to+germ+cell+formation+in+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">The fate of isolated blastomeres with respect to germ cell formation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Biol. 277, 387-402 (2005).</li><li>Browne, W. E., Price, A. L., Gerberding, M., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+in+the+amphipod+crustacean,+Parhyale+hawaiensis.">Stages of embryonic development in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis.</a> Genesis. 42, 124-149 (2005).</li><li>Gerberding, M., Browne, W. E., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lineage+analysis+of+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis+reveals+an+early+restriction+of+cell+fates.">Cell lineage analysis of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis reveals an early restriction of cell fates.</a> Development. 129, 5789-5801 (2002).</li><li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+and+dissection+of+Parhyale+hawaiensis+embryos.">Fixation and dissection of Parhyale hawaiensis embryos.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li><li>Price, A. L., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+divergent+mechanisms+of+mesoderm+development+in+arthropods:+the+expression+of+Ph-twist+and+Ph-mef2+in+Parhyale+hawaiensis.">Investigating divergent mechanisms of mesoderm development in arthropods: the expression of Ph-twist and Ph-mef2 in Parhyale hawaiensis.</a> J. Exp. B. Dev. Evol. 310, 24-40 (2008).</li><li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+of+labeled+RNA+probes+to+fixed+Parhyale+hawaiensis+embryos.">In situ hybridization of labeled RNA probes to fixed Parhyale hawaiensis embryos.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li><li>Browne, W. W., Schmid, B. G. M., Wimmer, E. A., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+otd+orthologs+in+the+amphipod+crustacean,+Parhyale+hawaiensis.">Expression of otd orthologs in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Genes Evol. 216, 581-595 (2006).</li><li>Prpic, N. M., Telford, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+homothorax+and+extradenticle+mRNA+in+the+legs+of+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis:+evidence+for+a+reversal+of+gene+expression+regulation+in+the+pancrustacean+lineage.">Expression of homothorax and extradenticle mRNA in the legs of the crustacean Parhyale hawaiensis: evidence for a reversal of gene expression regulation in the pancrustacean lineage.</a> Dev. Genes Evol. 218, 333-339 (2008).</li><li>Kizil, G., Havemann, J., Gerberding, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cells+in+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis+depend+on+Vasa+protein+for+their+maintenance+but+not+for+their+formation.">Germ cells in the crustacean Parhyale hawaiensis depend on Vasa protein for their maintenance but not for their formation.</a> Dev. Biol. 327, 320-239 (2009).</li><li>Liubicich, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+Parhyale+Ultrabithorax+recapitulates+evolutionary+changes+in+crustacean+appendage+morphology.">Knockdown of Parhyale Ultrabithorax recapitulates evolutionary changes in crustacean appendage morphology.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13892-13896 (2009).</li><li>Pavlopoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+evolution+of+appendage+specialization+by+Hox+gene+misexpression+in+an+emerging+model+crustacean.">Probing the evolution of appendage specialization by Hox gene misexpression in an emerging model crustacean.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13897-13902 (2009).</li><li>Vargas-Vila, M. A., Hannibal, R. L., Parchem, R. J., Liu, P. Z., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+prominent+requirement+for+single-minded+and+the+ventral+midline+in+patterning+the+dorsoventral+axis+of+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">A prominent requirement for single-minded and the ventral midline in patterning the dorsoventral axis of the crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Development. 137, 3469-3476 (2010).</li><li>Simanton, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+arthropod+midline+netrin+accumulation+revealed+with+a+cross-reactive+antibody+provides+evidence+for+midline+cell+homology.">Conservation of arthropod midline netrin accumulation revealed with a cross-reactive antibody provides evidence for midline cell homology.</a> Evol. Dev. 11, 260-268 (2009).</li><li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+staining+of+Parhyale+hawaiensis+embryos.">Antibody staining of Parhyale hawaiensis embryos.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li><li>Pavlopoulos, A., Averof, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+genetic+transformation+for+comparative+developmental+studies+in+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">Establishing genetic transformation for comparative developmental studies in the crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 7888-7893 (2005).</li><li>Kontarakis, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+strategy+for+gene+trapping+and+trap+conversion+in+emerging+model+organisms.">A versatile strategy for gene trapping and trap conversion in emerging model organisms.</a> Development. 138, 2625-2630 (2011).</li><li>Zeng, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+assembly+and+characterization+of+a+maternal+and+developmental+transcriptome+for+the+emerging+model+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">De novo assembly and characterization of a maternal and developmental transcriptome for the emerging model crustacean Parhyale hawaiensis.</a> BMC Genom. 12, 581 (2011).</li><li>Zeng, V., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASGARD:+an+open-access+database+of+annotated+transcriptomes+for+emerging+model+arthropod+species.">ASGARD: an open-access database of annotated transcriptomes for emerging model arthropod species.</a> Database. , (2012).</li><li>Nestorov, P., Battke, F., Levesque, M. P., Gerberding, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Maternal+Transcriptome+of+the+Crustacean+Parhyale+hawaiensis+Is+Inherited+Asymmetrically+to+Invariant+Cell+Lineages+of+the+Ectoderm+and+Mesoderm.">The Maternal Transcriptome of the Crustacean Parhyale hawaiensis Is Inherited Asymmetrically to Invariant Cell Lineages of the Ectoderm and Mesoderm.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li><li>Alwes, F., Hinchen, B., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+cell+lineage,+movement,+and+migration+from+germ+layer+specification+to+gastrulation+in+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">Patterns of cell lineage, movement, and migration from germ layer specification to gastrulation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Biol. 139, 110-123 (2011).</li><li>Ewen-Campen, B., Schwager, E. E., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+machinery+of+germ+line+specification.">The molecular machinery of germ line specification.</a> Mol. Reprod. Dev. 77, 3-18 (2010).</li><li>Price, A. L., Modrell, M. S., Hannibal, R. L., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesoderm+and+ectoderm+lineages+in+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis+display+intra-germ+layer+compensation.">Mesoderm and ectoderm lineages in the crustacean Parhyale hawaiensis display intra-germ layer compensation.</a> Dev. Biol. 341, 256-266 (2010).</li><li>Fraser, S. E., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+metamorphosis+of+experimental+embryology.">The molecular metamorphosis of experimental embryology.</a> Cell. 100, 41-55 (2000).</li><li>Olsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clash+of+traditions:+the+history+of+comparative+and+experimental+embryology+in+Sweden+as+exemplified+by+the+research+of+G&#246;sta+J&#228;gersten+and+Sven+H&#246;rstadius.">A clash of traditions: the history of comparative and experimental embryology in Sweden as exemplified by the research of G&#246;sta J&#228;gersten and Sven H&#246;rstadius.</a> Theory Biosci. 126, 117-129 (2007).</li><li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+Parhyale+hawaiensis+blastomeres+with+fluorescently+labeled+tracers.">Injection of Parhyale hawaiensis blastomeres with fluorescently labeled tracers.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li><li>Chaw, R., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+migration+of+cell+populations+in+the+early+gastrulation+of+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">Independent migration of cell populations in the early gastrulation of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Biol. 371, 94-109 (2012).</li><li>Schmitz, E. H., Harrison, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crustacea+Microscopic+Anatomy+of+Invertebrates.">Crustacea Microscopic Anatomy of Invertebrates.</a> Microscopic Anatomy of Invertebrates. 9, 443-528 (1992).</li></ol>

