Name: imaging cell membrane injury and subcellular processes involved in repair
Uploaded: 2014-03-24T20:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health bidrag AR055686 och AR060836 och postdoktorsstipendium till AD av franska muskeldystrofi Association (AFM). Den cellulära avbildning anläggning används i denna studie stöds av National Institutes of Health bidrag HD040677.

1. Imaging Cell Membrane Reparation Använda Bulk (glaspärla) sårbildning Detta protokoll möjliggör separat märkning av skadade celler och de som misslyckas med att läka. Kvantifiera dessa populationer av celler kräver användning av tre villkor: 1. Test (C1) - Celler tillåts att reparera i närvaro av Ca 2 +, 2. Kontroll 1 (ingen skada C2) - Cellerna odlades i närvaro av Ca2 +, men inte skadade, och 3. Kontroll 2 (ingen reparation C3) - celler tillåts att repar...

<ol>
	<li>Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-regulated+exocytosis+is+required+for+cell+membrane+resealing.">Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing.</a> Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).</li><li>Togo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+plasma+membrane+stimulates+rearrangement+of+microtubules+and+lipid+traffic+toward+the+wound+site.">Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site.</a> Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).</li><li>Miyake, K., McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+accumulation+and+exocytosis+at+sites+of+plasma+membrane+disruption.">Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption.</a> Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).</li><li>Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+repair+is+mediated+by+Ca2+-regulated+exocytosis+of+lysosomes.">Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes.</a> Cell. 106, 157-169 (2001).</li><li>Babiychuk, E. B., Monastyrskaya, K., Potez, S., Draeger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbing+confers+resistance+against+cell+lysis.">Blebbing confers resistance against cell lysis.</a> Death Differ. 18, 80-89 .</li><li>Bansal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+membrane+repair+in+dysferlin-deficient+muscular+dystrophy.">Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.</a> Nature. 423, 168-172 (2003).</li><li>Abreu-Blanco, M. T., Verboon, J. M., Parkhurst, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wound+repair+in+Drosophila+occurs+through+three+distinct+phases+of+membrane+and+cytoskeletal+remodeling.">Cell wound repair in Drosophila occurs through three distinct phases of membrane and cytoskeletal remodeling.</a> Cell Biol. 193, 455-464 (2011).</li><li>Jaiswal, J. K., Chakrabarti, S., Andrews, N. W., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptotagmin+VII+restricts+fusion+pore+expansion+during+lysosomal+exocytosis.">Synaptotagmin VII restricts fusion pore expansion during lysosomal exocytosis.</a> PLoS Biol. 2, 1224-1232 (2004).</li><li>McNeil, P. L., Clarke, M. F., Miyake, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wound+assays.">Cell wound assays.</a> Protoc. Cell Biol. Chapter 12, (2001).</li><li>McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+introduction+of+molecules+into+cells.">Direct introduction of molecules into cells.</a> Protoc. Cell Biol. Chapter 20, (2001).</li><li>Knight, M. M., Roberts, S. R., Lee, D. A., Bader, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+using+confocal+microscopy+induces+intracellular+calcium+transients+and+cell+death.">Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death.</a> J. Physiol. Cell Physiol. 284, C1083-C1089 (2003).</li><li>McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endomembrane+requirement+for+cell+surface+repair.">The endomembrane requirement for cell surface repair.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4592-4597 (2003).</li><li>Benink, H. A., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentric+zones+of+active+RhoA+and+Cdc42+around+single+cell+wounds.">Concentric zones of active RhoA and Cdc42 around single cell wounds.</a> Cell Biol. 168, 429-439 (2005).</li><li>Schmoranzer, J., Goulian, M., Axelrod, D., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+constitutive+exocytosis+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Imaging constitutive exocytosis with total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Cell Biol. 149, 23-32 (2000).</li><li>Steyer, J. A., Horstmann, H., Transport Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=docking+and+exocytosis+of+single+secretory+granules+in+live+chromaffin+cells.">docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells.</a> 388, 474-478 (1997).</li><li>Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proximal+lysosomes+are+the+major+vesicles+responsible+for+calcium-dependent+exocytosis+in+nonsecretory+cells.">Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells.</a> Cell Biol. 159, 625-635 (2002).</li><li>Jaiswal, J. K., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+4.12.">Ch. 4.12.</a> Current Protocols in Cell Biology. , 4.12.1-4.12.15 (2003).</li><li>Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+(TIRF)+microscopy+illuminator+for+improved+imaging+of+cell+surface+events.">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events.</a> Protoc. Cytom. Chapter 12, (2012).</li><li>Jaiswal, J. K., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+single+events+at+the+cell+membrane.">Imaging single events at the cell membrane.</a> Chem. Biol. 3, 92-98 (2007).</li></ol>

