Name: a new approach for the comparative analysis of multiprotein complexes based on 15n metabolic labeling and quantitative mass spectrometry
Uploaded: 2014-03-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry at JoVE.com

MH从“德意志研究联合会”（DFG）的承认支持。作者 贡献：MH设计的研究，KT，JS和MT进行研究和分析的数据，KT和MH写文章。

1。 衣藻的培养<ol><li>以下三莱茵衣藻株在本研究中使用：WT cc124，WT CW15-arg7（细胞壁缺陷和精氨酸营养缺陷型），一个ΔPSI突变体菌株29和一个pgrl1敲除菌株4。 </li><li>所有菌株均生长在Tris-乙酸盐-磷酸盐（TAP）的介质30，在25℃用20-50的连续光强度μE/米2秒，振摇在120rpm。 ΔPSI的文化应该被包裹着一些纸巾&lt;5μE/米2秒的曝光。 </l...

利用稳定同位素标记不同的蛋白质组定量研究已经发表在最近几年。在这些实验中通常有两种不同的样品进行比较，其中一个样品都标有一个稳定的同位素。其后，两个样品的蛋白质或肽组合在相等的比率，并进一步处理一起48。这种研究常常想比较定义孤立的细胞区室（ 例如叶绿体，线粒体，或类囊体膜）暴露于不同应激条件26,34,49调查向上或向下调节特定蛋白质。所描?...