Vi beskriver en protokoll for manuell ablasjon og fullstendig fysisk fjerning av enkelt blastomeres fra tidlige cleavage stadier av amfi P. hawaiensis. Vi demonstrere bruken av denne protokollen ved å fjerne én bakterie linjen forløper celle g fra en åtte-cellers stadiet embryo, og vise at ablasjon har vært vellykket ved å bekrefte fravær av g &#39;s datter celler i senere embryogenese. Denne protokollen kan brukes for å fjerne en hvilken som helst av de micromeres fra ...

Amfi krepsdyr Parhyale hawaiensis har dukket opp det siste tiåret som en lovende modellorganisme med stort potensial for bruk i evolusjonær utviklingsbiologi forskning en. Blant de leddyr, de fleste modellsystemer er insekter, og den mest omfattende studert av disse er bananflue Drosophila melanogaster. D. melanogaster er medlem av insekt orden Diptera, og som sådan viser mange embryologiske funksjoner som er utledet med hensyn til de av basalt forgrening insekter to. Videre er insekter nestet i subphylum Pancrustacea 3, noe som betyr at insekter har sine nærmeste slektninger i den langvarige &quot;naturlig&quot; gruppe kalt pancrustaceans, og at denne gruppen er paraphyletic. Dette tyder på at i tillegg til basalt forgrening insekt modeller, er studier av andre krepsdyr som kreves for å få et bredere syn på den evolusjonære historien til de utviklingstrekk ennd molekylære mekanismer som har blitt så godt undersøkt i D. melanogaster. Imidlertid har svært få krepsdyr blitt godt etablert for eksperimentelle laboratorieanalyse av utviklingen. Amfi P. hawaiensis er en svært medgjørlig laboratorie-modell-system, mottagelig for en rekke eksperimentelle teknikker. Amfipoder vise mange unike funksjoner innenfor deres foreldre superorder Peracarida (strand hoppers, scuds, og vel reker), og er derfor antatt å være relativt avledet innenfor denne gruppen av krepsdyr. Likevel, det er relativt enkelt for embryological og funksjonell genetisk manipulasjon tilbys av Parhyale gjøre dette amfipode et verdifullt tillegg til den nåværende beholdning av modellorganismer. Som forsøksdyr, P. hawaiensis gir mange fordeler. Planter er tolerant for et vidt område av temperaturer og saliniteter, og overleve godt i store kulturer av kunstig sjøvann 1.. Det er lett å skille between hanner og hunner basert på klare morfologiske forskjeller, særlig, de store, hektet, fremre trunk vedheng at menn bruker for å forstå kvinner under parring. For embryological og utviklingsarbeid, P. hawaiensis har flere svært tiltalende funksjoner. Embryo varer ca 10 dager og tid til kjønnsmodning er ca seks uker ved 28 º C (men merk at Parhyale overlever godt ved temperaturer fra ca 20-30 º C, og at detaljert utviklings iscenesettelse informasjon er tilgjengelig for embryoer hevet ved 18 º C 4 , 25 º C 4, og 26 º C 5,6). Voksne mate hele året i laboratoriet, slik at embryoer er tilgjengelig når som helst på året. Hunner lå 2-20 (avhengig av alderen av de kvinnelige) befruktede egg i en ventral rugepose plassert mellom de første par bein (figurene 1A og 1B), og det er mulig å samle disse embryoer veldig tidlig i utviklingen uten å drepe den kvinnelige eller ødelegger embryoer (figur 1C). Embryoene overleve i filtrert kunstig sjøvann gjennom til klekking, kan fikses for påfølgende genekspresjon eller histologisk analyse 7, og en detaljert rekkefølgetabell gir nøyaktig identifisering av fremdriften gjennom utvikling fem. Robuste protokoller har blitt brukt genekspresjonsanalyser å utføre ved in situ hybridisering 8-15 eller farging 4,16,17, funksjonell knockdown av RNA interferens 13,15 eller Morpholinos 12, og stabile kjønnsceller transgenesis 18. Ved hjelp av transgenesis system, induserbar ekspresjon 14 og enhancer-felle 19 fremgangsmåter kan også brukes til å undersøke gen-funksjon i P. hawaiensis. Mens en offentlig tilgjengelig genomsekvens er ikke tilgjengelig for øyeblikket, har en transcriptome inneholder transkripsjoner produsert under oogenesen og embryogenesis been de novo montert og kommentert 20, og deponert i en søkbar database 21, å legge til rette genet oppdagelse. I sum, P. hawaiensis er en svært medgjørlig modell organisme egnet for flere eksperimentelle og genetiske tilnærminger til å forstå utviklingen. I motsetning til de tidlige syncytialt spaltinger på D. melanogaster, P. hawaiensis embryoer holde seg holoblastically etter befruktning (Figur 2A). Avstamning tracing analyse har vist at ved tredje spalting, er hver av de tredje cleavage blastomeres spesifikt dømt til å gi opphav til en av de tre bakterie lag eller spiren linje 6 (figur 2B). Disse dataene, sammen med microarray data 22, analyserer celle avstamning 6,23, og blastomere isolasjon