Name: automated separation of c. elegans variably colonized by a bacterial pathogen
Uploaded: 2014-03-21T15:00:00
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Gli autori ringraziano il Ellison Medical Foundation per il loro sostegno. Desideriamo anche ringraziare i membri del laboratorio Abby Dernburg per l&#39;assistenza con l&#39;utilizzo del wormsorter.

1. Ottenere una cultura sincronizzata di giovane adulto animali <ol><li> Crescere vermi in diverse piastre NGM seminato con OP50-1 E. coli, batteri (10x concentrata da una cultura satura) fino a molti worm hanno raggiunto la fase gravida. </li><li> Trattare gli animali gravide con la soluzione di uovo-prep per ottenere una coltura sincronizzata (uova). </li><li> Uova Piatto su diversi 60 mm piastre NGM seminato con 10x OP50-1 concentrato ad una densità di circa 150-200 uova / piastra. </li><li> Incubare le p...

<ol>
	<li>Pulak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+analysis,+sorting,+and+dispensing+of+C.+elegans+on+the+COPAS+flow-sorting+system.">Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system.</a> Methods Mol. Biol. , 275-286 (2006).</li><li>Dupuy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+analysis+of+in+vivo+spatiotemporal+promoteractivity+in+Caenorhabditis+elegans.">Genome-scale analysis of in vivo spatiotemporal promoteractivity in Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Biotechnol. 25, 663-668 (2007).</li><li>Squiban, B., Belougne, J., Ewbank, J., Zugasti, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+Automated+High-throughput+Genome-wide+RNAi+Screens+in+elegans.">Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in elegans.</a> J. Vis. Exp. (60), (2012).</li><li>Doitsidou, M., Flames, N., Lee, A. C., Boyanov, A., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+screening+for+mutants+affecting+dopaminergic-neuron+specification+in+C.+elegans.">Automated screening for mutants affecting dopaminergic-neuron specification in C. elegans.</a> Nat. Methods. 5, 869-872 (2008).</li><li>Pujol, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+innate+immune+responses+to+infection+and+wounding+in+the+C.+elegans+epidermis.">Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis.</a> Curr. Biol. 18, 481-489 (2008).</li><li>Medzhitov, R., Janeway, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+recognition:+mechanisms+and+pathways.">Innate immune recognition: mechanisms and pathways.</a> Immunol. Rev. 173, 89-97 (2000).</li><li>Matzinger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance,+danger,+and+the+extended+family.">Tolerance, danger, and the extended family.</a> Annu. Rev. Immunol. 12, 991-1045 (1994).</li><li>Mariathasan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopyrin+activates+the+inflammasome+in+response+to+toxins+and+ATP.">Cryopyrin activates the inflammasome in response to toxins and ATP.</a> Nature. 440, 228-232 (2006).</li><li>Melo, J. A., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+conserved+C.+elegans+genes+engages+pathogen-+and+xenobiotic-associated+defenses.">Inactivation of conserved C. elegans genes engages pathogen- and xenobiotic-associated defenses.</a> Cell. 149, 452-466 (2012).</li><li>Chen, G. Y., Nunez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterile+inflammation:+sensing+and+reacting+to+damage.">Sterile inflammation: sensing and reacting to damage.</a> Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).</li><li>Tenor, J. L., Aballay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+Toll-like+receptor+is+required+for+Caenorhabditis+elegans+innate+immunity.">A conserved Toll-like receptor is required for Caenorhabditis elegans innate immunity.</a> EMBO Rep. 9, 103-109 (2008).