Name: imaging cell membrane injury and subcellular processes involved in repair
Uploaded: 2014-03-24T20:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health Grants AR055686 og AR060836 og postdoktorstilling til AD av franske muskeldystrofi Association (AFM). Den cellulære bildebehandling anlegget benyttes i denne studien er støttet av National Institutes of Health Grants HD040677.

En. Imaging cellemembranen Repair Bruke Bulk (Glassperle) såret Denne protokollen tillater separat merking de skadde celler og de som ikke klarer å helbrede. Kvantifisere disse populasjoner av celler krever bruk av tre forhold: 1. Test (C1) - Celler ble tillatt å reparere i nærvær av Ca 2 +, 2. Kontroll 1 (ingen skade C2) - Celler blir inkubert i nærvær av Ca2 +, men ikke skades, og 3.. Kontroll 2 (ingen reparasjon C3) - celler tillates å reparere i fravær av Ca ...

<ol>
	<li>Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-regulated+exocytosis+is+required+for+cell+membrane+resealing.">Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing.</a> Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).</li><li>Togo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+plasma+membrane+stimulates+rearrangement+of+microtubules+and+lipid+traffic+toward+the+wound+site.">Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site.</a> Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).</li><li>Miyake, K., McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+accumulation+and+exocytosis+at+sites+of+plasma+membrane+disruption.">Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption.</a> Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).</li><li>Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+repair+is+mediated+by+Ca2+-regulated+exocytosis+of+lysosomes.">Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes.</a> Cell. 106, 157-169 (2001).</li><li>Babiychuk, E. B., Monastyrskaya, K., Potez, S., Draeger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbing+confers+resistance+against+cell+lysis.">Blebbing confers resistance against cell lysis.</a> Death Differ. 18, 80-89 .</li><li>Bansal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+membrane+repair+in+dysferlin-deficient+muscular+dystrophy.">Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.</a> Nature. 423, 168-172 (2003).</li><li>Abreu-Blanco, M. T., Verboon, J. M., Parkhurst, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wound+repair+in+Drosophila+occurs+through+three+distinct+phases+of+membrane+and+cytoskeletal+remodeling.">Cell wound repair in Drosophila occurs through three distinct phases of membrane and cytoskeletal remodeling.</a> Cell Biol. 193, 455-464 (2011).</li><li>Jaiswal, J. K., Chakrabarti, S., Andrews, N. W., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptotagmin+VII+restricts+fusion+pore+expansion+during+lysosomal+exocytosis.">Synaptotagmin VII restricts fusion pore expansion during lysosomal exocytosis.</a> PLoS Biol. 2, 1224-1232 (2004).</li><li>McNeil, P. L., Clarke, M. F., Miyake, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wound+assays.">Cell wound assays.</a> Protoc. Cell Biol. Chapter 12, (2001).</li><li>McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+introduction+of+molecules+into+cells.">Direct introduction of molecules into cells.</a> Protoc. Cell Biol. Chapter 20, (2001).</li><li>Knight, M. M., Roberts, S. R., Lee, D. A., Bader, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+using+confocal+microscopy+induces+intracellular+calcium+transients+and+cell+death.">Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death.</a> J. Physiol. Cell Physiol. 284, C1083-C1089 (2003).</li><li>McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endomembrane+requirement+for+cell+surface+repair.">The endomembrane requirement for cell surface repair.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4592-4597 (2003).</li><li>Benink, H. A., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentric+zones+of+active+RhoA+and+Cdc42+around+single+cell+wounds.">Concentric zones of active RhoA and Cdc42 around single cell wounds.</a> Cell Biol. 168, 429-439 (2005).</li><li>Schmoranzer, J., Goulian, M., Axelrod, D., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+constitutive+exocytosis+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Imaging constitutive exocytosis with total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Cell Biol. 149, 23-32 (2000).</li><li>Steyer, J. A., Horstmann, H., Transport Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=docking+and+exocytosis+of+single+secretory+granules+in+live+chromaffin+cells.">docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells.</a> 388, 474-478 (1997).</li><li>Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proximal+lysosomes+are+the+major+vesicles+responsible+for+calcium-dependent+exocytosis+in+nonsecretory+cells.">Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells.</a> Cell Biol. 159, 625-635 (2002).</li><li>Jaiswal, J. K., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+4.12.">Ch. 4.12.</a> Current Protocols in Cell Biology. , 4.12.1-4.12.15 (2003).</li><li>Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+(TIRF)+microscopy+illuminator+for+improved+imaging+of+cell+surface+events.">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events.</a> Protoc. Cytom. Chapter 12, (2012).</li><li>Jaiswal, J. K., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+single+events+at+the+cell+membrane.">Imaging single events at the cell membrane.</a> Chem. Biol. 3, 92-98 (2007).</li></ol>