Cellmembranskada in vivo uppstår på grund av en mängd olika fysiologiska stressfaktorer och flera experimentella metoder har utvecklats för att efterlikna dem. Dessa inkluderar att skada cellmembran av vidhäftande celler genom att skrapa bort dem från skålen eller genom att passera genom en smal borrning spruta 9,10. Efter sådana skador cellerna läka i suspension och inte vidhäftar till den extracellulära matrisen, som de gör normalt i vävnaden. Ytterligare andra, såsom användning av p...

Cellmembranet upprätthåller integriteten för celler genom att tillhandahålla en barriär mellan cellen och den extracellulära omgivningen. En kemisk, elektrisk eller mekanisk stimulans som överstiger den normala fysiologiska tröskeln samt förekomsten av invaderande patogener kan varje resultat i skada till cellmembranet och utlösa en efterföljande cellulärt svar att reparera denna skada. För att överleva dessa skador till cellmembranet, celler har en effektiv mekanism för reparation. Denna mekanism är kalciumberoende och innebär intracellulär handel med proteiner såsom annexiner och MG53 bland andra samt subcellulära fack såsom endosomer, lysosomer, Golgi härledda vesikler och mitokondrier till den skadade cellmembran 1-7. Dock förblir detaljerna i sekvensen av molekylära och subcellulära händelser för att reparera skadade cellmembran dåligt kända. Cells reparationssvar kan uppdelas i öratly och sena svar. Tidiga reaktioner, som uppträder inom några sekunder till minuter tidsskala, är oerhört viktiga för att bestämma vilken typ av svar som leder till framgångsrik cell reparation eller celldöd. Slutpunkt analyser baserade på bulk biokemiska och cellulära analyser har bidragit till att fastställa medverkan av molekylära och cellulära processer i reparation. Men, på grund av heterogenitet och snabba cellulära reparationssvar, slutpunkt analyser inte ger de kinetiska och rumsliga detaljer i händelseförloppet som leder till reparation. Tillvägagångssätt som möjliggör kontrollerad skada av cellmembranet och tillåter övervakning av cellmembranet reparation och tillhörande subcellulära svaret vid hög rumslig och tidsmässig upplösning är idealiska för sådana studier. Här har sådana metoder lagts fram. Två av de protokoll som beskriver metoder för att övervaka realtids kinetiken för cellmembran reparation och subcellulära reaktioner i samband med reparationen i levande celler efter laser injury. Som ett komplement till dessa levande cell imaging baserade analyser, har slutpunktanalyser också beskrivits som ger en befolkningsbaserat mått för övervakning reparation av enskilda celler och tillhörande subcellulära svaren. För att visa sin nytta dessa metoder har använts för att övervaka handel och exocytos av lysosomer som svar på cellmembranskada.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="814" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1387</td>
			<td>Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP410</td>
			<td>Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC dextran (Lysine fixable)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1820</td>
			<td>2 mg/ml in CIM or PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC dextran (Lysine fixable)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1818</td>
			<td>2 mg/ml in CIM or PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA 16%</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15710</td>
			<td>4% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>1/10 000 in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T3163</td>
			<td>1 &#181;g/&#181;l in CIM or PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC dextran</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>FD40S</td>
			<td>2 mg/ml in growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAMP1&#160;</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-19992</td>
			<td>1/300 in growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 chicken anti-rat IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21470</td>
			<td>1/500 in blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-545-86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom petridish</td>
			<td>MatTek corporation</td>
			<td>P35G-1.0-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone O ring</td>
			<td>Bellco</td>
			<td>1943-33315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip holder</td>
			<td>Bellco</td>
			<td>1943-11111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-7816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12001-566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MP1400-500H</td>
			<td>Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Sreptomycin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12001-350</td>
			<td>Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5405</td>
			<td>5% chicken serum in CIM is used for blocking solution during immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Ca2+ and Mg2+ free)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12001-664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Olympus America, PA</td>
			<td>IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIRF illuminator&#160;</td>
			<td>Olympus America, PA</td>
			<td>Cell^TIRF (IEC60825-1:2007)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence illuminator</td>
			<td>Sutter Instruments, Novato CA</td>
			<td>Lambda DG-4 (DG-4 30)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD Camera</td>
			<td>Photometrics, Tucson, AZ</td>
			<td>Evolve 512 EMCCD&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition and anaysis software</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO</td>
			<td>Slidebook 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulsed laser</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO</td>
			<td>Ablate (3iL13)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top incubator</td>
			<td>Tokaihit, Japan</td>
			<td>INUBG2ASFP-ZILCS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging cell membrane injury and subcellular processes involved in repair

