Name: dissection of the transversus abdominis muscle for whole-mount neuromuscular junction analysis
Uploaded: 2014-01-11T14:00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الكندية للبحوث الصحية (منحة رقم MOP 38040) إلى R.K. ، وجمعية ضمور العضلات (الولايات المتحدة الأمريكية) إلى R.K. ، وأسر SMA إلى R.K. و L.M.M ، وSMA Trust إلى T.H.G. ، وحملة ضمور العضلات إلى T.H.G. L.M.M هو حاصل على زمالة التصلب المتعدد في كندا ما بعد الدكتوراه، وR.K. هو حاصل على كرسي البحوث الصحية الجامعية من جامعة أوتاوا.

وينبغي تنفيذ جميع الإجراءات وفقا لمعايير رعاية الحيوان التي تحددها المؤسسة.
1. تشريح عضلات البطن من الفأر
<ol><li>قبل البدء، يشكلون 4٪ بارافورمالديهايد (PFA). تنبيه: احتفظ دائما ب PFA داخل غطاء الدخان وارتد معدات الحماية المناسبة.</li>
	<li>القتل الرحيم الماوس بواسطة أسلوب معتمد. ملاحظة: الفأر الذي يظهر في الفيديو قتل رميا بالرصاص بجرعة زائدة منثاني أكسيد الكربون وخلع عنق الرحم. هذا الماوس هو فأر من النوع البري عمره 4 أسابيع على خلفية هجينة CD1/C57Bl6. تم تربية هذا الفأر في مرافق الحيوانات في جامعة أوتاوا من الفئران التي تم شراؤها في الأصل.</li>
	<li>إجراء شق الأولي من خلال الجلد على مستوى الورك وقطع من خلال الجلد على طول الطريق حول الماوس.</li>
	<li>قشر قبالة الجلد، وسحب صعودا حتى تصل إلى مستوى الأطراف الأمامية.</li>
	<li>قطع من خلال عضلات البطن على مستوى الورك ومواصلة شق حتى تصل إلى العمود الفقري.</li>
	<li>عند هذه النقطة، تبدأ في قطع صعودا من خلال العضلات والأضلاع حتى تصل إلى الطرف العلوي.</li>
	<li>قطع مباشرة عبر حتى تصل إلى العمود الفقري على الجانب الآخر.</li>
	<li>قطع لأسفل حتى تصل إلى النقطة التي بدأت.</li>
	<li>الإفراج عن الحجاب الحاجز من تحت (مع الحرص على عدم تلف العضلات TVA) ووضعه في الفوسفات المالحة المخزنة (PBS) في طبق تشريح SYLGARD المغلفة مع دبابيس تشريح 0.2 ملم.</li>
	<li>دبوس خارج القفص الصدري والعضلات المرتبطة بها في الطبق، الجانب السطحي حتى، والتأكد من أن العضلات امتدت تماما.</li>
	<li>صب قبالة برنامج تلفزيوني 1x واستبدالها مع 4٪ PFA.</li>
	<li>يغطى ويترك على منصة هزازة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.</li>
	<li>غسل 3x في برنامج تلفزيوني 1x في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.</li>
</ol>* عند هذه النقطة يمكن ترك العضلات الثابتة في الثلاجة بين عشية وضحاها قبل تشريح لاحقة.
2. عزل العضلات TVA
<ol><li>للشروع في عزل عضلة TVA ، تحت مجهر تشريح ، ابدأ بقطع العضلات المائلة الخارجية على مستوى الأضلاع القليلة الماضية (انظر الشكل 1 للحصول على دليل مشروح).</li>
	<li>قطع مباشرة إلى أسفل بجانب ألبا خط (مع الحرص على عدم قطع من خلال TVA أدناه) حتى تصل إلى بداية العضلات المائلة الداخلية.</li>
	<li>ثم قطع عبر للافراج عن abdominis المستقيم المفرط والعضلات المائلة الخارجية من الجزء العلوي من TVA أدناه.</li>
	<li>إزالة الأوعية الدموية وأي الدهون الزائدة من العضلات TVA.</li>
	<li>حرر العضلة من الضلع الأخير المفرط.</li>
	<li>قطع حول هوامش العضلات وإزالة إلى لوحة 24 جيدا تحتوي على برنامج تلفزيوني.</li>
</ol>3. وضع العلامات immunofluorescent ومجهر العضلات TVA
لجميع الخطوات اللاحقة، وإزالة السائل باستخدام ماصة غرامة يميل وترك لوحة على منصة هزاز. ما لم ينص على خلاف ذلك، يتم تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة في درجة حرارة الغرفة.
<ol><li>احتضان في برنامج تلفزيوني يحتوي على 1:1،000 bungarotoxin الموسومة الفلورسنت لمدة 30 دقيقة لتسمية NMJs. ويمكن القيام بذلك في غرفة مظلمة أو تحت احباط.</li>
	<li>Permeabilize العضلات بإضافة 300 ميكرولتر لكل بئر من 2٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني وترك على منصة هزاز لمدة 30 دقيقة.</li>
	<li>احتضان في حجب الكاشف (4٪ BSA، 1٪ تريتون في برنامج تلفزيوني) لمدة 30 دقيقة.</li>
	<li>احتضان في حجب الكاشف الذي يحتوي على الأجسام المضادة الأولية (neurofilament 1:100; بروتين الحويزل متشابك 2, 1:250) في 4 °C بين عشية وضحاها.</li>