Cellemembranen skade in vivo forekommer på grunn av en rekke fysiologiske belastninger og flere eksperimentelle tilnærminger er blitt utviklet for å etterligne disse. Disse inkluderer å skade cellemembran av adherente celler ved å skrape dem av fatet eller ved passering gjennom en trang boring sprøyte 9,10. Etter slike skader cellene gro i suspensjon og ikke levd opp til den ekstracellulære matrise som de vanligvis gjør i vevet. Atter andre, slik som bruken av poredannende toksiner kjemisk fo...

Cell membranen opprettholder integriteten av celler ved å gi en barriere mellom cellen og det ekstracellulære miljø. En kjemisk, elektrisk eller mekanisk stimulus som overstiger det normale fysiologiske terskelen, så vel som tilstedeværelse av invaderende patogener kan hver resultere i skade på cellemembranen og utløse en påfølgende cellerespons for å reparere skaden. For å overleve disse skadene til cellemembranen, cellene har en effektiv mekanisme for reparasjon. Denne mekanismen er kalsium avhengig og innebærer intracellulær trafficking av proteiner som annexins og MG53 blant andre så vel som subcellulære avdelinger som endosomes, lysosomer, Golgi avledet vesikler og mitokondrier til den skadde cellemembranen 1-7. Men fortsatt detaljene i sekvens av molekylære og subcellulære hendelser involvert i å reparere skadet cellemembranen dårlig forstått. Cells reparasjon respons kan bli separert i øretly og sene svar. Tidlige tiltak, som oppstår i løpet av sekunder til minutter tidsskala, er enormt viktig for å bestemme arten av sene svar som fører til vellykket celle reparasjon eller celledød. Endepunkts analyser basert på bulk biokjemiske og cellulære analyser har bidratt til å etablere involvering av molekylære og cellulære prosesser i reparasjon. Men, på grunn av heterogeniteten og hurtighet av cellulære reparasjonsrespons, endepunkts assays mislykkes i å gi den kinetiske og romlige informasjon om sekvensen av hendelser som fører til reparere. Tilnærminger som muliggjør kontrollert skade cellemembranen og tillater overvåking cellemembranen reparasjon og tilhørende subcellulære responser ved høy romlig og tidsmessig oppløsning er ideell for slike studier. Her har slike tilnærminger blitt presentert. To av protokollene beskrive framgangsmåter for å overvåke sanntid kinetikk av cellemembranen reparasjon og subcellulære responser knyttet til reparasjonsprosessen i levende celler følgende laser injury. Som et supplement til disse levende celle bildebehandling baserte analyser, har endepunkts analyser også blitt beskrevet som gir en befolkningsbasert mål for overvåking reparasjon av individuelle celler og de tilhørende subcellulære svar. For å demonstrere sin nytte disse tilnærmingene har blitt brukt til å overvåke handel og eksocytose av lysosomer som svar på cellemembranen skade.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="814" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1387</td>
			<td>Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP410</td>
			<td>Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC dextran (Lysine fixable)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1820</td>
			<td>2 mg/ml in CIM or PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC dextran (Lysine fixable)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1818</td>
			<td>2 mg/ml in CIM or PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA 16%</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15710</td>
			<td>4% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>1/10 000 in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T3163</td>
			<td>1 &#181;g/&#181;l in CIM or PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC dextran</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>FD40S</td>
			<td>2 mg/ml in growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAMP1&#160;</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-19992</td>
			<td>1/300 in growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 chicken anti-rat IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21470</td>
			<td>1/500 in blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-545-86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom petridish</td>
			<td>MatTek corporation</td>
			<td>P35G-1.0-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone O ring</td>
			<td>Bellco</td>
			<td>1943-33315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip holder</td>
			<td>Bellco</td>
			<td>1943-11111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-7816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12001-566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MP1400-500H</td>
			<td>Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Sreptomycin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12001-350</td>
			<td>Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5405</td>
			<td>5% chicken serum in CIM is used for blocking solution during immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Ca2+ and Mg2+ free)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12001-664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Olympus America, PA</td>
			<td>IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIRF illuminator&#160;</td>
			<td>Olympus America, PA</td>
			<td>Cell^TIRF (IEC60825-1:2007)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence illuminator</td>
			<td>Sutter Instruments, Novato CA</td>
			<td>Lambda DG-4 (DG-4 30)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD Camera</td>
			<td>Photometrics, Tucson, AZ</td>
			<td>Evolve 512 EMCCD&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition and anaysis software</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO</td>
			<td>Slidebook 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulsed laser</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO</td>
			<td>Ablate (3iL13)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top incubator</td>
			<td>Tokaihit, Japan</td>
			<td>INUBG2ASFP-ZILCS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging cell membrane injury and subcellular processes involved in repair

