Name: automated separation of c. elegans variably colonized by a bacterial pathogen
Uploaded: 2014-03-21T15:00:00
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저자는 그들의 지원을 위해 엘리슨 의료 재단 감사합니다. 우리는 wormsorter을 사용하여에 대한 지원은 애비 Dernburg 실험실의 구성원을 감사하는 것이 좋겠다.

1. 젊은 성인 동물의 동기화 문화를 얻기 <ol><li> OP50-1 E. 시드 여러 NGM 플레이트에 벌레를 성장 대장균 박테리아는 (10 배는 포화 문화 집중) 많은 벌레가 임신하는 단계에 도달 할 때까지. </li><li> 동기화 문화 (계란)을 획득 달걀 준비 솔루션으로 임신하는 동물을 처리합니다. </li><li> 여러 60 mm NGM 플레이트에 플레이트 계란은 대략 150 ~ 200 계란 / 판의 밀도로 10 배 농축 OP50-1 시드. </li><...

<ol>
	<li>Pulak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+analysis,+sorting,+and+dispensing+of+C.+elegans+on+the+COPAS+flow-sorting+system.">Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system.</a> Methods Mol. Biol. , 275-286 (2006).</li><li>Dupuy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+analysis+of+in+vivo+spatiotemporal+promoteractivity+in+Caenorhabditis+elegans.">Genome-scale analysis of in vivo spatiotemporal promoteractivity in Caenorhabditis elegans.</a> Nat. 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Methods. 5, 869-872 (2008).</li><li>Pujol, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+innate+immune+responses+to+infection+and+wounding+in+the+C.+elegans+epidermis.">Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis.</a> Curr. Biol. 18, 481-489 (2008).</li><li>Medzhitov, R., Janeway, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+recognition:+mechanisms+and+pathways.">Innate immune recognition: mechanisms and pathways.</a> Immunol. Rev. 173, 89-97 (2000).</li><li>Matzinger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance,+danger,+and+the+extended+family.">Tolerance, danger, and the extended family.</a> Annu. Rev. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+translational+inhibition+by+Pseudomonas+aeruginosa+Exotoxin+A+Triggers+an+immune+response+in+Caenorhabditis+elegans.">Host translational inhibition by Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A Triggers an immune response in Caenorhabditis elegans.</a> Cell Host Microbe. 11, 364-374 (2012).</li><li>Dunbar, T. L., Yan, Z., Balla, K. M., Smelkinson, M. G., Troemel, E. R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+detects+pathogen-induced+translational+inhibition+to+activate+immune+signaling.">C. elegans detects pathogen-induced translational inhibition to activate immune signaling.</a> Cell Host Microbe. 11, 375-386 (2012).</li><li>Irazoqui, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+pathogenesis+and+host+responses+during+infection+of+C.+elegans+by+P.+aeruginosa+and+S.+aureus.">Distinct pathogenesis and host responses during infection of C. elegans by P. aeruginosa and S. aureus.</a> PLoS Pathog. 6, (2010).</li><li>Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M., Mylonakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+infection+of+Caenorhabditis+elegans+induces+antifungal+immune+defenses.">Candida albicans infection of Caenorhabditis elegans induces antifungal immune defenses.</a> PLoS Pathog. , (2011).</li><li>Shapira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+role+for+a+GATA+transcription+factor+in+regulating+epithelial+innate+immune+responses.">A conserved role for a GATA transcription factor in regulating epithelial innate immune responses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14086-14091 (2006).</li><li>Troemel, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p38+MAPK+regulates+expression+of+immune+response+genes+and+contributes+to+longevity+in+C.+elegans.">p38 MAPK regulates expression of immune response genes and contributes to longevity in C. elegans.</a> PLoS Genet. , 183 (2006).</li><li>Twumasi-Boateng, K., Shapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+immune+responses+from+pathogen+colonization+supports+pattern+recognition+in+C.+elegans.">Dissociation of immune responses from pathogen colonization supports pattern recognition in C. elegans.</a> PLoS One. , 7 (2012).</li><li>Jakobsen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alkaloid+compound+harmane+increases+the+lifespan+of+Caenorhabditis+elegans+during+bacterial+infection,+by+modulating+the+nematode's+innate+immune+response.">The alkaloid compound harmane increases the lifespan of Caenorhabditis elegans during bacterial infection, by modulating the nematode's innate immune response.</a> PLoS One. 8, (2013).</li><li>Portal-Celhay, C., Bradley, E. R., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+intestinal+bacterial+proliferation+in+regulation+of+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">Control of intestinal bacterial proliferation in regulation of lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Microbiol. 12, 49 (2012).</li><li>Troemel, E. R., Felix, M. A., Whiteman, N. K., Barriere, A., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsporidia+are+natural+intracellular+parasites+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biol. 6, 2736-2752 (2008).</li><li>Montalvo-Katz, S., Huang, H., Appel, M. D., Berg, M., Shapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+with+soil+bacteria+enhances+p38-dependent+infection+resistance+in+Caenorhabditis+elegans.">Association with soil bacteria enhances p38-dependent infection resistance in Caenorhabditis elegans.</a> Infect. Immun. 18, 514-520 (2013).</li></ol>

