Name: automated separation of c. elegans variably colonized by a bacterial pathogen
Uploaded: 2014-03-21T15:00:00
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Os autores agradecem a Fundação Médica Ellison pelo seu apoio. Gostaríamos também de agradecer aos membros do laboratório de Abby Dernburg para a assistência com o uso do wormsorter.

1. A obtenção de uma Cultura Synchronized de Jovens Adultos Animais <ol><li> Crescer vermes em várias placas NGM semeados com OP50-1 E. bactérias coli (10x concentrada a partir de uma cultura saturada) até muitos vermes atingiram a fase gravídico. </li><li> Trate os animais grávidas com solução ovo-prep para obter uma cultura sincronizado (ovos). </li><li> Ovos placa em várias placas NGM 60 mm semeado com 10x concentrado OP50-1 a uma densidade de cerca de 150-200 ovos / placa. </li><li> Inc...

<ol>
	<li>Pulak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+analysis,+sorting,+and+dispensing+of+C.+elegans+on+the+COPAS+flow-sorting+system.">Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system.</a> Methods Mol. Biol. , 275-286 (2006).</li><li>Dupuy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+analysis+of+in+vivo+spatiotemporal+promoteractivity+in+Caenorhabditis+elegans.">Genome-scale analysis of in vivo spatiotemporal promoteractivity in Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Biotechnol. 25, 663-668 (2007).</li><li>Squiban, B., Belougne, J., Ewbank, J., Zugasti, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+Automated+High-throughput+Genome-wide+RNAi+Screens+in+elegans.">Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in elegans.</a> J. Vis. Exp. (60), (2012).</li><li>Doitsidou, M., Flames, N., Lee, A. C., Boyanov, A., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+screening+for+mutants+affecting+dopaminergic-neuron+specification+in+C.+elegans.">Automated screening for mutants affecting dopaminergic-neuron specification in C. elegans.</a> Nat. Methods. 5, 869-872 (2008).</li><li>Pujol, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+innate+immune+responses+to+infection+and+wounding+in+the+C.+elegans+epidermis.">Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis.</a> Curr. Biol. 18, 481-489 (2008).</li><li>Medzhitov, R., Janeway, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+recognition:+mechanisms+and+pathways.">Innate immune recognition: mechanisms and pathways.</a> Immunol. Rev. 173, 89-97 (2000).</li><li>Matzinger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance,+danger,+and+the+extended+family.">Tolerance, danger, and the extended family.</a> Annu. Rev. 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Y., Nunez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterile+inflammation:+sensing+and+reacting+to+damage.">Sterile inflammation: sensing and reacting to damage.</a> Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).</li><li>Tenor, J. L., Aballay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+Toll-like+receptor+is+required+for+Caenorhabditis+elegans+innate+immunity.">A conserved Toll-like receptor is required for Caenorhabditis elegans innate immunity.</a> EMBO Rep. 9, 103-109 (2008).</li><li>Pujol, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reverse+genetic+analysis+of+components+of+the+Toll+signaling+pathway+in+Caenorhabditis+elegans.">A reverse genetic analysis of components of the Toll signaling pathway in Caenorhabditis elegans.</a> Curr. Biol. 11, 809-821 (2001).