Name: a modified precipitation method to isolate urinary exosomes
Uploaded: 2015-01-16T13:00:00
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We are grateful to the Roney Family Foundation for the support of this study. We acknowledge the contribution of Dr. M. Lucrecia Alvarez to the planning and execution of the experiments described in this work.

注：変更された沈殿法を用いて尿中エキソソームの単離に含まれるステップは、 図1に示されている最初のステップは、遠心分離によって大きな死細胞を除去し、細胞破片を含む。その後の各工程から回収した上清から得られた最終ペレットは、タンパク質、RNA、およびDNAのさらなる抽出の分離溶液に溶解させたエキソソームに対応する。 尿の1.コレクション<...

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	<li>Miranda, K. C., Bond, D. T., McKee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acids+within+urinary+exosomes/microvesicles+are+potential+biomarkers+for+renal+disease.">Nucleic acids within urinary exosomes/microvesicles are potential biomarkers for renal disease.</a> Kidney Int. 78, 191-199 (2010).</li><li>Pisitkun, T., Shen, R. F., Knepper, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+proteomic+profiling+of+exosomes+in+human+urine.">Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101, 13368-13373 (2004).</li><li>Raj, D. A., Fiume, I., Capasso, G., Pocsfalvi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+quantitative+proteomics+strategy+for+protein+biomarker+studies+in+urinary+exosomes.">A multiplex quantitative proteomics strategy for protein biomarker studies in urinary exosomes.</a> Kidney Int. 81 (12), 1263-1273 (2012).</li><li>Pisitkun, T., Gandolfo, M. T., Das, S., Knepper, M. A., Bagnasco, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+systems+biology+principles+to+protein+biomarker+discovery:+urinary+exosomal+proteome+in+renal+transplantation.">Application of systems biology principles to protein biomarker discovery: urinary exosomal proteome in renal transplantation.</a> Proteomics Clin Appl. 6 (5-6), 268-278 (2012).</li><li>Gonzales, P. A., Zhou, H., Pisitkun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+purification+of+exosomes+in+urine.">Isolation and purification of exosomes in urine.</a> Methods Mol Biol. 641, 89-99 (2010).</li><li>Zhou, H., Yuen, P. S., Pisitkun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collection,+storage,+preservation,+and+normalization+of+human+urinary+exosomes+for+biomarker+discovery.">Collection, storage, preservation, and normalization of human urinary exosomes for biomarker discovery.</a> Kidney Int. 69, 1471-1476 (2006).</li><li>Thery, C., Amigorena, S., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Curr Prot Cell Biol. 43, 3.22.1-3.22.29 (2006).</li><li>Cheruvanky, A., Zhou, H., Pisitkun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator.">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 292, 1657-1661 (2007).</li><li>Gonzales, P. A., Pisitkun, T., Hoffert, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+proteomics+and+phosphoproteomics+of+urinary+exosomes.">Large-scale proteomics and phosphoproteomics of urinary exosomes.</a> J Am Soc Nephrol. 20, 363-379 (2009).</li><li>Rood, I. M., Deegens, J. K., Merchant, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+methods+for+isolation+of+urinary+microvesicles+to+identify+biomarkers+of+nephrotic+syndrome.">Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome.</a> Kidney Int. 78, 810-816 (2010).</li><li>Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+protein,+microRNA,+and+mRNA+yields+using+different+methods+of+urinary+exosome+isolation+for+the+discovery+of+kidney+disease+biomarkers.">Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers.</a> Kidney Int. Nov. 82 (9), 1024-1032 (2012).</li><li>Kang, S. W., Kim, Y. W., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+association+of+-667+aquaporin-2+(AQP-2)+A/G+promoter+polymorphism+with+the+incidence+and+clinical+course+of+chronic+kidney+disease+in+Korea.">Study of the association of -667 aquaporin-2 (AQP-2) A/G promoter polymorphism with the incidence and clinical course of chronic kidney disease in Korea.</a> Renal Fail. 29, 693-698 (2007).</li></ol>

尿からエキソソームの沈殿を含むほとんどのメソッドは、タム - ホースフォールタンパク質（THP）によって形成されたポリマーネットワークの除去に取り組んでいない。このタンパク質は、推定上のトラップが初期低速遠心分離中エキソソーム尿中に多量に存在する。私たちの修正された方法では、エキソソーム降水前にDTTを使用してTHPを減少させた。 図2に示すように、THPのよ...