eksperimenter 4 har antydet at utviklingspotensialer er segregert til minst noen tredje cleavage blastomeres av asymmetrisk arv av cell skjebne determinanter. Følgelig, i blastomere ablasjon eksperimenter hvor spiren linje forløper (betegnet &quot;g&quot; i Parhyale celle lineage nomenklatur 6) ble fjernet ved åtte cellestadiet, embryoer manglet kimceller på senere utviklingsstadier 4, som vist ved fravær av cellene uttrykker proteinet Vasa, som er en bakterie linje markør i de fleste metazoans 24. I kontrast, somatiske blastomere ablasjon eksperimenter viste at P. hawaiensis embryoer også ha betydelige regulatoriske evner, slik at skjebnen til mesoderm eller ektoderm forløper blastomeres ablasjon ved åtte-cellers stadiet kan bli overtatt av etterkommere av noen av de gjenværende blastomeres 25. Hvordan regulative celle skjebne erstatning kan oppstå, og omfanget av selvstendig celle skjebne adopsjon av somatiske blastomeres, forblir ukjent. Eksperimentelle embryologiske teknikker som blastomere ablasjon kan være nyttig i forståelseding den relative autonomi og nonautonomy av celle skjebne beslutninger 26,27 og er derfor av interesse i studiet av P. hawaiensis embryogenese. I forsøkene som viste regulative utskifting av ectodermal og mesodermal linjene, ble blastomere ablasjon utføres ved injeksjon 28 og påfølgende eksitasjon av fototoksiske fargestoffer 25. Selv om denne teknikken er effektiv på å drepe den injiserte blastomere (s), betyr det ikke helt fjerne døde celler kroppen fra embryo. I tillegg har forskjellene blitt observert mellom celle avstamning data samlet gjennom å gastrulation stadier av embryogenesis ved å injisere blastomeres med fluorescerende avstamning tracere 28,29, og data samlet av følgende uaffisert blastomeres gjennom utvikling av de samme embryonale stadier 23. Fullstendig fysisk fjerning av spesifikke blastomeres kan derfor være en foretrukket metode for ablasjon i noen anvendelser. Vi har tidligere publisert resultatene av celle avstamning analyser av befruktede egg der enkeltceller ble manuelt ablasjon 23. Men de delikate operasjoner som kreves for å fjerne enkelt blastomeres fra tidlig cleavage stadium embryoer har ennå ikke blitt fullstendig beskrevet. Her presenterer vi en protokoll for samling av P. hawaiensis embryoer og manuell ablasjon av en enkelt blastomere fra en åtte-cellers stadiet embryo. Målet med denne metoden er å oppnå fullstendig fjerning av cellekroppen fra embryo, slik at observasjon av mobiltelefon atferd og celle skjebne kompetansen til de resterende celler under embryogenesis og post-embryoutvikling. Vår protokoll viser fjerning av bakterie linje forløper g (figur 2C), men kan anvendes på en hvilken som helst celle på åtte-cellestadiet, eller for å blastomeres av tidligere cleavage stadier. I prinsippet kan denne protokollen brukes til å fjerne enkeltceller fra tidlig cleavage stadium embryo av a.r holoblastically spalte marine virvelløse dyr.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1060">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">15 cm Pasteur pipette</td>
			<td style="width:164px;">Wheaton</td>
			<td style="width:123px;">53499-630</td>
			<td style="width:495px;">For transferring intact and blastomere-ablated embryos from dish to dish. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">22 cm Pasteur pipette</td>
			<td style="width:164px;">Wheaton</td>
			<td style="width:123px;">53499-632</td>
			<td style="width:495px;">For making mouth pipette tips. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">3 cm petri dishes</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">25382-334</td>
			<td style="width:495px;">Use some unaltered to collect and store embryos; coat some with a layer of Sylgard (see below) to create a working surface for blastomere ablations. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">48-well plates</td>
			<td style="width:164px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:123px;">82051-004</td>
			<td style="width:495px;">For culturing embryos following ablation. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Bottle top filters 0.2 micron</td>
			<td style="width:164px;">Nalge Nunc International</td>
			<td style="width:123px;">28199-296</td>
			<td style="width:495px;">For creating FASW (See below) 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Bunsen burner</td>
			<td style="width:164px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">89038-530</td>
			<td style="width:495px;">For creating tungsten wire tool and fine tip of mouth pipette. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Diamond scribe</td>
			<td style="width:164px;">Musco Sports Lighting</td>