	<li>غسل 3x في برنامج تلفزيوني 1x.</li>
	<li>احتضان في برنامج تلفزيوني يحتوي على 1:250 الأجسام المضادة الثانوية لمدة 2-4 ساعة.</li>
	<li>غسل 3x في برنامج تلفزيوني 1x.</li>
	<li>جبل العضلات على الشرائح الزجاجية باستخدام وسائل الإعلام تركيب الفلورسنت كافية و coverslip.</li>
	<li>يتم عرض الشرائح بشكل أفضل باستخدام فلتر تمرير النطاق المزدوج على المجهر القياسي.</li>
	<li>يتم تصوير NMJs بشكل أفضل باستخدام إسقاط سلسلة z على مجهر كونفوجال مجهز بهدف 40X على الأقل.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction.">Development of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Annu. Rev. Neurosci. 22, 389-442 (1999).</li><li>Dupuis, L., Loeffler, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+junction+destruction+during+amyotrophic+lateral+sclerosis:+insights+from+transgenic+models.">Neuromuscular junction destruction during amyotrophic lateral sclerosis: insights from transgenic models.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 9, 341-346 (2009).</li><li>Murray, L. M., Talbot, K., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+neuromuscular+synaptic+vulnerability+in+motor+neurone+disease:+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+spinal+muscular+atrophy.">Review: neuromuscular synaptic vulnerability in motor neurone disease: amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy.</a> Neuropathol. Appl. Neurobiol. 36, 133-156 (2010).</li><li>Murray, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+vulnerability+of+motor+neurons+and+dissociation+of+pre-+and+post-synaptic+pathology+at+the+neuromuscular+junction+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy.">Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 17, 949-962 (2008).</li><li>Kariya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+SMN+protein+impairs+maturation+of+the+neuromuscular+junctions+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy.">Reduced SMN protein impairs maturation of the neuromuscular junctions in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 17, 2552-2569 (2008).</li><li>Iguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+TDP-43+causes+age-dependent+progressive+motor+neuron+degeneration.">Loss of TDP-43 causes age-dependent progressive motor neuron degeneration.</a> Brain. 136, 1371-1382 (2013).</li><li>Martinez-Hernandez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+defects+in+type+I+spinal+muscular+atrophy+in+human+development.">Synaptic defects in type I spinal muscular atrophy in human development.</a> J. Pathol. 229, 49-61 (2013).</li><li>Fischer, L. R., Li, Y., Asress, S. A., Jones, D. P., Glass, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+SOD1+leads+to+oxidative+stress+in+peripheral+nerve+and+causes+a+progressive+distal+motor+axonopathy.">Absence of SOD1 leads to oxidative stress in peripheral nerve and causes a progressive distal motor axonopathy.</a> Exp. Neurol. 233, 163-171 (2012).</li><li>Cifuentes-Diaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofilament+accumulation+at+the+motor+endplate+and+lack+of+axonal+sprouting+in+a+spinal+muscular+atrophy+mouse+model.">Neurofilament accumulation at the motor endplate and lack of axonal sprouting in a spinal muscular atrophy mouse model.</a> Hum. Mol. Genet. 11, 1439-1447 (2002).</li><li>Fischer, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+lateral+sclerosis+is+a+distal+axonopathy:+evidence+in+mice+and+man.">Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: evidence in mice and man.</a> Exp. Neurol.. 185, 232-240 (2004).