</li><li>Pujol, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reverse+genetic+analysis+of+components+of+the+Toll+signaling+pathway+in+Caenorhabditis+elegans.">A reverse genetic analysis of components of the Toll signaling pathway in Caenorhabditis elegans.</a> Curr. Biol. 11, 809-821 (2001).</li><li>McEwan, D. L., Kirienko, N. V., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+translational+inhibition+by+Pseudomonas+aeruginosa+Exotoxin+A+Triggers+an+immune+response+in+Caenorhabditis+elegans.">Host translational inhibition by Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A Triggers an immune response in Caenorhabditis elegans.</a> Cell Host Microbe. 11, 364-374 (2012).</li><li>Dunbar, T. L., Yan, Z., Balla, K. M., Smelkinson, M. G., Troemel, E. R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+detects+pathogen-induced+translational+inhibition+to+activate+immune+signaling.">C. elegans detects pathogen-induced translational inhibition to activate immune signaling.</a> Cell Host Microbe. 11, 375-386 (2012).</li><li>Irazoqui, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+pathogenesis+and+host+responses+during+infection+of+C.+elegans+by+P.+aeruginosa+and+S.+aureus.">Distinct pathogenesis and host responses during infection of C. elegans by P. aeruginosa and S. aureus.</a> PLoS Pathog. 6, (2010).</li><li>Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M., Mylonakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+infection+of+Caenorhabditis+elegans+induces+antifungal+immune+defenses.">Candida albicans infection of Caenorhabditis elegans induces antifungal immune defenses.</a> PLoS Pathog. , (2011).</li><li>Shapira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+role+for+a+GATA+transcription+factor+in+regulating+epithelial+innate+immune+responses.">A conserved role for a GATA transcription factor in regulating epithelial innate immune responses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14086-14091 (2006).</li><li>Troemel, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p38+MAPK+regulates+expression+of+immune+response+genes+and+contributes+to+longevity+in+C.+elegans.">p38 MAPK regulates expression of immune response genes and contributes to longevity in C. elegans.</a> PLoS Genet. , 183 (2006).</li><li>Twumasi-Boateng, K., Shapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+immune+responses+from+pathogen+colonization+supports+pattern+recognition+in+C.+elegans.">Dissociation of immune responses from pathogen colonization supports pattern recognition in C. elegans.</a> PLoS One. , 7 (2012).</li><li>Jakobsen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alkaloid+compound+harmane+increases+the+lifespan+of+Caenorhabditis+elegans+during+bacterial+infection,+by+modulating+the+nematode's+innate+immune+response.">The alkaloid compound harmane increases the lifespan of Caenorhabditis elegans during bacterial infection, by modulating the nematode's innate immune response.</a> PLoS One. 8, (2013).</li><li>Portal-Celhay, C., Bradley, E. R., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+intestinal+bacterial+proliferation+in+regulation+of+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">Control of intestinal bacterial proliferation in regulation of lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Microbiol. 12, 49 (2012).</li><li>Troemel, E. R., Felix, M. A., Whiteman, N. K., Barriere, A., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsporidia+are+natural+intracellular+parasites+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biol. 6, 2736-2752 (2008).</li><li>Montalvo-Katz, S., Huang, H., Appel, M. D., Berg, M., Shapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+with+soil+bacteria+enhances+p38-dependent+infection+resistance+in+Caenorhabditis+elegans.">Association with soil bacteria enhances p38-dependent infection resistance in Caenorhabditis elegans.</a> Infect. Immun. 18, 514-520 (2013).</li></ol>

