Name: dissection of the transversus abdominis muscle for whole-mount neuromuscular junction analysis
Uploaded: 2014-01-11T14:00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis at JoVE.com

इस काम को कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थानों (अनुदान संख्या एमओपी 38040) से आरके, मस्कुलर डिस्ट्रॉफी एसोसिएशन (यूएसए) से आरके, एसएमए के परिवारों को आरके और एल.M.M, एसटीएचजी को एसएमए ट्रस्ट और टीएचजी को मस्कुलर डिस्ट्रॉफी अभियान से अनुदान प्राप्त था। एल.M.M कनाडा पोस्टडॉक्टोरल फैलोशिप के एक मल्टीपल स्क्लेरोसिस सोसायटी के एक प्राप्तकर्ता है, और आरके ओटावा विश्वविद्यालय से एक विश्वविद्यालय के स्वास्थ्य अनुसंधान कुर्सी के एक प्राप्तकर्ता है ।

सभी प्रक्रियाओं को संस्था द्वारा निर्धारित पशु देखभाल मानकों के लिए किया जाना चाहिए ।
1. माउस से पेट की मांसपेशी का विच्छेदन
<ol><li>शुरू करने से पहले, 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) बनाएं। सावधानी: हमेशा एक धुएं हुड के भीतर पीएफए रखें और उचित सुरक्षा उपकरण पहनें।</li>
	<li>एक अनुमोदित विधि से माउस को इच्छामृत्यु। नोट: वीडियो में दिखाए गए माउस को सीओ2 और सर्वाइकल डिस्लोकेशन के ओवरडोज से इच्छामृत्यु दी गई थी । यह माउस एक CD1/C57Bl6 हाइब्रिड पृष्ठभूमि पर एक 4 सप्ताह पुराना जंगली प्रकार का माउस है । यह माउस मूल रूप से खरीदे गए चूहों से ओटावा विश्वविद्यालय में पशु सुविधाओं में पैदा हुआ था।</li>
	<li>कूल्हे के स्तर पर त्वचा के माध्यम से एक प्रारंभिक चीरा बनाओ और माउस के चारों ओर सभी तरह से त्वचा के माध्यम से काट दिया।</li>
	<li>त्वचा को छीलें, ऊपर की ओर खींच जब तक आप अग्रभाग के स्तर तक पहुंचने।</li>
	<li>कूल्हे के स्तर पर पेट की मांसपेशी के माध्यम से काटें और चीरा जारी रखें जब तक आप कशेरुकी स्तंभ तक नहीं पहुंच जाते।</li>
	<li>इस बिंदु पर, मांसपेशियों और पसलियों के माध्यम से ऊपर की ओर काटना शुरू करें जब तक आप ऊपरी अंग तक नहीं पहुंच जाते हैं।</li>
	<li>जब तक आप दूसरी तरफ कशेरुकी कॉलम तक नहीं पहुंच जाते तब तक सीधे काट लें।</li>
	<li>जब तक आप उस बिंदु तक नहीं पहुंच जाते, जिस पर आपने शुरुआत की थी तब तक नीचे की ओर काटें।</li>
	<li>डायाफ्राम को नीचे से छोड़ें (टीवीए मांसपेशियों को नुकसान न पहुंचाने का ध्यान रखना) और इसे 0.2 मिमी विच्छेदन पिन के साथ एक सिलगार्ड-लेपित विच्छेदन पकवान में फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) में रखें।</li>
	<li>बाहर रिब पिंजरे और पकवान में जुड़े मांसपेशी पिन, सतही पक्ष ऊपर, यकीन है कि मांसपेशियों को पूरी तरह से बाहर फैला है बना ।</li>
	<li>1x पीबीएस बंद डालो और 4% पीएफए के साथ बदलें।</li>
	<li>कवर और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक कमाल के मंच पर छोड़ दें ।</li>
	<li>10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 1x PBS में 3x धोएं ।</li>
</ol>* इस बिंदु पर निश्चित मांसपेशियों को बाद में विच्छेदन से पहले रात भर फ्रिज में छोड़ा जा सकता है।
2. टीवीए मांसपेशी का अलगाव
<ol><li>एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत टीवीए मांसपेशियों के अलगाव के साथ आगे बढ़ने के लिए, पिछले कुछ पसलियों के स्तर पर बाहरी तिरछी मांसपेशियों के माध्यम से काटने से शुरू करें (एक एनोटेटेड गाइड के लिए चित्रा 1 देखें)।</li>
	<li>सीधे लिना अल्बा के बगल में नीचे कट (देखभाल करने के लिए नीचे TVA के माध्यम से कटौती नहीं) जब तक आप आंतरिक तिरछी मांसपेशियों की शुरुआत तक पहुंचने ।</li>
	<li>फिर नीचे टीवीए के ऊपरी हिस्से से ओवरलाइंग रेक्टस एब्डोमिनिस और बाहरी तिरछी मांसपेशियों को छोड़ने के लिए पार काटें।</li>
	<li>टीवीए की मांसपेशियों से रक्त वाहिका और किसी भी ओवरलाइंग फैट को हटा दें।</li>
	<li>अतिकारण अंतिम पसली से मांसपेशियों को रिहा करें।</li>
	<li>मांसपेशियों के हाशिए के चारों ओर काटें और पीबीएस युक्त 24-अच्छी प्लेट को हटा दें।</li>
</ol>3. इम्यूनोफ्लोरेसेंट लेबलिंग और टीवीए मांसपेशी की माइक्रोस्कोपी
बाद के सभी चरणों के लिए, एक ठीक इत्तला दे दी पिपेट का उपयोग कर तरल को हटा दें और प्लेट को एक कमाल के मंच पर छोड़ दें। जब तक अन्यथा नहीं कहा जाता है, तब तक कमरे के तापमान पर बाद के सभी कदम किए जाते हैं।