우리가 설명하는 방법은 웜과 그 환경 사이의 상호 작용을 수행하기 위해, 웜 외부 기관의 형광 라벨을 활용합니다. 우리는 선물의 경우, 분리는 병원체의 라벨을 기준으로 한없이 (또는 빛) 부하를 가진 사람에서 무거운 병원체 부하 별도의 웜을 사용 하였다. 이후 유전자 발현 분석은이 병원균 부하 독립적 이었다는 것을 건의하는 두 그룹 사이의 면역 반응에 차이를 찾을 수 없습니다. 반응을 ?...

자동 웜 정렬은,이 ​​튜브에 곧게 통과 (일반적으로 기자 단백질의 유전자 발현에 의해 제공) 웜에 형광 신호를 측정하여 운영 리디렉션으로 Collection 튜브 /도 또는 폐기물 용기에 따라 수 많은 FACS처럼 연구원 1로 설정 매개 변수를 게이팅. wormsorter은 여러 가지 방법으로 연구를 촉진 할 수있다; 분석 도구로서 채용하는 예는 거의 1000 유전자 2 ​​프로모터 활성의 시공간적 패턴을 따라 연구이다. 그러나 wormsorter의 주요 용도는 표적 유전자의 발현 수준 또는 웜 3-5의 축을 따라 형광 단백질의 지역화 다음, 유전 화면이다. 여기에서, 우리는 찬란 태그 병원체에 의해 웜의 식​​민지 다음의, wormsorter에 대한 새로운 응용 프로그램을 설명합니다. 이와 함께 도구로 우리는 pathog 사이의 관계에 초점을 맞춘식민지 / 부하와 면역 반응 도중에 웜에 면역 반응의 개시를 담당하는 메커니즘에 새로운 통찰력을 얻을 수 있습니다. 현재까지 연구의 거의 모든 생물에서, 미생물 병원체에 타고난 면역 반응의 시작은 병원체 - 관련 분자 패턴 (PAMPS)의 인식에 따라, 및 / 또는 위험 / 손상 관련 분자 패턴 (감쇠) 6,7. 미생물의 세포벽의 편모, 또는 지질 이중층 (6)의 구성 요소를 포함 할 첫 번째 보존되어 미생물의 구조, 두 번째는 모두 해제 분자 (예를 들면 ATP 8) 변경, 단백질이나 변형 된 세포 과정 9,10의 다른 마커를 포함한다. 신호의 두 가지 유형은 특정 패턴에 따라 분자의 결합이 보호 반응으로 이어지는 일련의 사건을 활성화 패턴 인식 수용체 (PRRS)로 지정 단백질에 의해 인식됩니다. C.에게 엘레 tracta으로 매우 유용했습니다BLE 모델 호스트 병원체 상호 작용의 다양한 측면을 해부하지만, 잘 이해되지 않는 한 가지 면역 반응이 웜에 시작하는 방법입니다하십시오. 다른 생물의 패턴 인식 수용체 (PRRS)에 orthologous하는 추정 수용체​​ 중에 PAMPS을 바인딩 표시되지되었고, 다른 생물의 면역 반응에 대한 중요한 있습니다 PRRS의 orthologs 많은 웜 병원체 반응에 놀라 울 정도로 제한된 기여를 보여 저항. 예를 들어, 그람 양성 병원균에 저항하기위한 필수적인 초파리 유료 수용체는, C로 표시된다 나타내는 데이터와 함께 있지만 다른 테스트 그람 음성 또는 양성 병원균 (11, 12)에서, 그람 병원체 살모넬라 균 Typhimurium (11) 보호에 기여한다. 이러한 관측 단독 상동, TOL-1에 의해 엘레 그 면역 반응 세포 단백질 번역의 시간을 방해에 의해 유도 될 수있다지도 일부가 제안하는 그 C. 엘레는 주로 감쇠 9,13,14를 감지합니다. 그럼에도 불구하고, 면역 반응을 유도하는 죽은 병원균의 능력을 설명하는 보고서는 PAMP 바인딩 C.에있는 병원체의 인식에 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 엘레 (15, 16). 