</li><li>McEwan, D. L., Kirienko, N. V., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+translational+inhibition+by+Pseudomonas+aeruginosa+Exotoxin+A+Triggers+an+immune+response+in+Caenorhabditis+elegans.">Host translational inhibition by Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A Triggers an immune response in Caenorhabditis elegans.</a> Cell Host Microbe. 11, 364-374 (2012).</li><li>Dunbar, T. L., Yan, Z., Balla, K. M., Smelkinson, M. G., Troemel, E. R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+detects+pathogen-induced+translational+inhibition+to+activate+immune+signaling.">C. elegans detects pathogen-induced translational inhibition to activate immune signaling.</a> Cell Host Microbe. 11, 375-386 (2012).</li><li>Irazoqui, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+pathogenesis+and+host+responses+during+infection+of+C.+elegans+by+P.+aeruginosa+and+S.+aureus.">Distinct pathogenesis and host responses during infection of C. elegans by P. aeruginosa and S. aureus.</a> PLoS Pathog. 6, (2010).</li><li>Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M., Mylonakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+infection+of+Caenorhabditis+elegans+induces+antifungal+immune+defenses.">Candida albicans infection of Caenorhabditis elegans induces antifungal immune defenses.</a> PLoS Pathog. , (2011).</li><li>Shapira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+role+for+a+GATA+transcription+factor+in+regulating+epithelial+innate+immune+responses.">A conserved role for a GATA transcription factor in regulating epithelial innate immune responses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14086-14091 (2006).</li><li>Troemel, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p38+MAPK+regulates+expression+of+immune+response+genes+and+contributes+to+longevity+in+C.+elegans.">p38 MAPK regulates expression of immune response genes and contributes to longevity in C. elegans.</a> PLoS Genet. , 183 (2006).</li><li>Twumasi-Boateng, K., Shapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+immune+responses+from+pathogen+colonization+supports+pattern+recognition+in+C.+elegans.">Dissociation of immune responses from pathogen colonization supports pattern recognition in C. elegans.</a> PLoS One. , 7 (2012).</li><li>Jakobsen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alkaloid+compound+harmane+increases+the+lifespan+of+Caenorhabditis+elegans+during+bacterial+infection,+by+modulating+the+nematode's+innate+immune+response.">The alkaloid compound harmane increases the lifespan of Caenorhabditis elegans during bacterial infection, by modulating the nematode's innate immune response.</a> PLoS One. 8, (2013).</li><li>Portal-Celhay, C., Bradley, E. R., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+intestinal+bacterial+proliferation+in+regulation+of+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">Control of intestinal bacterial proliferation in regulation of lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Microbiol. 12, 49 (2012).</li><li>Troemel, E. R., Felix, M. A., Whiteman, N. K., Barriere, A., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsporidia+are+natural+intracellular+parasites+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biol. 6, 2736-2752 (2008).</li><li>Montalvo-Katz, S., Huang, H., Appel, M. D., Berg, M., Shapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+with+soil+bacteria+enhances+p38-dependent+infection+resistance+in+Caenorhabditis+elegans.">Association with soil bacteria enhances p38-dependent infection resistance in Caenorhabditis elegans.</a> Infect. Immun. 18, 514-520 (2013).</li></ol>