尿中エキソソームは、miRNAの1のために濃縮されるように見える尿排水システムをライニング糸球体足細胞、尿細管細胞と細胞を含む尿空間での正常および病的条件下での全ての細胞型から派生多胞体（MVB）の100nmの小さな内部小胞である-2。多くの研究者が明確な健康な個体の尿から単離されたエキソソーム中のタンパク質だけでなく、腎臓および/ ​​または体系的疾患3-5のものを検出した。エキソソームは、超遠心8-9、または沈殿10-11にナノ膜フィルターを組み合わせ、スクロース6-7の有無にかかわらずそのような二段階の差動超遠心分離などの異なる方法を用いて単離することができる。我々は最近、尿中エキソソームを分離し、miRNAおよびタンパク質バイオマーカー11を検出するための、簡単、迅速、スケーラブルで効果的な方法を開発した。バイオマーカーは、異なる生物学的流体の様々な検出可能であるが、ウルナインは、比較的非侵襲的な方法で大量に得ることができるため、腎臓および尿路の疾患を有する患者のために最も便利な選択である。 尿中エキソソーム6-11を単離するためのいくつかの方法があるが、最も一般的に使用される手順は、30％ショ糖クッションで差超遠心分離に依存する。この方法は効率的であり、この手順を用いて単離し、得られたエキソソームの品質が高レベルである間は、技術自体は、熟練者を必要とし、時間がかかり、いくつかの超遠心分離工程を必要である。例えば濾過、沈殿などの他の方法は、独自の沈殿試薬を使用するものを含む、エキソソームの単離のために開発されている（ すなわち 、ExoQuick-TC：システムBiosciences社;マウンテンビュー、CA）。この試薬を用いて降水量は、高速かつ比較的容易であるが、分離エキソソームの純度は超遠心メタに比べて低いOD。我々は最近、我々の研究室で開発された11 ExoQuick-TCを使用して沈殿法の修正を含む尿中エキソソームの単離のための6つのメソッドを、比較した。我々は、この修正された沈殿法は、タンパク質に、miRNA、およびmRNAのより高い量を得た手順自体は速く、超遠心分離法よりも実装が簡単であることがわかった。ここでは、段階的に私たちの修正された沈殿法の実験的なプロトコルを記述し、エキソソーム単離の他の方法と比較して、この技術の利点と欠点の議論が含まれています。修正された沈殿法は、エキソソームのタンパク質と相関し、そして尿からエキソソーム収率が低下することが知られているタム - ホースフォールタンパク質を除去することによりエキソソーム粒子の初期析出を伴う。我々は、これらの修正が尿からエキソソーム調製物の収率および純度を増加させることを見出した。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="736">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:111px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:291px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Corning 15ml Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:111px;">Corning (Sigma Aldrich)</td>
			<td style="width:119px;">CLS430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:111px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:111px;">Sorvall</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DL-dithiothreitol</td>
			<td style="width:111px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9779</td>
			<td>used at final concentration of 200 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Novex NuPAGE SDS-PAGE system (4-12 % Bis-Tris Gel 1.0 mm, 10 well</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">NP0321BOX</td>
			<td>For SDS-PAGE analysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ECL Advance Western blotting detection kit</td>
			<td style="width:111px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">RPN2135</td>
			<td>For western blot detection of biomarkers</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Exoquick-TC Reagent</td>
			<td style="width:111px;">System Biosciences (SBI)</td>
			<td style="width:119px;">EXOTC50A-1</td>
			<td>For exosome isolation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Exosome CD9 ELISA Complete Kit</td>
			<td style="width:111px;">System Biosciences (SBI)</td>
			<td style="width:119px;">EXOEL-CD9-A-1</td>
			<td>For exosome quantification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">AllPrep DNA/RNA/Protein mini kit</td>
			<td style="width:111px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">80004</td>
			<td>For DNA, RNA, Protein isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rneasy MinElute Cleanup kit</td>
			<td style="width:111px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td style="width:111px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For Protein Quantification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ProteoSilver Sliver Stain Kit</td>
			<td style="width:111px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">PROTSIL1-1KT</td>
			<td>For staining SDS-PAGE gels</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Xcell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For running the SDS-PAGE gels</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan microRNA assays</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For RT-PCR assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">qBasePlus v1.5 software</td>
			<td style="width:111px;">Biogazelle NV</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For analysis of RT-PCR assay data</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rabbit polyclonal antibody to ALIX</td>
			<td style="width:111px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For western blot detection of biomarkers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mouse monoclonal antibody to TSG101</td>
			<td style="width:111px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For western blot detection of biomarkers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a modified precipitation method to isolate urinary exosomes

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. Urinary exosome vesicles, 40-100 nm in size, are released into the urine under normal conditions by cells from all nephron segments and may contain protein, mRNA and microRNA representative of their cell type of origin. Under conditions of renal dysfunction or injury, exosomes may contain altered proportions of these components, which may serve as biomarkers for disease. There are currently several methods available for isolation of urinary exosomes, and we have previously conducted an experimental comparison of each of these approaches, including three based on ultracentrifugation, one using a nanomembrane ultrafiltration concentrator, one using a commercial precipitation reagent and one using a modification of the precipitation technique using ExoQuick reagent that we developed in our laboratory. We found the modified precipitation method produced the highest yield of exosome particles, miRNA, and mRNA, making this approach suitable for the isolation of exosomes for subsequent RNA profiling. We conclude that the modified exosome precipitation method offers a quick, scalable, and effective alternative for the isolation of exosomes from urine. In this report, we describe our modified precipitation technique using ExoQuick reagent for isolating exosomes from human urine.

尿中エキソソームは、腎上皮細胞から分泌されるタンパク質に、miRNAとmRNAのバイオマーカーを運ぶ。これらのエキソソームの単離および検出は、糖尿病性腎症などの腎疾患の早期検出に有用な診断ツールを提供してもよい。ヒト被験者から採取した尿サンプルからエキソソームを単離するためのいくつかの方法がある。我々は以前、尿エキソソーム分離の6つのメソッドを比較し、タンパク質...

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A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes

尿中エキソソームを単離するために、修正沈殿法

This manuscript describes a protocol for isolating exosomes from human urine using a modified precipitation technique.

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. ...

Research

JoVE Journal

Medicine

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