</li><li>Diers, A., Kaczinski, M., Grohmann, K., Hubner, C., Stoltenburg-Didinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ultrastructure+of+peripheral+nerve,+motor+end-plate+and+skeletal+muscle+in+patients+suffering+from+spinal+muscular+atrophy+with+respiratory+distress+type+1+(SMARD1).">The ultrastructure of peripheral nerve, motor end-plate and skeletal muscle in patients suffering from spinal muscular atrophy with respiratory distress type 1 (SMARD1).</a> Acta Neuropathol. 110, 289-297 (2005).</li><li>Ang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+axonal+sprouting+and+neuromuscular+junction+loss+in+an+animal+model+of+Charcot-Marie-Tooth+disease.">Motor axonal sprouting and neuromuscular junction loss in an animal model of Charcot-Marie-Tooth disease.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 69, 281-293 (2010).</li><li>Simon, C. M., Jablonka, S., Ruiz, R., Tabares, L., Sendtner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+neurotrophic+factor-induced+sprouting+preserves+motor+function+in+a+mouse+model+of+mild+spinal+muscular+atrophy.">Ciliary neurotrophic factor-induced sprouting preserves motor function in a mouse model of mild spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 19, 973-986 (2010).</li><li>Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+mouse+cranial+muscles+to+investigate+neuromuscular+pathology+in+vivo.">Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo.</a> Neuromuscul. Disord. 20, 740-743 (2010).</li><li>Brill, M. S., Marinkovic, P., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+photo-bleaching+to+delineate+single+Schwann+cells+at+the+neuromuscular+junction.">Sequential photo-bleaching to delineate single Schwann cells at the neuromuscular junction.</a> J. Vis. Exp. (4460), (2013).</li><li>Murray, L. M., Thomson, D., Conklin, A., Wishart, T. M., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+translation+elongation+factor+(eEF1A2)+expression+in+vivo+differentiates+between+Wallerian+degeneration+and+dying-back+neuronal+pathology.">Loss of translation elongation factor (eEF1A2) expression in vivo differentiates between Wallerian degeneration and dying-back neuronal pathology.</a> J. Anat. 213, 633-645 (2008).</li><li>Bowerman, M., Murray, L. M., Beauvais, A., Pinheiro, B., Kothary, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+smn+threshold+in+mice+dictates+onset+of+an+intermediate+spinal+muscular+atrophy+phenotype+associated+with+a+distinct+neuromuscular+junction+pathology.">A critical smn threshold in mice dictates onset of an intermediate spinal muscular atrophy phenotype associated with a distinct neuromuscular junction pathology.</a> Neuromuscul. Disord. 22, 263-276 (2012).</li><li>Comley, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ApoE+isoform-specific+regulation+of+regeneration+in+the+peripheral+nervous+system.">ApoE isoform-specific regulation of regeneration in the peripheral nervous system.</a> Hum. Mol. Genet. 20, 2406-2421 (2011).</li><li>Wright, M., Kim, A., Son, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcutaneous+administration+of+muscarinic+antagonists+and+triple-immunostaining+of+the+levator+auris+longus+muscle+in+mice.">Subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice.</a> J. Vis. Exp. (55), (2011).</li><li>Ling, K. K., Gibbs, R. M., Feng, Z., Ko, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+neuromuscular+denervation+of+clinically+relevant+muscles+in+a+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy.">Severe neuromuscular denervation of clinically relevant muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 21, 185-195 (2012).</li></ol>