Il metodo descriviamo approfitta marcatura fluorescente di entità esterna della vite senza fine, di seguire le interazioni tra la vite e il suo ambiente. Nel caso che presentiamo, la separazione è basata sull&#39;etichettatura di un agente patogeno ed è stato impiegato per vermi separati con carico agente patogeno pesante da quelli senza (o luce) del carico. Successiva analisi di espressione genica trovato alcuna differenza nella risposta immunitaria tra i due gruppi suggerendo che fossero indipendenti carico patogen...

Smistamento automatico verme è molto simile FACS, operando misurando un segnale fluorescente in una vite senza fine (tipicamente fornita dai transgenici espressione di proteine ​​reporter) che passa raddrizzato in un tubo, consentendo il reindirizzamento sia ad un tubo di raccolta / pozzetto o ad un contenitore per rifiuti secondo di gating parametri fissati dal ricercatore 1. Il wormsorter può facilitare la ricerca in molti modi, un esempio di impiegare come uno strumento analitico è uno studio che ha seguito i modelli spazio-temporali di attività del promotore per quasi 1.000 geni 2. Tuttavia, il principale uso del wormsorter è in schermi genetici, seguendo bersaglio livelli di espressione di geni o localizzazione di proteina fluorescente lungo l&#39;asse del verme 3-5. Qui, descriviamo una nuova applicazione per la wormsorter, nel seguire la colonizzazione del worm da un agente patogeno fluorescente tag. Con questo come uno strumento ci siamo concentrati sul rapporto tra pathogen colonizzazione / carico e la risposta immunitaria, per acquisire nuove conoscenze sui meccanismi responsabili per l&#39;inizio delle risposte immunitarie nel verme. In quasi tutti gli organismi studiati fino ad oggi, l&#39;inizio delle risposte immunitarie innate di agenti patogeni microbici dipende dal riconoscimento di pattern molecolari associati ai patogeni (PAMP), e / o modelli molecolari di pericolo / danno-associato (smorza) 6,7. Le strutture microbiche primi sono conservati che includono componenti della parete cellulare microbica, il suo flagello, o il suo doppio strato lipidico 6, la seconda, comprendono sia molecole rilasciate (ad esempio ATP 8), proteine ​​alterate o altri marcatori di processi cellulari alterati 9,10. Entrambi i tipi di segnali sono riconosciuti da proteine ​​designati come recettori di pattern recognition (PRR), che su specifica di legame di una molecola modello di attivare una catena di eventi che conducono ad una risposta protettiva. C. elegans è stato estremamente utile come tractamodello bile sviscerare i vari aspetti delle interazioni ospite-patogeno, ma una cosa che non è ben compreso è come risposte immunitarie sono iniziati nel verme. Nessuno dei recettori putativi che sono orthologous ai recettori pattern recognition (PRR) in altri organismi hanno dimostrato di legare PAMPs, e molti degli ortologhi di PRRs che sono cardine per le risposte immunitarie in altri organismi mostrare un contributo sorprendentemente limitato a risposte verme patogeni e resistenza. Per esempio, il recettore Toll Drosophila, che è essenziale per resistere patogeni Gram positivi, è rappresentato in C. elegans da una suola omologo, tol-1, che contribuisce alla protezione dal patogeno Gram-negativo Salmonella Typhimurium 11, ma non da altre testate Gram-negativi, patogeni o-positivi 11,12. Queste osservazioni, combinato con i dati che indicano che le risposte immunitarie potrebbe essere indotta da interrompendo proteina cellulare traduzione hcome indotto alcuni a suggerire che C. elegans rileva principalmente smorza 9,13,14. Tuttavia, i rapporti capacità degli agenti patogeni morti per indurre risposte immunitarie descrivono suggerire che PAMP legame può essere ha un ruolo importante nel riconoscimento patogeno in C. elegans 15,16. Il lavoro precedente concentrandosi sulle risposte immunitarie in età sincronizzato geneticamente identici C. elegans popolazioni, hanno dimostrato grande variabilità individuale nella colonizzazione intestinale da parte dei batteri Gram-negativi patogeno Pseudomonas aeruginosa. Tuttavia, gli studi di profilatura trascrizionale trattate queste popolazioni variabile colonizzati come un&#39;unica entità 17,18. Approfittando di questa variabilità, abbiamo sviluppato un protocollo di messa a fuoco di un wormsorter automatizzato per separare le popolazioni colonizzate differenziale di Caenorhabditis elegans esposti a GFP che esprimono P. aeruginosa. Esaminando l&#39;espressione genica in popolazioni diversamente colonizzate FACIla valutazione litated del rapporto tra carico patogeno (e il danno associato) e le risposte immunitarie e nuove intuizioni fornite circa il riconoscimento dei patogeni in C. elegans 19. Qui di seguito descriviamo il protocollo, che potrebbe essere applicato per ordinare i vermi infettati con qualsiasi agente patogeno fluorescente. Per utenti potenziali occorre notare che il numero di vermi che devono essere risolti dipende dalla natura delle analisi successive e protocolli in uso. Ad esempio, nel caso di analisi di espressione genica microarray,&gt; 1.000 vermi dovranno avere abbastanza RNA, se si utilizzano protocolli standard, ma ~ 100 vermi sarebbero sufficienti se l&#39;amplificazione è impiegato, consentendo veloce raccolta di materiale e riducendo al minimo lo stress a i vermi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="927">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">M9 Buffer</td>
			<td style="width:139px;">Prepared in house</td>
			<td style="width:527px;">Recipe at wormbook.org</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rifampicin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R3501</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Egg prep solution&#160;</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td>50ml water ; 40ml bleach ; 10ml of 10N Sodium Hydroxide&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NGM plates&#160;</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td>Recipe at wormbook.org</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SKP plates</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td>Recipe same as NGM only 0.35% peptone instead of 0.25%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Control test particles&#160;</td>
			<td>Union Biometrica&#160;</td>
			<td>310-5071-001</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated separation of c. elegans variably colonized by a bacterial pathogen