나이 동기화 유 전적으로 동일한 C의 면역 반응에 초점을 맞추고 이전 작업 elegans의 인구는 세균 그람 음성 병원균 녹농균에 의해 장내 정착에 큰 개인의 다양성을 보여 주었다. 그러나, 전사 프로파일 링 연구는 하나의 엔티티 (17, 18) 이러한 가변 - 식민지 인구를 처리. 이 변동성을 활용, 우리는 GFP - 표현 P.에 노출 예쁜 꼬마 선충의 차별적 식민지 인구를 분리하는 자동화 된 wormsorter을 집중 프로토콜을 개발 녹농균. 다르게 - 식민지 인구에서 유전자 발현을 faci 검사병원체로드 (및 관련 손상) 및 면역 반응과 C.의 병원체 인식에 대한 새로운 통찰력을 제공 사이의 관계 litated 평가 엘레 19. 우리는 어떤 찬란 병원체에 감염된 웜을 정렬에 적용 할 수있는 프로토콜을 설명 아래. 잠재적 인 사용자에게 그것을 정리 될 필요 벌레의 수는 사용상의 후속 분석 및 프로토콜의 특성에 의존한다는 것을 주목해야한다. 예를 들어, 마이크로 어레이 유전자 발현 분석의 경우,&gt; 1000 웜은 표준 프로토콜을 사용하는 경우, 충분한 RNA를 구하는 것이 요구되지만, 증폭을 채택한 경우 ~ 100 웜 충분할, 소재의 신속한 수집을 허용하고, 따라서 스트레스를 최소화 벌레.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="927">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">M9 Buffer</td>
			<td style="width:139px;">Prepared in house</td>
			<td style="width:527px;">Recipe at wormbook.org</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rifampicin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R3501</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Egg prep solution&#160;</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td>50ml water ; 40ml bleach ; 10ml of 10N Sodium Hydroxide&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NGM plates&#160;</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td>Recipe at wormbook.org</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SKP plates</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td>Recipe same as NGM only 0.35% peptone instead of 0.25%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Control test particles&#160;</td>
			<td>Union Biometrica&#160;</td>
			<td>310-5071-001</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated separation of c. elegans variably colonized by a bacterial pathogen