			<td style="width:123px;">52865-005</td>
			<td style="width:495px;">For creating wide-mouthed Pasteur pipettes for collecting couples. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:164px;">Forceps</td>
			<td style="width:164px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:123px;">11050-10</td>
			<td style="width:495px;">For holding anaesthetized females during removal of embryos from brood pouch. These do not have to be fine-tipped Dumont forceps - the tips can be at least as blunt as that in the forceps for which the catalogue number is listed here. 
			Fine Science Tools</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Fungizone-Amphotericin B</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">A2942</td>
			<td style="width:495px;">Add to FASW to a final concentration of 1mg/ml, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. 
			Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Glass capillaries 4 inches long, 1/0.58 OD/ID (mm)</td>
			<td style="width:164px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:123px;">1B100-4</td>
			<td style="width:495px;">need to include glass capillary and needle puller machine? 
			World Precision Instruments</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Glass watchglass 300 mm diameter</td>
			<td style="width:164px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">70543-30</td>
			<td style="width:495px;">For use in removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. 
			Electron Microscopy Sciences</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Instant Ocean Artificial Sea Water (ASW)</td>
			<td style="width:164px;">Instant Ocean</td>
			<td style="width:123px;">IS160</td>
			<td style="width:495px;">Make ASW by dissolving salt in deionized water to a salinity of X. 
			Aquatic EcoSystems</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Instant Ocean Filtered Artificial Sea Water (FASW)</td>
			<td style="width:164px;">Instant Ocean</td>
			<td style="width:123px;">IS160</td>
			<td style="width:495px;">Use 0.2 micron filters to sterilize ASW. Make up in small amounts (&#60; 250 ml) as needed. 
			Aquatic EcoSystems</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:164px;">Kimberly-Clark</td>
			<td style="width:123px;">21905-026</td>
			<td style="width:495px;">For safely breaking off the fine end of Pasteur pipettes modified for collecting couples. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Mouth pipette adaptor</td>
			<td style="width:164px;">Drummond Labware</td>
			<td style="width:123px;">A5177-5EA</td>
			<td style="width:495px;">Insert the fine pulled pasteur pipette tip into this end, to be used for removing extruded cell contents during the ablation procedure. 
			Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Mouth pipette tubing</td>
			<td style="width:164px;">Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">Z280356</td>
			<td style="width:495px;">Cut this to be long enough to comfortably hang around your neck during the ablation procedure. 
			Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Needle Puller</td>
			<td style="width:164px;">Sutter Instrument Company</td>
			<td style="width:123px;">P97</td>
			<td style="width:495px;">For making needles from glass capillaries for puncturing the blastomere to be ablated. 
			Sutter Instrument Company</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td style="width:164px;">Mediatech</td>
			<td style="width:123px;">45000-650</td>
			<td style="width:495px;">Add to FASW to a final concentration of 100 units/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Rubber bulb</td>
			<td style="width:164px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">100488-418</td>
			<td style="width:495px;">For using Pasteur pipettes to transfer embryos from dish to dish. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Sylgard 184</td>
			<td style="width:164px;">K. R. Anderson, Inc.</td>
			<td style="width:123px;">NC9659604</td>
			<td style="width:495px;">Make up according to manufacturer&#39;s instructions. Pour a layer 2-5 mm thick into a 3cm petri dish to create a working surface for blastomere ablations. 
			Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Tungsten wire 0.004 inches diameter</td>
			<td style="width:164px;">A-M Systems</td>
			<td style="width:123px;">719000</td>
			<td style="width:495px;">Use this to make a tool for removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. 
			A-M Systems</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ablation of a single cell from eight-cell embryos of the amphipod crustacean parhyale hawaiensis