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

في هذا الفيديو، قمنا بتفصيل بروتوكول لتشريح عضلة TVA من الماوس ووضع العلامات المناعية الكاملة ل NMJs داخل العضلات. كما نقدم بيانات تظهر أن هذه العضلة يمكن استخدامها لتحليل أمراض التقاطع العصبي العضلي في نموذج الماوس من SMA.
يعتمد النجاح في هذه التقنية على عدد من العوامل. وفيما يلي بعض المشاكل الأكثر شيوعا. أولا: ضعف التلطيخ المناعي الكيميائي. يمكن أن يكون هناك عدد من الأسباب لذلك، واحدة من أكثر شيوعا هو استخدام الكواشف المختلفة لتلك المذكورة في هذا البروتوكول. من المهم جدا أن يكون الفحص المجهري الإلكتروني عالي الجودة PFA مهما جدا لضمان تلطيخ جيد ، وكذلك اختيار الأجسام المضادة المدرجة في هذا البروتوكول. بالإضافة إلى ذلك ، في الحيوانات القديمة(أي> 3 أشهر) ، يمكن أن يكون الحصول على تلطيخ ذات نوعية جيدة أكثر صعوبة. وذلك بسبب زيادة سمك اللفافة المحيطة العضلات وزيادة في تراكم الدهون بين المائل الخارجي وdbdominis tranversus. من المهم تجريد الدهون، قبل الشروع في immunofluorescence. قد يكون من الضروري أيضا لتجريد قبالة بعض اللفافة التي تغطي العضلات، والتي يمكن أن تصبح سميكة. من الصعب في بعض الأحيان تجريد اللفافة والدهون من العضلات دون تكبد بعض الأضرار التي لحقت ألياف العضلات وتعطيل نمط التعصيب. ولكن إذا تم تنفيذ هذه التقنية بعناية ، يمكن الحصول على تلطيخ ذات نوعية جيدة من الفئران حتى 1 سنة على الأقل من العمر. في الفئران الأصغر سنا(أيأقل من 3 أشهر من العمر) لا ينبغي أن يكون من الضروري إجراء أي إغاظة أو فصل ألياف العضلات. ثانيا: صعوبة في العثور على NMJs بعد تشريح وتلطيخ. هذا غالبا لأن تشريح لم تمتد تحت الضلع الأخير. وتقع غالبية NMJs فقط تحت الضلع الأخير، وبالتالي يجب توخي الحذر لضمان إدراج هذا الجزء من العضلات في تشريح. ثالثا: التزام عضلة EO بعضلات TVA. غالبا ما تكون هذه شكوى عندما يحاول الأفراد تمديد التشريح إلى ما دون مستوى العضلة المائلة الداخلية (IO). منطقة العضلات TVA حيث IO موجود أيضا هو أكثر صعوبة لتحليل كما يمكن أن يكون من الصعب التمييز بين العضلات التي هي. لهذا السبب، ونحن بشكل روتيني مجرد تشريح الجزء الأكثر تفوقا من العضلات TVA. وعلى هذا المستوى، لا يوجد أي التزام بين عضلات منظمة أصحاب العمل وقوة التلفزيون، وبالتالي لا ينبغي أن يكون ذلك مشكلة كبيرة.
أحد العوائق الهامة لاستخدام عضلة TVA ، مقارنة بالعضلات الزائدة الدودية ، هو إمكانية الوصول إما للتلاعب الجراحي أو حقن المواد. يمكن أن تكون هذه الأنواع من التجارب حاسمة للتحقيق في فسيولوجيا NMJ في عضلة معينة. على الرغم من أن TVA هو بالتأكيد أقل سهولة الوصول إليها من العضلات الأكثر شيوعا مثل الساق الأمامي أو gastrocnemius, وقد أظهرت الأعمال السابقة أنه من الممكن ل denervate TVA عن طريق الإصابة الجراحية للأعصاب الوربي18. وقد استخدمنا مؤخرا أيضا هذه العضلة للإدارة المحلية للمواد تحت التخدير العام (بيانات غير منشورة). على الرغم من أن هذه التجارب يمكن أن تمثل تحديا تقنيا معتدلا، وهذا العمل يدل على أنها ممكنة وبالتالي توسيع فائدة هذه العضلة لتحليل NMJs تحت كل من التلاعب المرضي والفسيولوجي.
العضلات TVA هي واحدة من عدد من العضلات المسطحة رقيقة تقع في جميع أنحاء الجسم التي يمكن استخدامها لتحليل كامل جبل من أنماط ال الداخلي. وتشمل العضلات الأخرى مجموعة من العضلات القحفية التي تقحمها الخلايا العصبية الحركية الناشئة من نواة الوجه في جذع الدماغ ، وتشمل ليفاتور أوريس لونغوس، متفوقة المسالك ، وuctor auris longus، التشريحات التي تم وصفها سابقا14،19. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا تسمية العضلات المحيطة عضلة TVA، بما في ذلك EO، IO، و rectus abdominis،واستخدامها لتحليل NMJ. للتحليل الشامل لأمراض NMJ في نموذج الماوس ، من المهم النظر في عدد من العضلات الموجودة في جميع أنحاء الجسم وعدم تقييد التحليل إلى عضلة واحدة. ويتجلى هذا في نماذج الماوس من أمراض الخلايا العصبية الحركية حيث يوجد عدم تجانس كبير في مستويات أمراض NMJ بين عضلات مختلفة20. مثل هذا التباين العضلي هو أداة قيمة للغاية عند التحقيق في آلية ضعف الخلايا العصبية الحركية وبالتالي تقييد التحليل إلى عضلة واحدة يمكن أن يقلل بشكل كبير من إمكانات البحث.

