Name: automated separation of c. elegans variably colonized by a bacterial pathogen
Uploaded: 2014-03-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen at JoVE.com

Författarna tackar Ellison Medical Foundation för deras stöd. Vi vill också tacka medlemmarna av Abby Dernburg laboratorium för hjälp med att använda wormsorter.

1. Skaffa en synkroniserad Kultur för unga vuxna djur <ol><li> Odla maskar på flera NGM plattor ympats med OP50-1 E. coli-bakterier (10x koncentrerad från en mättad kultur) förrän många maskar har nått gravid scenen. </li><li> Behandla gravida djur med ägg-prep-lösning för att erhålla en synkroniserad kultur (ägg). </li><li> Tallrik ägg på flera 60-mm NGM plattor ympades med 10x koncentrerad OP50-1 vid en densitet av ungefär 150 till 200 ägg / platta. </li><li> Inkubera plattorna vid 25 ° C ...

<ol>
	<li>Pulak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+analysis,+sorting,+and+dispensing+of+C.+elegans+on+the+COPAS+flow-sorting+system.">Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system.</a> Methods Mol. Biol. , 275-286 (2006).</li><li>Dupuy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+analysis+of+in+vivo+spatiotemporal+promoteractivity+in+Caenorhabditis+elegans.">Genome-scale analysis of in vivo spatiotemporal promoteractivity in Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Biotechnol. 25, 663-668 (2007).</li><li>Squiban, B., Belougne, J., Ewbank, J., Zugasti, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+Automated+High-throughput+Genome-wide+RNAi+Screens+in+elegans.">Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in elegans.</a> J. Vis. Exp. (60), (2012).</li><li>Doitsidou, M., Flames, N., Lee, A. C., Boyanov, A., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+screening+for+mutants+affecting+dopaminergic-neuron+specification+in+C.+elegans.">Automated screening for mutants affecting dopaminergic-neuron specification in C. elegans.</a> Nat. Methods. 5, 869-872 (2008).</li><li>Pujol, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+innate+immune+responses+to+infection+and+wounding+in+the+C.+elegans+epidermis.">Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis.</a> Curr. Biol. 18, 481-489 (2008).</li><li>Medzhitov, R., Janeway, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+recognition:+mechanisms+and+pathways.">Innate immune recognition: mechanisms and pathways.</a> Immunol. Rev. 173, 89-97 (2000).</li><li>Matzinger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance,+danger,+and+the+extended+family.">Tolerance, danger, and the extended family.</a> Annu. Rev. Immunol. 12, 991-1045 (1994).</li><li>Mariathasan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopyrin+activates+the+inflammasome+in+response+to+toxins+and+ATP.">Cryopyrin activates the inflammasome in response to toxins and ATP.</a> Nature. 440, 228-232 (2006).</li><li>Melo, J. A., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+conserved+C.+elegans+genes+engages+pathogen-+and+xenobiotic-associated+defenses.">Inactivation of conserved C. elegans genes engages pathogen- and xenobiotic-associated defenses.</a> Cell. 149, 452-466 (2012).</li><li>Chen, G. Y., Nunez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterile+inflammation:+sensing+and+reacting+to+damage.">Sterile inflammation: sensing and reacting to damage.</a> Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).</li><li>Tenor, J. L., Aballay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+Toll-like+receptor+is+required+for+Caenorhabditis+elegans+innate+immunity.">A conserved Toll-like receptor is required for Caenorhabditis elegans innate immunity.</a> EMBO Rep. 9, 103-109 (2008).</li><li>Pujol, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reverse+genetic+analysis+of+components+of+the+Toll+signaling+pathway+in+Caenorhabditis+elegans.">A reverse genetic analysis of components of the Toll signaling pathway in Caenorhabditis elegans.