O método que descrevemos aproveita de marcação fluorescente de entidades fora do worm, para acompanhar as interações entre o vírus e seu ambiente. No caso que apresentamos, a separação foi baseada em rotulagem de um patógeno e foi empregado para vermes separados com carga de patógenos pesado daqueles sem (ou luz) de carga. Análise de expressão gênica Subsequente não encontraram nenhuma diferença nas respostas imunes entre os dois grupos, sugerindo que eles foram independentes da carga de patógenos. O sin...

Classificação automática verme é muito parecido com FACS, operando através da medição um sinal fluorescente em um sem-fim (normalmente fornecida pela expressão transgênica de proteínas repórter) que passa ajeitou em um tubo, o que permite o redirecionamento ou a um tubo de coleta / bem ou para um recipiente de resíduos de acordo para modular parâmetros definidos pelo pesquisador 1. O wormsorter pode facilitar a pesquisa de várias maneiras; um exemplo de empregá-la como instrumento de análise é um estudo que seguiu os padrões espaço-temporais de atividade do promotor para quase 1.000 genes 2. No entanto, o uso principal do wormsorter é nas telas genéticas, a seguir os níveis de expressão do gene alvo ou a localização da proteína fluorescente ao longo do eixo do sem-fim de 3-5. Aqui, descrevemos uma nova aplicação para o wormsorter, seguindo a colonização do worm por um patógeno fluorescente etiquetado. Com isto como uma ferramenta que incidiu sobre a relação entre Pathogen colonização / carga e da resposta imune, para ganhar novos insights sobre os mecanismos responsáveis ​​pela iniciação das respostas imunes do worm. Em praticamente todos os organismos estudados até o momento, o início da resposta imune inata a patógenos microbianos depende do reconhecimento de padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), e / ou padrões moleculares perigo / associado a danos (amortece) 6,7. As estruturas microbianas primeiro são conservadas que incluem componentes da parede celular microbiana, seu flagelo, ou sua bicamada lipídica 6, o segundo, incluem ambas as moléculas libertadas (por exemplo ATP 8), as proteínas modificadas ou outros marcadores de processos celulares alterados 9,10. Ambos os tipos de sinais são reconhecidos pelas proteínas designadas como receptores de reconhecimento de padrões (PRRs), que, após a ligação específica de uma molécula padrão activam uma cadeia de eventos que conduzem a uma resposta protectora. C. elegans foi extremamente útil como um Tractamodelo ble dissecar vários aspectos da interação patógeno-hospedeiro, mas uma coisa que não é bem compreendido é a forma como as respostas imunes são iniciadas no worm. Nenhum dos receptores putativos que são ortólogos de receptores de reconhecimento de padrões (SRRS) em outros organismos demonstraram ligar PAMPs, e muitos dos ortólogos de PRRs que são cruciais para as respostas imunes em outros organismos mostram surpreendentemente uma contribuição limitada para respostas verme patógeno e resistência. Por exemplo, o receptor Toll de Drosophila, que é essencial para resistir Gram positivos patogénicos, é representada em C. elegans por um único homólogo, tol-1, o que contribui para a protecção contra o agente patogénico Gram negativa Salmonella typhimurium 11, mas não a partir de outros agentes patogénicos, ou-positivas gram-negativas testadas 11,12. Estas observações, em conjunto com os dados que indicam que as respostas imunitárias poderia ser induzida por perturbar a tradução da proteína celular hcomo levou alguns a sugerir que C. elegans detecta principalmente DAMPs 9,13,14. No entanto, relatos que descrevem a capacidade de agentes patogénicos mortos para induzir respostas imunológicas sugerem que a ligação pode ser PAMP têm um papel importante no reconhecimento de patógenos em C. elegans 15,16. Trabalhos anteriores com foco em respostas imunes em sincronizado idade geneticamente idênticos C. elegans populações, demonstraram grande variabilidade individual na colonização intestinal pela Gram-negativo patógeno bacteriano Pseudomonas aeruginosa. No entanto, estudos de perfis de transcrição tratada essas populações variavelmente-colonizados como uma entidade 17,18. Aproveitando essa variabilidade, foi desenvolvido um protocolo visando ao wormsorter automatizado para separar populações colonizadas diferencialmente de Caenorhabditis elegans expostos a expressando GFP P. aeruginosa. Examinando a expressão genética em populações de forma diferente-colonizados FACIavaliação litated da relação entre a carga de patógenos (e os danos associados) e as respostas imunes e fornecidos novos insights sobre o reconhecimento do patógeno em C. elegans 19. A seguir descreve-se o protocolo, o qual podia ser aplicado para classificar vermes infectadas com qualquer agente patogénico marcado por fluorescência. Para potenciais utilizadores deve notar-se que o número de vermes necessários para ser resolvido depende da natureza das análises subsequentes e protocolos de uso. Por exemplo, no caso de análise de expressão do gene de microarray,&gt; 1000 vermes será necessária para obter o ARN suficiente, se os protocolos padrão são usadas, mas aproximadamente 100 vermes seria suficiente, se é utilizada a amplificação, permitindo rápida recolha de material e, assim, minimizar o stress aos os vermes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="927">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">M9 Buffer</td>
			<td style="width:139px;">Prepared in house</td>
			<td style="width:527px;">Recipe at wormbook.org</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rifampicin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R3501</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Egg prep solution&#160;</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td>50ml water ; 40ml bleach ; 10ml of 10N Sodium Hydroxide&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NGM plates&#160;</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td>Recipe at wormbook.org</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SKP plates</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td>Recipe same as NGM only 0.35% peptone instead of 0.25%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Control test particles&#160;</td>
			<td>Union Biometrica&#160;</td>
			<td>310-5071-001</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated separation of c. elegans variably colonized by a bacterial pathogen