在植物和藻类类囊体膜的光合过程可以以线性和环状的方式发挥作用。在线性电子流（LEF）光系统I（PSI），光系统II（PSII）和细胞色素b 6 / f电子转移，最终从水到NADP + 1，导致NADPH和ATP 2的产生。与此相反，循环电子传递（CEF），这被称为像状态2 3和厌氧条件4，结果在由注入电子返回到电子传递链的再还原氧化的PSI不同的环境条件下被诱导。这个过程可以发生在任何的色素b 6 / f复合体1的基质侧或在质体醌库5并产生ATP，但没有NADPH 2。 所提出的协议的目的是展示一个质谱（MS）基于米法认列在莱茵衣藻的类囊体膜多蛋白复合物来获得不同的条件（通过比较基因不同的菌株例举）下洞察这些配合物的组合物的比较，定量分析。这种方法在出版物由寺岛等被使用。在2012年呈现持续进修基金C中的钙离子依赖的调节衣藻由多蛋白复合物包括蛋白CAS号，ANR1和PGRL1 6介导的。该过程将通过比较分析CEF-超复合两种基因不同菌株的组成，从而采取贴标两个菌株与重氮（15 N）的一个优势来解释。简要地，该协议包括类囊体膜的制备，随后的洗涤剂溶解，并在蔗糖密度梯度光合配合物分馏。梯度分离后，选定压裂两株蒸发散是基于等体积混合，通过SDS-PAGE随后在凝胶内消化和随后的定量质谱分析分离。 如上所述，CEF是不同的环境条件下诱导，并从2010年出版演示了CEF功能，超复合的隔离状态下的2锁定单元格衣藻 7，这是由于超速离心过程中蔗糖密度梯度分离溶解的类囊体膜进行。从岩井等 7种不同的，所提出的协议说明了CEF-超复合的厌氧生长C.隔离莱茵衣藻培养物下面的替代程序。这包括在类囊体隔离协议的变化，以及关于在溶解步骤的差异和蛋白质复合物通过超速离心分离。在本协议中，类囊体膜通过施加由蔡氏和Bennoun 8公布的程序，而用于类囊体膜制剂通过岩井等的缓冲液中分离人含有25mM的MES，0.33M的蔗糖，5毫摩尔MgCl 2，1.5 mM氯化钠（pH6.5）中所描述的9。用0.7-0.8％的洗涤剂（N-十三烷基-β-D-麦芽糖苷）进行增溶，在冰上在岩井和同事的情况下30分钟，而这里所描述的增溶方法依赖于使用0.9％的去污剂（正十二烷基-β-D-麦芽糖苷（β-DM））和仅20分钟在冰上进行。两组用每毫升0.8毫克叶绿素为与各自的洗涤剂的溶解。对于光合作用复合体从溶解的类囊体膜的分离岩井等人采用蔗糖浓度0.1-1.3 M之间，而该协议的作者使用浓度为0.4-1.3米的最后一个区别是离心速度，相比是较低的在EArlier出版。 类囊体膜与非离子洗涤剂然后再进行蔗糖密度梯度分级分离的增溶作用已经在大量的研究，从20世纪80年代，直至今日7，9-14和还蛋白的代谢标记的应用是在蛋白质组学领域中的广泛的方法中得到应用。所描述的方法通过将其在重氮如在15 N的NH 4 Cl等 ，其掺入到所有氨基酸导致大规模的形式唯一氮源的存在下培养适用于比较两种菌株之一的15 N代谢标记移取决于肽的氨基酸序列。当分析的内一个MS运行14 N和15 N的混合物，该质量转移可以被用来确定样品原点为每种肽的丰度和可以计算表示为对应的相对丰度相肽ING蛋白质15。 C.上众多的定量蛋白质组学研究莱茵衣藻是可用的，这比较确定蛋白质的量来分析实验条件（ 例如 ，由于营养16-19或光胁迫20,21改变蛋白质组）之间变化，蛋白质组。相比，这些研究中，在目前提出的方法的样品的等体积相结合，并进行分析。这种设置允许以研究蛋白质的迁移行为的梯度内，此外，分析不同的复合物相对于所研究的菌株的组合物。 此方法将被解释主要集中在三种蛋白质：第一候选是叶绿体本地化钙传感器蛋白CAS，这被证明是涉及光驯化C中藻 22。钙被认为是一个重要的信号ING离子为激活由于不同的生物和非生物胁迫最终导致基因表达的变化和细胞生理学和23有人提出，叶绿体可能有助于细胞内Ca 2 +通过CAS蛋白22,24,25的信号通路。第二蛋白是ANR1（厌氧反应1 6），其被证明是缺氧的生长条件下在C诱导的蛋白藻 26。值得注意的是，中科院以及ANR1被认定为CEF-超复合，而且，通过使用反向遗传学的方法，它表明，这两种蛋白质有助于在功能上的CEF 在体内 6，支持他们为这种蛋白质复合体的功能性亚基作用亚基。第三蛋白是类囊体蛋白PGR5样1（PGRL1），将其显示参与在CEF中衣藻 4,27以及在拟南芥 5,28和也标识entified在岩井等人的工作。7 野生型（WT）相对于（对比）一个ΔPSI29株表现出缺失的PSAB基因，编码为一个重要的光系统I亚单位，这也是该组成部分：该方法将通过示出的两个不同的实验的结果呈现CEF-超复合和WT与一个pgrl1敲除株4。为每个实验的CEF-超复合的15 N和14 N-标记的菌株进行了比较之间的定量组成。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1135">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:392px;">Chemicals</td>
			<td style="width:427px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:392px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:392px;">Acetone</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Acetonitrile Optigrade f&#252;r LC-MS</td>
			<td style="width:427px;">Diagonal 
			website: https://www.diagonal.de/</td>
			<td style="width:119px;">9340</td>
			<td style="width:199px;">harmful, work with gloves 
			see protocol text for further precautions</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;">Ammonium chloride 15N</td>
			<td style="width:427px;">Cambridge Isotope Laboratories 
			website: http://www.isotope.com/cil/index.cfm</td>
			<td style="width:119px;">39466-62-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Ammonium chloride 14N</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A0988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Ammonium hydrogenphosphate&#160;</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A3583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Ammonium sulfate&#160;</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A3598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Coomassie brilliant blue R-250</td>
			<td style="width:427px;">Fisher Scientific 
			website: http://www.de.fishersci.com/index.php/deindex</td>
			<td>10041653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">n-Dodecyl-&#946;-D-maltoside</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A0819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">EDTA</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A2937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Formic acid&#160;&#160;</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A3858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Hepes</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A3724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td>A4425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Methanol</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A2954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Phosphorous acid</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A0989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Di-Potassium hydrogenphosphate&#160;</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A1042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Potassium di-hydrogenphosphate&#160;</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A1043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A1551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sucrose</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A1125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Tricine</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A3954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:392px;">Tris</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A2264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Trypsin (sequencing grade modified) and Trypsin buffer</td>
			<td style="width:427px;">Promega 
			website: http://www.promega.de/</td>
			<td style="width:119px;">V5111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:392px;"></td>
			<td style="width:427px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:392px;">Equipment&#160;</td>
			<td style="width:427px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Neboulizer (BioNeb cell disruptor)</td>
			<td style="width:427px;">Glas-Col 
			website: http://www.glascol.com/product/subproduct/id/75</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:392px;">Centrifuge tubes (14 x 89 mm)&#160; 
			for preparation of takahashi style gradients</td>
			<td style="width:427px;">Beckman Coulter 
			website: http://www.beckmancoulter.de/</td>
			<td style="width:119px;">331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:392px;">Centrifuge tubes 25 x 89 mm 
			for preparation of thylakoid isolation gradients&#160;</td>
			<td style="width:427px;">Beckman Coulter 
			website: http://www.beckmancoulter.de/</td>
			<td style="width:119px;">344058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:392px;">Coulter Avanti Centrifuge J-20 XP</td>
			<td style="width:427px;">Beckman Coulter 
			website: http://www.beckmancoulter.de/</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Fuchs-Rosenthal cell couting chamber</td>
			<td style="width:427px;">Diagonal 
			website: https://www.diagonal.de/</td>
			<td style="width:119px;">449/72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Homogenizer (Potter) 50 ml&#160;</td>
			<td style="width:427px;">Fisherbrand 
			website: http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">10618242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Pistil for homogenizer</td>
			<td style="width:427px;">Fisherbrand 
			website: http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">105252220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:392px;">Ultracentrifuge (Optima XPN-80 Ultracentrifuge)</td>
			<td style="width:427px;">Beckman Coulter 
			website: http://www.beckmancoulter.de/</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:392px;"></td>
			<td style="width:427px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:392px;">Other</td>
			<td style="width:427px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:392px;">Antibodies&#160;</td>
			<td style="width:427px;">Agrisera 
			website: http://www.agrisera.com/en/index.html</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a new approach for the comparative analysis of multiprotein complexes based on 15n metabolic labeling and quantitative mass spectrometry