wormsorter이 예쁜 꼬마 선충의 연구에 사용되는 FACS 기계와 유사한 악기, 일반적으로 형광 기자의 식을 기반으로 웜을 정렬합니다. 여기에서, 우리는 GFP - 표현 병원체에 의한 식민지 자신의 정도에 따라 벌레를 정렬,이 악기의 다른 사용을 강조 표시합니다. 이 새로운 사용은 우리가 웜 소장과 면역 반응의 유도의 식민지 사이의 관계를 해결 할 수있었습니다. 동안 C. 다른 병원균에 elegans의 면역 반응은이를 시작 무엇 여전히 알 수없는, 문서화되었습니다. (상호 배타적이지) 두 가지 가능성이 병원체 - 관련 분자 패턴을 인식, 감염에 의한 손상을 감지합니다. 두 가지 가능성을 구분하기 위해 병원체에 노출이 원인이되는 손상으로부터 해리해야합니다. 그램-N 광범위 - 식민지가 된 웜의 wormsorter 활성화 분리식민지 유사하게 노출 된 웜 가능성이 병원균 부하로 인한 손상,, 그러나, 또는 가장자리와를 egative 병원체 녹농균,. 이러한 구별 인구 병원체로드 전사 및 면역 반응의 유도와의 관계를 평가하기 위해 사용되었다. 결과는 두 가지가 병원체 인식의 가능성을 지원 해리되도록 제안한다.

나이와 일치하는 경우, 유 전적으로 동일한 C. 엘레은 P.에 노출되어 녹농균은 넓은 분포는 식민지 (그림 1A)의 수준에서 관찰된다. 식민지 웜 noncolonized의 효율적인 분리 (그림 1B) 달성 할 수있다 여기에 설명 된 프로토콜의 도움으로. noncolonized 웜과는 달리, 식민지 웜은 부진 감소 배변 19과 같은 손상의 징후를 보여줍니다. 후자는 벌레가 P. 식?...

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Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

의 자동 분리<em&gt; C. 엘레</em&gt; 가변 세균성 병원체에 의해 식민지

wormsorter 형광 기자의 표현에 따라 웜을 정렬하여 예쁜 꼬마 선충의 유전자 화면을 용이하게한다. 여기에서, 우리는 새로운 사용 설명 : GFP - 표현 병원체에 의한 식민지에 따라 정렬을, 우리는 면역 반응을 시작하기에 병원체의 인식의 불완전하게 이해 역할을 조사하기 위해 그것을 사용합니다.

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

세균성 병원체에 의해 인간의 세포의 침략

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

연구

면역학 및 감염병학

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

혈액 배양에서 세균 병원체 탐지 및 항균 저항 테스트를위한 하루 워크플로 계획

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

라이브 세포 형광 현미경을 사용하여 박테리아 독소 유도 응답의 시각화

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

세균성 병원체에 의해 세포 감염을 조사하기 위해 InlC 분비 이미징<em&gt; 리스테리아</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

세대와의 멀티 표현형 높은 콘텐츠 상영<em&gt; Coxiella burnetii의</em&gt; 트랜스포존 돌연변이

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

효모 두 하이브리드 화면을 사용하여 비 경작 식물 병원체로부터 세균 이펙터의 기능을 해결했습니다

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

Enrichment of Bacterial Lipoproteins and Preparation of N-terminal Lipopeptides for Structural Determination by Mass Spectrometry

세균성 단백질 질량 분석에 의하여 구조 결심에 대 한 N 맨끝 Lipopeptides의 준비의 농축

Lipoproteins are important constituents of the bacterial cell envelope and potent activators of the mammalian innate immune response. Despite their ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

높은 처리량, 높은 콘텐츠, 액체 기반의 C. 선 충 Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

자동화 된 행동 분석의 큰 C. 선 충 인구 넓은 시야의 사용 하 여 추적 플랫폼

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

셀룰러 및 Organismic 수준 호스트 응답 세균성 병원 체 프로브를 사용 하 여

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...