Muligheten av skadde celler for å helbrede er en grunnleggende cellulære prosessen, men cellulære og molekylære mekanismene som er involvert i healing skadde celler er dårlig forstått. Her assays er beskrevet for å overvåke egenskaper og kinetikk for helbredelse av dyrkede celler etter lokalisert skade. Den første protokollen beskriver et sluttpunkt basert tilnærming for å vurdere cellemembranen reparasjon evne til hundrevis av celler samtidig. Den andre protokoll beskriver en sanntids avbildning tilnærmingen til å overvåke kinetikken til cellemembran reparasjon i de enkelte celler følgende lokalisert skade med en pulset laser. Som healing skadde celler innebærer smugling av spesifikke proteiner og subcellulære avdelinger til skadestedet, beskriver den tredje protokollen bruk av ovennevnte endepunkt basert tilnærming for å vurdere en slik handel hendelse (lysosomal eksocytose) i hundrevis av celler skadet samtidig, og den siste protokoll beskriver bruk av pulset laser skade sammen med TIRF mikroerkopi til overvåke dynamikken i enkelte subcellulære avdelinger i skadde celler med høy romlig og tidsmessig oppløsning. Mens protokollene her beskriver bruken av disse metoder for å studere sammenhengen mellom cellemembranen reparasjon og lysosomal exocytose i dyrkede muskelceller, kan de anvendes som sådan for en hvilken som helst annen vedheftende dyrket celle, og subcellulære rommet av valget.

Protokoller som beskrives her for enkeltcelle-avbildning, er å overvåke evnen og kinetikk av cellemembranen reparasjon (Protokoller 1 og 2) og subcellulære handel og sammensmelting av lysosomer under reparasjon (Protocols 3 og 4). Protokoll 1 viser en bulk analyse som tillater merking av alle skadde celler og identifisere de skadde celler som ikke klarte å reparere. Resultatene i figur 1 viser at mens de uskadde celler (Figur 1a) forblir umerket, er cell...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair at JoVE.com

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

Prosessen med healing skadde celler innebærer smugling av spesifikke proteiner og subcellulære avdelinger til stedet av cellemembranen skade. Denne protokollen beskriver analyser for å overvåke disse prosessene.

Imaging cellemembranen Injury og subcellulære prosesser involvert i reparasjons

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

Research

JoVE Journal

Biology

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Rat mesenteriet Exteriorization: En modell for å undersøke de cellulære dynamikken i Angiogenese

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Lev Imaging analysen for vurdering av roller av Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Og Sphingomyelinase i Reparasjon av poredannende Gift Wounds

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Intramikros for Imaging subcellulære strukturer i levende mus Uttrykke Fluorescent Proteiner

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

gDNA berikelse av en Transposase-basert teknologi for NGS Analyse av hele sekvensen av<em&gt; BRCA1</em&gt;,<em&gt; BRCA2</em&gt;, og ni gener involvert i DNA Damage Repair

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Bakken staten uttømming super-oppløsning Imaging i pattedyrceller

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

Superoppløsning live celleavbildning av subcellulære strukturer

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...

Photodiode-Based Optical Imaging for Recording Network Dynamics with Single-Neuron Resolution in Non-Transgenic Invertebrates

Fotodiodebasert optisk bildebehandling for opptak av nettverksdynamikk med enkel nevronoppløsning i ikke-transgene hvirvelløse dyr

The development of transgenic invertebrate preparations in which the activity of specifiable sets of neurons can be recorded and manipulated with light ...

Isolating and Imaging Live, Intact Pacemaker Regions of Mouse Renal Pelvis by Vibratome Sectioning

Isolere og imaging Live, intakt Pacemaker regioner av mus Renal Pelvis av Vibratome seksjonering

The renal pelvis (RP) is a funnel-shaped, smooth muscle structure that facilitates normal urine transport from the kidney to the ureter by regular, ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Isolering av hjerte- og vaskulære glatte muskelceller fra voksen, juvenil, larve og embryonal sebrafisk for elektrofysiologiske studier

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...