تقاطعات العصبية والعضلية (NMJs) هي اتصال متشابك بين الخلايا العصبية الحركية السفلية وألياف العضلات الهيكل العظمي. وهي تعتبر تقليديا المشبك الثلاثي, تتكون من الخلايا العصبية (محطة presynaptic), الألياف العضلية (محطة ما بعد متشابك), ومحطة شوانالخلية 1. NMJs ويبدو أن الأهداف المبكرة والكبيرة في علم الأمراض في مجموعة من أمراض الخلايا العصبية الحركية ونماذج الماوس2,3. وتشمل الأعراض النموذجية denervation, حيث يصبح نهاية المحرك خالية من التعصيب presynaptic, تورم في محطة presynaptic, وانخفاض في تعقيد مورفولوجيا NMJ4-11. ويمكن أيضا أن يلاحظ الاستجابات التعويضية، والتي تشمل محطة ونودال تنبت، حيث تمتد العمليات المحورية من المحطات متشابك المتبقية أو internodes إلى لوحات النهاية denervated إعادة تنشيط12،13. نظرا للارتباط الوثيق بين النشاط المتشابك ومورفولوجيا NMJ ، يمكن الحصول على قدر كبير من المعلومات حول الحالة الوظيفية للخلايا العصبية الحركية من تحليل مورفولوجيا NMJ. كما فقدان NMJs يمثل في كثير من الأحيان واحدة من الجوانب الأولى من علم الأمراض العصبية والعضلية4,10, يمكن أن يعطي القياس الكمي على مستوى التدخيل معلومات هامة حول تطور علم الأمراض والتأثير المحتمل للتدخل العلاجي. وعلاوة على ذلك، كما فقدان NMJ يمثل خطوة هامة في التقدم المرضي، وتطوير العلاجات التي يمكن أن استقرار الاتصالات وتشجيع التجديد قد تسفر عن فائدة كبيرة.
عند تحليل مورفولوجيا NMJ ، فإن اختيار العضلات له أهمية كبيرة. قد تتضمن بعض الاعتبارات الأولية نوع ألياف العضلات، ووضع الجسم، والتحليل المقارن للظروف البشرية. وبالإضافة إلى ذلك، عندما تكون هناك حاجة إلى تلاعب مثل حقن المواد أو إصابات الأعصاب الرضية، من المهم أيضا النظر في إمكانية الوصول التجريبي. بشكل عام، فمن الأفضل لتحليل مجموعة من العضلات المتمركزة في جميع أنحاء الجسم مما يعكس مجموعة من الأنواع الفرعية وحدة المحرك. في كثير من الأحيان، ومع ذلك، يتأثر اختيار العضلات من سهولة تشريح. وبالتالي، غالبا ما يتم إجراء تحليل NMJ حصرا على العضلات الزائدة الدودية الكبيرة مثل gastrocnemius. للحصول على تلطيخ NMJ جيدة في مثل هذه العضلات، والقسم أو تعطيل ميكانيكي من ألياف العضلات وغالبا ما تكون هناك حاجة. ونتيجة لذلك، قد يصبح نمط التعصيب معطلا وغالبا ما يتعرض تحليل شامل وعالي الجودة لأنماط التعصيب وتنتشر وتنبت. نهج بديل هو استخدام العضلات المسطحة رقيقة التي لا تتطلب تقسيم ويمكن أن تكون ملطخة وشنت سليمة، مما يسمح لمحة شاملة عن ال داخل العضلات بأكملها. هناك عدد من العضلات التي يمكن استخدامها لمثل هذا التحليل، بما في ذلك مجموعة من العضلات القحفية، (تشمل levator أوريس لونغوس، العورة متفوقة، وauris أوريس لونغوس adductor)14، عضلات الصدر (على سبيل المثال. الثلاثي ستيرني) 15, والبطن (على سبيل المثال، عرضية abdominis (TVA)) العضلات. العائق الرئيسي في استخدام هذه العضلات هو الخبرة التقنية اللازمة لتشريحها دون ضرر.
في هذا الفيديو، ونحن نقدم بروتوكولا لتشريح وأداء وضع العلامات immunofluorescent من العضلات TVA من الماوس للسماح بتحليل شامل لنمط ال الداخلي ومورفولوجيا NMJ. عضلة TVA هي عضلة ارتعاش بطيئة في الغالب تتألف من أعمق طبقة من عضلات البطن ويتم تنشيطها من قبل الأعصاب الوربية السفلية. وقد أظهرت الأعمال السابقة أن تكون باستمرار عرضة للغاية لعلم الأمراض في عدد من نماذج الماوس من مرض الخلايا العصبية الحركية في مرحلة الطفولة ضمور العضلات الشوكي (SMA) وفي نماذج الماوس الأخرى من انحطاط الخلايا العصبية الحركية بداية مبكرة4,16. لذلك نقترح أن TVA هو عضلة مفيدة لإجراء تحليل NMJ في الأمراض العصبية الطرفية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="958">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Paraformaldehyde Aqueous Solution (16% )</td>
			<td style="width:259px;">Electron Micropscopy Sciences</td>
			<td style="width:216px;">15700</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td style="width:259px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Angled Sprung Scissors</td>
			<td style="width:259px;">Fine Science Tools</td>
			<td>15006-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Fine Scissors - ToughCut</td>
			<td style="width:259px;">Fine Science Tools</td>
			<td>14058-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:259px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:216px;">dependant on local supplier</td>
			<td>Use this to make dissection dish for pinning out muscle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Minutien Pins</td>
			<td style="width:259px;">Fine science tools</td>
			<td>26002-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">&#945;-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:216px;">B-13422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Albumin from Bovine Serum</td>
			<td style="width:259px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:216px;">A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:316px;">Neurofilament Primary antibody (2H3), Supernatant</td>
			<td style="width:259px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:316px;">SV2 Primary antibody (SV2), Supernatant</td>
			<td style="width:259px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td style="width:259px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-166-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td style="width:259px;">Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Slides (Superfrost Plus; White)</td>
			<td style="width:259px;">Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Coverslips</td>
			<td style="width:259px;">Fisher</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:259px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:216px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">CD1/C57Bl6 mouse</td>
			<td style="width:259px;">Jackson Labs</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of the transversus abdominis muscle for whole-mount neuromuscular junction analysis