Il wormsorter è uno strumento analogo ad una macchina FACS che viene utilizzato in studi di Caenorhabditis elegans, tipicamente per ordinare vermi basato su espressione di un reporter fluorescente. Qui, si evidenzia un uso alternativo di questo strumento, per l&#39;ordinamento vermi in base al loro grado di colonizzazione da un agente patogeno-GFP che esprimono. Questo nuovo utilizzo ci ha permesso di affrontare il rapporto tra la colonizzazione dell&#39;intestino verme e induzione di risposte immunitarie. Mentre C. elegans risposte immunitarie a diversi agenti patogeni sono stati documentati, non si sa ancora che cosa li avvia. Le due possibilità principali (che non si escludono a vicenda) sono il riconoscimento di pattern molecolari associati ai patogeni, e la rilevazione dei danni causati da infezione. Per distinguere tra le due possibilità, l&#39;esposizione al patogeno deve essere dissociata dai danni che provoca. Il permesso wormsorter separazione dei vermi che sono stati ampiamente-colonizzata dai Gram-npatogeno egative Pseudomonas aeruginosa, con danni probabilmente causato da un carico patogeno, da vermi che sono stati esposti in modo simile, ma non, o marginalmente, colonizzato. Queste popolazioni distinte sono stati usati per valutare il rapporto tra carico patogeno e l&#39;induzione di risposte immunitarie trascrizionali. I risultati suggeriscono che i due sono dissociate, supportando la possibilità di riconoscimento patogeno.

Quando pari età, geneticamente identici C. elegans sono esposti a P. aeruginosa, un&#39;ampia distribuzione si osserva nei livelli di colonizzazione (Figura 1A). Con l&#39;aiuto del protocollo qui descritto separazione efficiente di non colonizzato da vermi colonizzati può essere raggiunto (Figura 1B). A differenza dei worm non colonizzato, worm colonizzati mostrano segni di danni, come la lentezza e ridotto defecazione 19. Quest&#39;ultimo può essere un ...

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Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Separazione automatica di<em&gt; C. elegans</em&gt; Variabilmente Colonizzato da un batterio patogeno

Il wormsorter facilita schermi genetiche in Caenorhabditis elegans di classificare vermi secondo l&#39;espressione di giornalisti fluorescenti. Qui, descriviamo un nuovo utilizzo: ordinamento secondo la colonizzazione da un agente patogeno-GFP che esprimono, e ci avvaliamo di esaminare il ruolo poco compreso del riconoscimento patogeno in avvio risposte immunitarie.

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Invasione di cellule umane da un agente patogeno batterico

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

Un giorno Scheme flusso di lavoro per batterica Rilevazione dei patogeni e test di resistenza antimicrobica dalle emocolture

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Visualizzazione delle risposte tossina batterica provocata con diretta microscopia a fluorescenza cellulare

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC secrezione per Indagare infezione Cellular dalla batterica patogeni<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation e Multi-fenotipica Screening-Alto contenuto di<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Mutants transposon

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Svelare la funzione di un batterica Effector da un non-coltivabili fitopatogeni Utilizzando un lievito schermo doppio ibrido

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

Enrichment of Bacterial Lipoproteins and Preparation of N-terminal Lipopeptides for Structural Determination by Mass Spectrometry

Arricchimento delle lipoproteine batteriche e preparazione del N-terminale lipopeptidi per determinazione strutturale mediante spettrometria di massa

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A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Un ad alta velocità, ad alto contenuto, liquido a base di c. elegans patosistema come contributo

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

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Utilizzando un agente patogeno batterico alla sonda per le risposte cellulari e organismica-livello Host

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