</a> Curr. Biol. 11, 809-821 (2001).</li><li>McEwan, D. L., Kirienko, N. V., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+translational+inhibition+by+Pseudomonas+aeruginosa+Exotoxin+A+Triggers+an+immune+response+in+Caenorhabditis+elegans.">Host translational inhibition by Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A Triggers an immune response in Caenorhabditis elegans.</a> Cell Host Microbe. 11, 364-374 (2012).</li><li>Dunbar, T. L., Yan, Z., Balla, K. M., Smelkinson, M. G., Troemel, E. R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+detects+pathogen-induced+translational+inhibition+to+activate+immune+signaling.">C. elegans detects pathogen-induced translational inhibition to activate immune signaling.</a> Cell Host Microbe. 11, 375-386 (2012).</li><li>Irazoqui, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+pathogenesis+and+host+responses+during+infection+of+C.+elegans+by+P.+aeruginosa+and+S.+aureus.">Distinct pathogenesis and host responses during infection of C. elegans by P. aeruginosa and S. aureus.</a> PLoS Pathog. 6, (2010).</li><li>Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M., Mylonakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+infection+of+Caenorhabditis+elegans+induces+antifungal+immune+defenses.">Candida albicans infection of Caenorhabditis elegans induces antifungal immune defenses.</a> PLoS Pathog. , (2011).</li><li>Shapira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+role+for+a+GATA+transcription+factor+in+regulating+epithelial+innate+immune+responses.">A conserved role for a GATA transcription factor in regulating epithelial innate immune responses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14086-14091 (2006).</li><li>Troemel, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p38+MAPK+regulates+expression+of+immune+response+genes+and+contributes+to+longevity+in+C.+elegans.">p38 MAPK regulates expression of immune response genes and contributes to longevity in C. elegans.</a> PLoS Genet. , 183 (2006).</li><li>Twumasi-Boateng, K., Shapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+immune+responses+from+pathogen+colonization+supports+pattern+recognition+in+C.+elegans.">Dissociation of immune responses from pathogen colonization supports pattern recognition in C. elegans.</a> PLoS One. , 7 (2012).</li><li>Jakobsen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alkaloid+compound+harmane+increases+the+lifespan+of+Caenorhabditis+elegans+during+bacterial+infection,+by+modulating+the+nematode's+innate+immune+response.">The alkaloid compound harmane increases the lifespan of Caenorhabditis elegans during bacterial infection, by modulating the nematode's innate immune response.</a> PLoS One. 8, (2013).</li><li>Portal-Celhay, C., Bradley, E. R., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+intestinal+bacterial+proliferation+in+regulation+of+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">Control of intestinal bacterial proliferation in regulation of lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Microbiol. 12, 49 (2012).</li><li>Troemel, E. R., Felix, M. A., Whiteman, N. K., Barriere, A., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsporidia+are+natural+intracellular+parasites+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biol. 6, 2736-2752 (2008).</li><li>Montalvo-Katz, S., Huang, H., Appel, M. D., Berg, M., Shapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+with+soil+bacteria+enhances+p38-dependent+infection+resistance+in+Caenorhabditis+elegans.">Association with soil bacteria enhances p38-dependent infection resistance in Caenorhabditis elegans.</a> Infect. Immun. 18, 514-520 (2013).</li></ol>