Förmågan hos skadade celler att läka är en grundläggande cellulär process, men cellulära och molekylära mekanismer som är involverade i läkning skadade celler är dåligt kända. Här analyser beskrivs att övervaka förmåga och kinetik av läkning av odlade celler efter lokaliserad skada. Den första protokoll beskriver en slutpunkt baserad metod för att samtidigt bedöma cellmembran reparationsförmåga av hundratals celler. Den andra protokoll beskriver en realtidsavbildningsteknik för att övervaka kinetiken för cellmembran reparation i enskilda celler efter lokal skada med en pulsad laser. Eftersom healing skadade celler innebär handel med specifika proteiner och subcellulära fack till platsen för skadan, beskriver användningen av ovan slutpunkt baserad metod för att bedöma en sådan handel händelse (lysosomala exocytos) i hundratals celler skadade samtidigt och den sista protokollet den tredje protokollet beskriver användningen av pulsad laser skada tillsammans med TIRF microskopia för att övervaka dynamiken i enskilda subcellulära fack i skadade celler med hög spatial och temporal upplösning. Även om protokollen beskriver det användningen av dessa metoder för att studera sambandet mellan cellmembran reparation och lysosomala exocytos i odlade muskelceller, kan de användas som sådan för alla andra anhängare odlade celler och subcellulära fack av val.

Protokoll som beskrivs här för enskild cell imaging är att övervaka förmågan och kinetik av cellmembran reparation (protokoll 1 och 2) och den subcellulära handel och fusion av lysosomer under reparation (protokoll 3 och 4). Protokoll 1 visar en bulkanalys som gör att markera alla skadade celler och identifiera de skadade celler som misslyckats med att reparera. Resultaten i figur 1 visar att medan de oskadade celler (Figur 1A) förblir omärkt, cell...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair at JoVE.com

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

Läkningsprocessen skadade celler innebär handel med specifika proteiner och subcellulära fack till platsen av cellmembranet skada. Detta protokoll beskriver analyser för att övervaka dessa processer.

Imaging Cell Membrane Skador och Subcellulära processer som ingår i reparations

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

Research

JoVE Journal

Biology

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Visualisering av MG53-medierad cellmembranet reparera med hjälp av In vivo Och In vitro System

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Rat krös exteriorisering: En modell för utredning av de cellulära Dynamics inblandade i angiogenes

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live Imaging analys för bedömning av roller Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Och sfingomyelinas i Reparation av por-bildande Toxin Wounds

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Intravital Mikroskopi för Imaging subcellulära strukturer i levande möss som uttrycker fluorescerande proteiner

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

gDNA Anrikning av ett transposas baserad teknik för NGS Analys av hela sekvensen av<em&gt; BRCA1</em&gt;,<em&gt; BRCA2</em&gt;, och nio gener involverade i DNA-skador Repair

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Grundtillståndet utarmning super resolution Imaging i däggdjursceller

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

Superupplösning Live Cell Imaging av subcellulära strukturer

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...

Photodiode-Based Optical Imaging for Recording Network Dynamics with Single-Neuron Resolution in Non-Transgenic Invertebrates

Fotodiodbaserad optisk avbildning för inspelning av nätverksdynamik med en neuronupplösning hos icke-transgena ryggradslösa djur

The development of transgenic invertebrate preparations in which the activity of specifiable sets of neurons can be recorded and manipulated with light ...

Isolating and Imaging Live, Intact Pacemaker Regions of Mouse Renal Pelvis by Vibratome Sectioning

Isolera och avbilda levande, intakt pacemakerregioner av musen njurs bäcken vid Vibratome dela upp

The renal pelvis (RP) is a funnel-shaped, smooth muscle structure that facilitates normal urine transport from the kidney to the ureter by regular, ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Isolering av hjärt- och vaskulära glattmuskelceller från vuxna, juvenila, larviga och embryonala zebrafiskar för elektrofysiologiska studier

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...