تحليل مورفولوجيا تقاطع العصبية والعضلية يمكن أن تعطي فكرة هامة في الحالة الفسيولوجية للخلية العصبية الحركية معينة. تحليل العضلات المسطحة رقيقة يمكن أن تقدم ميزة كبيرة على العضلات المستخدمة تقليديا سمكا, مثل تلك التي من الطرف الخلفي (على سبيل المثال. الجهاز الهضمي). تسمح العضلات الرقيقة بنظرة عامة شاملة على نمط ال الداخلي بأكمله لعضلات معينة ، مما يسمح بدوره بتحديد برك ضعيفة بشكل انتقائي من الخلايا العصبية الحركية. تسمح هذه العضلات أيضا بتحليل المعلمات مثل حجم وحدة المحرك ، والمتفرعة المحورية ، والنهاية / العقدية تنبت. وثمة عقبة شائعة في استخدام هذه العضلات هو اكتساب الخبرة التقنية لتشريح لهم. في هذا الفيديو، نقوم بتفصيل بروتوكول تشريح عضلة abdominis (TVA) العرضية من الفئران الصغيرة وأداء الفلورسينس المناعي لتصور المحاور والتقاطعات العصبية العضلية (NMJs). ونحن نثبت أن هذه التقنية يعطي لمحة كاملة عن نمط ال الداخلي للعضلات TVA ويمكن استخدامها للتحقيق في علم الأمراض NMJ في نموذج الماوس من مرض الخلايا العصبية الحركية في مرحلة الطفولة, ضمور العضلات الشوكي.