Amfi Parhyale hawaiensis er et lite krepsdyr som finnes i fjæra marine naturtyper over hele verden. I løpet av det siste tiåret, har Parhyale dukket opp som en lovende modellorganisme for laboratoriestudier av utviklingen, og gir en nyttig outgroup forhold til godt studert leddyr modellorganisme Drosophila melanogaster. I motsetning til de syncytialt spaltinger på Drosophila, tidlig spaltinger på Parhyale er holoblastic. Fate kartlegging ved hjelp av sporingsstoffer injiseres i tidlig blastomeres har vist at alle tre bakterie lag og spiren linjen er etablert av de åtte-cellers stadiet. På dette stadiet, er tre blastomeres skjebnebestemt til å gi opphav til ektoderm, er tre skjebnebestemt til å gi opphav til mesoderm, og de resterende to blastomeres er forløperne til endoderm og bakterie linjen hhv. Imidlertid har blastomere ablasjon eksperimenter vist at Parhyale embryoer også besitter betydelig regulatorisk capabilities, slik at skjebnen til blastomeres ablasjon ved åtte-cellers stadiet kan bli overtatt av etterkommere av noen av de gjenværende blastomeres. Blastomere ablasjon er tidligere beskrevet av en av to metoder: injeksjon og påfølgende aktivering av fototoksiske fargestoffer eller manuell ablasjon. Men Photoablation dreper blastomeres men ikke fjerner døde celler kroppen fra embryo. Fullstendig fysisk fjerning av spesifikke blastomeres kan derfor være en foretrukket metode for ablasjon i noen anvendelser. Her presenterer vi en protokoll for manuell fjerning av enkelt blastomeres fra åtte-cellers stadiet av Parhyale embryoer, illustrerer instrumenter og manuelle prosedyrer som er nødvendige for fullstendig fjerning av cellen kroppen mens du holder de resterende blastomeres levende og intakt. Denne protokollen kan brukes på alle Parhyale celle på åtte-cellers stadiet, eller til blastomeres av andre tidlig cleavage etapper. I tillegg, i prinsippet denne protokollen kan være aktuelt for tidlig CleaVåge stadium embryo av andre holoblastically spaltingsprober marine virvelløse dyr.