<ol><li>1:1,000 फ्लोरोसेंटी वाले पीबीएस में इनक्यूबेट ने एनएमजेएस को लेबल करने के लिए 30 मिनट के लिए बुंगारोटॉक्सिन को टैग किया। यह एक अंधेरे कमरे में या पन्नी के नीचे किया जा सकता है।</li>
	<li>पीबीएस में 2% ट्राइटन एक्स-100 के प्रति कुएं 300 माइक्रोन जोड़कर मांसपेशियों को पार करें और 30 मिनट के लिए एक कमाल के मंच पर छोड़ दें।</li>
	<li>30 मिनट के लिए रिएजेंट (4% बीएसए, पीबीएस में 1% ट्राइटन) को अवरुद्ध करने में इनक्यूबेट।</li>
	<li>रात 4 डिग्री सेल्सियस पर प्राथमिक एंटीबॉडी (न्यूरोफिलामेंट 1:100; सिनैप्टिक वेसिकल प्रोटीन 2, 1:250) युक्त रिएजेंट को अवरुद्ध करने में इनक्यूबेट।</li>
	<li>1x पीबीएस में 3x धोएं।</li>
	<li>पीबीएस में 2-4 घंटे के लिए 1:250 माध्यमिक एंटीबॉडी युक्त इनक्यूबेट।</li>
	<li>1x पीबीएस में 3x धोएं।</li>
	<li>पर्याप्त फ्लोरोसेंट बढ़ते मीडिया और कवरस्लिप का उपयोग करके ग्लास स्लाइड पर मांसपेशियों को माउंट करें।</li>
	<li>स्लाइड्स को एक मानक एपिफ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर डबल बैंड पास फ़िल्टर का उपयोग करके सबसे अच्छा देखा जाता है।</li>
	<li>एनएमजेएस कम से कम 40X उद्देश्य से लैस कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर जेड-सीरीज प्रक्षेपण का उपयोग करके सबसे अच्छी छवि है।</li>
</ol>

<ol>
	<li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction.">Development of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Annu. Rev. Neurosci. 22, 389-442 (1999).</li><li>Dupuis, L., Loeffler, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+junction+destruction+during+amyotrophic+lateral+sclerosis:+insights+from+transgenic+models.">Neuromuscular junction destruction during amyotrophic lateral sclerosis: insights from transgenic models.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 9, 341-346 (2009).</li><li>Murray, L. M., Talbot, K., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+neuromuscular+synaptic+vulnerability+in+motor+neurone+disease:+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+spinal+muscular+atrophy.">Review: neuromuscular synaptic vulnerability in motor neurone disease: amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy.</a> Neuropathol. Appl. Neurobiol. 36, 133-156 (2010).</li><li>Murray, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+vulnerability+of+motor+neurons+and+dissociation+of+pre-+and+post-synaptic+pathology+at+the+neuromuscular+junction+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy.">Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 17, 949-962 (2008).</li><li>Kariya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+SMN+protein+impairs+maturation+of+the+neuromuscular+junctions+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy.">Reduced SMN protein impairs maturation of the neuromuscular junctions in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 17, 2552-2569 (2008).</li><li>Iguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+TDP-43+causes+age-dependent+progressive+motor+neuron+degeneration.">Loss of TDP-43 causes age-dependent progressive motor neuron degeneration.</a> Brain. 136, 1371-1382 (2013).</li><li>Martinez-Hernandez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+defects+in+type+I+spinal+muscular+atrophy+in+human+development.">Synaptic defects in type I spinal muscular atrophy in human development.</a> J. Pathol. 229, 49-61 (2013).</li><li>Fischer, L. R., Li, Y., Asress, S. A., Jones, D. P., Glass, J. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+lateral+sclerosis+is+a+distal+axonopathy:+evidence+in+mice+and+man.">Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: evidence in mice and man.</a> Exp. Neurol.. 185, 232-240 (2004).