O wormsorter é um instrumento semelhante a uma máquina de FACS que é utilizado em estudos de Caenorhabditis elegans, tipicamente para classificar vermes baseados na expressão de um repórter fluorescente. Aqui, destacam-se um uso alternativo deste instrumento, para classificar os vermes de acordo com seu grau de colonização por um patógeno expressando GFP. Este novo uso nos permitiu resolver a relação entre a colonização do intestino sem-fim e a indução de respostas imunitárias. Enquanto C. elegans respostas imunes a diferentes patógenos têm sido documentados, ainda é desconhecido o que os inicia. As duas possibilidades principais (que não são mutuamente exclusivos) são o reconhecimento de padrões moleculares associados a patógenos, e detecção de danos causados ​​por infecção. Para diferenciar entre as duas possibilidades, a exposição ao patógeno deve ser dissociado do dano que ela causa. A separação wormsorter habilitado de vermes que foram amplamente colonizados pela Gram-npatógeno egative Pseudomonas aeruginosa, com a provável dano causado pela carga de patógenos, de vermes que foram igualmente expostos, mas não, ou marginalmente, colonizado. Estas populações distintas foram usadas para avaliar a relação entre a carga e o agente patogénico a indução de respostas imunitárias de transcrição. Os resultados sugerem que os dois são dissociados, apoiando a possibilidade de reconhecimento do patógeno.

Quando a idade-pareado, geneticamente idênticos C. elegans estão expostos a P. aeruginosa, uma ampla distribuição é observado em níveis de colonização (Figura 1A). Com a ajuda do protocolo descrito aqui a separação eficiente de não colonizados de vermes colonizados pode ser conseguida (Figura 1B). Ao contrário dos worms não colonizados, vermes colonizados mostrar sinais de danos, tais como lentidão e reduziu a defecação 19. Este último pode ...

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Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

A separação automática de<em&gt; C. elegans</em&gt; Variably Colonizada por um patógeno bacteriano

O wormsorter facilita telas genéticas em Caenorhabditis elegans, classificando vermes de acordo com a expressão de repórteres fluorescentes. Aqui, descrevemos um novo uso: triagem de acordo com a colonização por um patógeno expressando GFP, e empregá-lo para examinar o papel mal compreendida de reconhecimento do patógeno em iniciar respostas imunes.

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Invasão das células humanas por um agente patogénico

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

Imunologia e Infecção

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

Um dia-Esquema de fluxo de trabalho para detecção de patógenos de bactérias e de resistência antimicrobiana de hemoculturas

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Visualização das respostas toxina bacteriana induzida por microscopia de fluorescência de células vivas

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imagiologia inLC Secreção para investigar infecção celular pelo patógeno bacteriano<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Geração e Multi-fenotípica rastreio de alto teor de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; mutantes por transposões

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Desvendando a função de uma bacteriana Effector de um patógeno não-cultiváveis ​​meio de uma levedura Screen Two-hybrid

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

Enrichment of Bacterial Lipoproteins and Preparation of N-terminal Lipopeptides for Structural Determination by Mass Spectrometry

Enriquecimento de lipoproteínas bacterianas e preparação do N-terminal Lipopeptides de determinação estrutural por espectrometria de massa

Lipoproteins are important constituents of the bacterial cell envelope and potent activators of the mammalian innate immune response. Despite their ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Uma alta produtividade, alto teor, baseada em líquido c. elegans patossistema

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Análise comportamental de grande c. elegans populações usando um amplo campo de visão de rastreamento plataforma automatizada

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...