يوجه البروتوكول أعلاه عزل وتلطيخ عضلة TVA لتحليل NMJ. وهذا يسمح تحليل كامل جبل من أنماط العضلات الداخلية وكذلك تحليل عالية الدقة من مورفولوجيا NMJ (الشكل 2). يمكن تطبيق هذه التقنية بنجاح للكشف عن أمراض NMJ في نماذج الماوس لمرض الخلايا العصبية الحركية ، مثل SMA4،17(الشكل 3). في نماذج الماوس من SMA هناك تباين عضلي كبير في علم الأمراض ، ولكن عضلة TVA تتأثر بشكل كبير باستمرار. ويتضح ذلك من قبل denervation من لوحات نهاية المحرك، وتراكم الخيوط العصبية في محطة presynaptic ومحطة تنبت (الشكل 3). النتائج المعروضة هنا وبالتالي تبين أن هذه التقنية المذكورة أعلاه يمكن أن تكون طريقة قوية لتقديم نظرة شاملة على التعصيب وتحليل علم الأمراض NMJ في نماذج الماوس.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51162/51162fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51162/51162fig1.jpg" width="600px"> الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 نظرة عامة على عضلات البطن من الماوس. (أ) صورة تظهر القفص الصدري مع العضلات البطن المرفقة، والتي تم إزالتها من الماوس القتل الرحيم مؤخرا وعلقت في طبق تشريح الجانب السطحي حتى (A). (ب)وقد تم شرح تشريح في A لوضع علامة على الحدود التقريبية لعضلات البطن. يمكن رؤية عضلات البطن السطحية على الجانب الأيسر من التشريح ، وتشمل مائل خارجي (موضح باللون الأزرق) و rectus abdominis (موضح باللون الأحمر). على الجانب الأيمن من تشريح, وقد أزيلت العضلات السطحية يسمح التصور من العضلات abdominis عرضية (المبينة باللون الأخضر) والعضلات المائلة الداخلية (المبينة باللون الأصفر). الهدف من هذا البروتوكول هو توجيه تشريح الجزء المتفوق من عضلة TVA ، كما هو موضح هنا كمثلث أخضر صلب. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51162/51162fig1highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض صورة أكبر</a>.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51162/51162fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51162/51162fig2.jpg" width="600px"> الشكل 2 - الأرقام 2- الأرقام التي تم كامل جبل نظرة عامة على تقاطعات العصبية والعضلية في العضلات TVA. صور تظهر المثال NMJs من عضلة TVA تصور مع تلطيخ immunofluorescent للنسيج العصبي (NF; الأخضر), بروتين الحويسن متشابك 2 (SV2; الأخضر) وbungarotoxin (BTX; أحمر). الصور هي صور مجهرية فلورية مونتاجية تظهر العضلات بأكملها (A) أو صور كونفوجال تظهر مجموعات (B) أو فردية (C) NMJs. شريط المقياس = 800 ميكرومتر (A) ، 70 ميكرومتر (B) ، 25 ميكرومتر (C). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51162/51162fig2highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض صورة أكبر</a>.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51162/51162fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51162/51162fig3.jpg" width="600px"> الشكل 3 - الأرقام 3- الأرقام التي يمكن أن علم الأمراض تقاطع العصبية والعضلية في العضلات TVA من نموذج الماوس من SMA. ميكروجرافات Confocal تظهر NMJs من عضلة TVA تصور مع تلطيخ immunofluorescent لn neurofilament (NF؛ الأخضر)، بروتين الحويزل متشابك 2 (SV2؛ الأخضر) وbungarotoxin (BTX؛ الأحمر) من أي من التحكم(Smn2B/+) أو نموذج الماوس SMA(Smn2B/-). لاحظ أنه في حين يمكن ملاحظة مورفولوجيا NMJ العادية في فئران التحكم ، في عضلات TVA من Smn2B / - الفئران هناك أدلة على denervation الكامل (رأس السهم الأبيض) ، والحرمان الجزئي (رأس السهم الأرجواني) محطة تنبت (رأس السهم الأزرق) وتورم presynaptic (رأس السهم الأصفر). لوحات النهاية ما بعد متشابك هي أيضا أقل تعقيدا مما يعكس النمط الظاهري أقل نضجا على ما يبدو. شريط المقياس = 50 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51162/51162fig3highres.jpg" target="_blank">ميكرومتر.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis at JoVE.com