Den metod vi beskriva utnyttjar fluorescerande märkning av enheter utanför masken, för att följa växelverkan mellan masken och dess miljö. I det fall vi presenterar, var separation baserad på märkning av en patogen och var anställd för att separera maskar med tung patogen lasten från de utan (eller ljus) belastning. Efterföljande genuttrycksanalys fann ingen skillnad i immunsvar mellan de två grupperna tyder på att de var oberoende av patogen belastning. Signalen som initierar svaret visades någon annanst...

Automatisk mask sortering är ungefär som FACS, som verkar genom att mäta en fluorescerande signal i en mask (normalt från transgent uttryck av reporterproteiner) när den passerar rätade i ett rör, vilket gör omdirigering antingen till ett provrör / bra eller till en avfallsbehållare enligt till slussning parametrar som forskaren 1. Den wormsorter kan underlätta forskning på många sätt, ett exempel på att använda det som ett analytiskt verktyg är en studie som följde Spatiotemporal mönster av promotoraktivitet för nästan 1.000 gener 2. Emellertid är den huvudsakliga användningen av wormsorter i genetiska skärmar, efter målgenuttryck nivåer eller lokalisering av fluorescerande protein längs axeln av snäck 3-5. Här beskriver vi en ny ansökan om wormsorter, i följande koloniseringen av masken med en fluorescensmärkta patogen. Med detta som ett verktyg som vi fokuserat på förhållandet mellan Pathogsv kolonisering / belastning och immunförsvaret, för att få nya insikter i de mekanismer som ansvarar för initiering av immunsvar i masken. I praktiskt taget alla organismer som studerats hittills, initiering av medfödda immunsvar mot patogena mikroorganismer är beroende av erkännande av patogen-associerade molekylära mönster (PAMPs), och / eller fara / skada-associerade molekylära mönster (dämpas) 6,7. Den första är bevarade mikrobiella strukturer som inkluderar komponenter i den mikrobiella cellväggen, dess flagellum, eller dess membranet 6, den andra omfattar både släppt molekyler (t.ex. ATP 8), förändrade proteiner eller andra markörer för förändrade cellulära processer 9,10. Båda typerna av signaler känns igen av proteiner som betecknas som mönsterigenkänningsreceptorer (PRRS), som vid specifik bindning av en mönstermolekyl aktiverar en kedja av händelser som leder till ett skyddande svar. C. elegans har varit extremt användbar som en tractable modell att dissekera olika aspekter av värd-patogen interaktioner, men en sak som inte har förstått är hur immunsvar initieras i masken. Ingen av de förmodade receptorer som är ortologa till mönsterigenkänningsreceptorer (PRRS) i andra organismer har visat sig binda PAMPs, och många av ortologer PRRS som är avgörande för immunsvar hos andra organismer visar en förvånansvärt begränsat bidrag till mask patogena svar och motstånd. Till exempel är Drosophila Toll-receptorn, som är nödvändig för att motstå grampositiva patogener, som representeras i C. elegans med en enda homolog, tol-1, vilket bidrar till skydd mot gramnegativa patogener Salmonella Typhimurium 11, men inte från andra testade gramnegativa, eller positiva patogener 11,12. Dessa observationer i kombination med data som indikerar att immunsvar kan induceras genom att störa cellulära proteinet översättnings hsom ledde en del som tyder på att C. elegans detekterar primärt dämpar 9,13,14. Trots rapporter som beskriver förmåga döda patogener för att inducera immunsvar tyder på att PAMP bindning kan ha en viktig roll i patogen erkännande i C. elegans 15,16. Tidigare arbete med inriktning på immunsvar i ålders synkroniseras genetiskt identiska C. elegans populationer, visade stor individuell variation i intestinal kolonisering av den bakteriella gramnegativa patogener Pseudomonas aeruginosa. Men transkriptionsprofileringsstudier behandlade dessa variabelt-koloniserade befolkningsgrupper som en enhet 17,18. Med utnyttjande av denna variation, utvecklade vi ett protokoll fokuserar en automatiserad wormsorter att separera differentiellt koloniserade populationer av Caenorhabditis elegans som utsätts för GFP-uttryck P. aeruginosa. Undersöka genuttryck i olika-koloniserade befolknings facilitated bedömning av förhållandet mellan patogen belastning (och tillhörande skador) och immunsvar och som nya insikter om patogen erkännande i C. elegans 19. Nedan beskriver vi de protokoll, som skulle kunna tillämpas för att sortera maskar infekterade med någon fluorescerande patogen. Till potentiella användare bör det noteras att antalet maskar som måste redas ut beror på typen av efterföljande analyser och protokoll som används. Till exempel, i fallet med mikroarray genuttrycksanalys,&gt; 1000 maskar kommer att krävas för att erhålla tillräckligt med RNA, om standardprotokoll används, men ~ 100 maskar skulle räcka om förstärkning används, tillåter snabb insamling av material och på så sätt minimera stress för maskarna.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="927">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">M9 Buffer</td>
			<td style="width:139px;">Prepared in house</td>
			<td style="width:527px;">Recipe at wormbook.org</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rifampicin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R3501</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Egg prep solution&#160;</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td>50ml water ; 40ml bleach ; 10ml of 10N Sodium Hydroxide&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NGM plates&#160;</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td>Recipe at wormbook.org</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SKP plates</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td>Recipe same as NGM only 0.35% peptone instead of 0.25%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Control test particles&#160;</td>
			<td>Union Biometrica&#160;</td>
			<td>310-5071-001</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated separation of c. elegans variably colonized by a bacterial pathogen