所引入的协议提供了在类囊体膜多蛋白复合物的分析工具，通过在不同条件下揭示见解复杂的组合物。在这个协议中的方法被证明通过比较蛋白复合物负责在莱茵衣藻的循环电子流（CEF），分离自遗传上不同的菌株的组合物。该方法包括类囊体膜的分离，随后通过基于差分代谢标记（14 N / 15 N）分离成多蛋白复合物通过蔗糖密度梯度离心法，SDS-PAGE，免疫检测和比较，定量质谱（MS）分析菌株。洗涤剂溶解的类囊体膜对蔗糖密度梯度装在平等的叶绿素浓度。超速离心后，将梯度分离成各种馏分，这是由大量spectromet分析RY基于等量。这种方法允许梯度组分中的成分进行调查，此外，分析不同蛋白质的迁移行为，尤其是专注于ANR1，CAS和PGRL1。此外，这种方法被证明了通过从以往的研究支持的结果（即先前描述的是CEF-超复合如PGRL1，FNR的一部分的蛋白质的识别和PSI-依赖的迁移，并在确认的结果与免疫印迹和另外细胞色素F）。值得注意的是，这种方法适用于解决范围广泛的有本协议可以通过， 例如用于多蛋白复合物成分从不同的环境条件下分离出的比较分析问题。

所引入的定量蛋白质组学方法的目的是多蛋白复合物的组成表征由基因不同C. CEF-超复合成分的比较分析表明类囊体膜衣藻株。所描述的方法已经被成功地由寺岛等人 6施加，并且包括从厌氧生长的培养物类囊体膜，随后洗涤剂增溶的隔离。随后，样品装载到蔗糖密度梯度的基础上平等的叶绿素量和复合物通过超速离心分级。用于定量质谱分析从不同菌株2梯度组分等体?...

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A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

所描述的比较，定量蛋白质组学方法的目的是获得见解多蛋白复合物的组成不同的条件下，并证明通过比较基因不同的菌株。为定量分析从蔗糖密度梯度不同的馏分等体积完全由质谱混合并进行分析。

多蛋白复合物的比较分析新方法基于<sup&gt; 15</sup&gt;Ñ代谢标记和定量质谱

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

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A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

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