Etter vellykket ablasjon av enkelt tredje cleavage P. hawaiensis micromeres som beskrevet i denne protokollen, de resterende micromeres gradvis skifte sine posisjoner litt slik som å delvis okkupere plassen tidligere okkupert av den tyreoideaektomi blastomere. For eksempel, når g er fjernet, nabo blastomeres mr og ml skiftet litt, og kommer til å dele den laterale cellegrensene som tidligere var i direkte kontakt med g (sammenlign fi...

Watch this Scientific Journal Video about Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis at JoVE.com

Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis

Amfi Parhyale hawaiensis er en lovende modellorganisme for studier av krepsdyr embryologi og komparativ leddyr utvikling og evolusjon. Denne protokollen beskriver en metode for manuell fjerning av enkelt blastomeres fra tidlig cleavage stadium embryoer fra Parhyale.

Ablasjon av en enkelt celle fra åtte-cellers embryo av amfi Crustacean<em&gt; Parhyale hawaiensis</em

The amphipod Parhyale hawaiensis is a small crustacean found in intertidal marine habitats worldwide. Over the past decade, Parhyale has emerged as a ...

Research

JoVE Journal

Biology

Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual ...

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Single Cell Transfection in Chick Embryos

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolering og rensing av kinesin fra Drosophila Embryoer

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos

Enkeltcellesamling av trofoblastceller i Peri-implantasjonsstadium humane embryoer

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a ...

Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing

Enkeltcelle suspensjonsforberedelse fra Nilen tilapia tarm for enkeltcellesekvensering

Nile tilapia is one of the most commonly cultured freshwater fish species worldwide and is a widely used research model for aquaculture fish studies. The ...