Den wormsorter är ett instrument som är analogt med en FACS-maskin som används i studier av Caenorhabditis elegans, typiskt för att sortera maskar baserade på expression av en fluorescerande reporter. Här lyfter vi en alternativ användning av detta instrument, för att sortera maskar i förhållande till graden av kolonisering av en GFP-uttryckande patogen. Denna nya användning tillät oss att få förhållandet mellan koloniseringen av masken tarmen och induktion av immunsvar. Medan C. elegans immunsvar mot olika patogener har dokumenterats, det är fortfarande okänt vad som initierar dem. De två möjligheter (som inte utesluter varandra) är erkännandet av patogen-associerade molekylära mönster, och upptäckt av skador som orsakas av infektion. För att skilja mellan de två möjligheter, måste exponering för patogenen att skilja från de skador den orsakar. Den wormsorter aktiverat separation av maskar som extensivt koloniserades av Gram-negative patogen Pseudomonas aeruginosa, med skador som sannolikt orsakats av patogener last, från maskar som exponerats på liknande sätt, men inte, eller marginellt, koloniserade. Dessa skilda populationer användes för att bedöma förhållandet mellan patogen belastning och induktion av transkriptionsimmunsvar. Resultaten tyder på att två dissocieras, stödja möjligheten att patogenen erkännande.

När åldersmatchade, genetiskt identiska C. elegans utsätts för P. aeruginosa, är en bred spridning observerades i nivåer av kolonisering (Figur 1A). Med hjälp av det protokoll som beskrivs här för effektiv separation av noncolonized från koloniserade maskar kan uppnås (Figur 1B). Till skillnad noncolonized maskar, koloniserade maskar visar tecken på skada, som till exempel långsamma och minskad avföring 19. Det senare kan vara en anledning till...

Watch this Scientific Journal Video about Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen at JoVE.com

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Automatiserad Separation av<em&gt; C. elegans</em&gt; Steglös koloniseras av en bakteriell patogen

Den wormsorter underlättar genetiska skärmar i Caenorhabditis elegans genom att sortera maskar enligt uttryck av fluorescerande reportrar. Här beskriver vi en ny användning: sortering efter kolonisering av en GFP-uttryckande patogen, och vi använder den för att undersöka dåligt förstådda roll patogen erkännande i att initiera immunsvar.

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Invasion av mänskliga celler genom en bakteriell patogen

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

En dag Workflow Program för bakteriell patogen Detection och provning av antimikrobiell resistens från blododlingar

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Visualisering av bakterietoxin Inducerade svar Använda Live Mikroskopi Cell Fluorescens

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging INLC Sekre att undersöka Cellular Infektion av bakteriell patogen<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation och multi fenotypisk Hög halt Screening av<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutanter

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Unravelling funktionen av en bakteriell Effector från en icke-odlingsbar växtpatogen hjälp av en jäst två-hybrid Screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

Enrichment of Bacterial Lipoproteins and Preparation of N-terminal Lipopeptides for Structural Determination by Mass Spectrometry

Anrikning av bakteriell lipoproteiner och beredning av N-terminala Lipopeptides för strukturella bestämning genom masspektrometri

Lipoproteins are important constituents of the bacterial cell envelope and potent activators of the mammalian innate immune response. Despite their ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

En hög genomströmning, hög-innehåll, vätskebaserade C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Automatiserad beteendevetenskaplig analys av stor C. elegans populationer med ett brett fält-of-view spårning plattform

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...