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

في هذا الفيديو نظهر بروتوكولا لتشريح العضلات abdominis عرضية من الماوس واستخدام immunofluorescence والمجهر لتصور تقاطعات العصبية والعضلية.

تشريح العضلات Abdominis المستعرض لتحليل تقاطع العصبية والعضلية جبل كامل

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

تشريح العين ماوس لجبل الجامعة للصبغات الظهارة الشبكية

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

تشريح والتصوير من المناطق النشطة في ذبابة الفاكهة الوصل العصبي العضلي

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

استنساخه سحق الفأر العصب الوركي وتقييم لاحق للتجديد من قبل الجامعة جبل تحليل العضلات

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

صور متتابعة تبيض لتحديد خلايا شوان واحدة عند تقاطع الاعصاب

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

كله من جبل Immunolabeling الشم مستقبلات الخلايا العصبية في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الهوائي

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

جبل كله تشريح والمناعي من الكبار ماوس القوقعة

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

لماذا الكمي المسائل: توصيف الظواهر في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; اليرقات عصبي عضلي مفرق

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

وبسيطة خطوة واحدة بروتوكول تشريح لجبل لالجامع إعداد الكبار<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; أدمغة

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

قياس الأداء الوظيفي الوصلات العصبية العضلية

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

تسجيلات ماكروباتش المحورية للتيارات متشابك من الوصلات العصبية العضلية اليرقات المورفولوجية

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...