</li><li>Diers, A., Kaczinski, M., Grohmann, K., Hubner, C., Stoltenburg-Didinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ultrastructure+of+peripheral+nerve,+motor+end-plate+and+skeletal+muscle+in+patients+suffering+from+spinal+muscular+atrophy+with+respiratory+distress+type+1+(SMARD1).">The ultrastructure of peripheral nerve, motor end-plate and skeletal muscle in patients suffering from spinal muscular atrophy with respiratory distress type 1 (SMARD1).</a> Acta Neuropathol. 110, 289-297 (2005).</li><li>Ang, E. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+translation+elongation+factor+(eEF1A2)+expression+in+vivo+differentiates+between+Wallerian+degeneration+and+dying-back+neuronal+pathology.">Loss of translation elongation factor (eEF1A2) expression in vivo differentiates between Wallerian degeneration and dying-back neuronal pathology.</a> J. Anat. 213, 633-645 (2008).</li><li>Bowerman, M., Murray, L. M., Beauvais, A., Pinheiro, B., Kothary, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+smn+threshold+in+mice+dictates+onset+of+an+intermediate+spinal+muscular+atrophy+phenotype+associated+with+a+distinct+neuromuscular+junction+pathology.">A critical smn threshold in mice dictates onset of an intermediate spinal muscular atrophy phenotype associated with a distinct neuromuscular junction pathology.</a> Neuromuscul. Disord. 22, 263-276 (2012).</li><li>Comley, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ApoE+isoform-specific+regulation+of+regeneration+in+the+peripheral+nervous+system.">ApoE isoform-specific regulation of regeneration in the peripheral nervous system.</a> Hum. Mol. 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लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

इस वीडियो में, हम माउस से TVA मांसपेशी के विच्छेदन के लिए और मांसपेशियों के भीतर एनएमजेएस के पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोर्सेंट लेबलिंग के लिए एक प्रोटोकॉल विस्तृत है । हम इस मांसपेशी को दिखाने वाले डेटा को भी पेश करते हैं, इसका उपयोग एसएमए के माउस मॉडल में न्यूरोमस्कुलर जंक्शन पैथोलॉजी का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है।
इस तकनीक में सफलता कई कारकों पर निर्भर है। कुछ सबसे आम समस्याओं को नीचे रेखांकित किया गया है। सबसे पहले: गरीब इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला। इसके कई कारण हो सकते हैं, इस प्रोटोकॉल में सूचीबद्ध लोगों के लिए विभिन्न अभिकर् ती का उपयोग सबसे आम है। एक उच्च गुणवत्ता वाले इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रेड पीएफए अच्छा धुंधला सुनिश्चित करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है, जैसा कि इस प्रोटोकॉल में सूचीबद्ध एंटीबॉडी का विकल्प है। इसके अलावा, पुराने जानवरों(यानी> 3 महीने) में, अच्छी गुणवत्ता धुंधला होना अधिक कठिन हो सकता है। यह मांसपेशियों के आसपास के प्रावरणी की बढ़ी हुई मोटाई और बाहरी तिरछे और ट्रैन बनाम एब्डोमिनिस के बीच वसा संचय में वृद्धि के कारण है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए आगे बढ़ने से पहले वसा को पट्टी करना महत्वपूर्ण है। मांसपेशियों को कवर करने वाले कुछ प्रावरणी को बंद करना भी आवश्यक हो सकता है, जो गाढ़ा हो सकता है। मांसपेशियों के फाइबर को कुछ नुकसान पहुंचाए बिना मांसपेशियों से प्रावरणी और वसा को पट्टी करना मुश्किल होता है और आंतरिक पैटर्न में व्यवधान होता है। हालांकि अगर इस तकनीक को ध्यान से किया जाता है, तो चूहों से कम से कम 1 वर्ष तक अच्छी गुणवत्ता वाले धुंधला का अधिग्रहण किया जा सकता है। छोटे चूहों में(यानी3 महीने से कम उम्र) मांसपेशियों के तंतुओं के किसी भी चिढ़ाने या अलग करने के लिए आवश्यक नहीं होना चाहिए। दूसरे: विच्छेदन और धुंधला के बाद एनएमजे को खोजने में मुश्किल। ऐसा अक्सर इसलिए होता है क्योंकि विच्छेदन पिछले पसली के नीचे नहीं बढ़ाया गया है। एनएमजे के बहुमत सिर्फ पिछले पसली के नीचे स्थित है और इसलिए देखभाल के लिए मांसपेशियों के इस हिस्से को सुनिश्चित करने के विच्छेदन में शामिल किया जाना चाहिए । तीसरा: टीवीए पेशी के लिए ईओ की पेशी का पालन करना। यह अक्सर एक शिकायत होती है जब व्यक्ति आंतरिक तिरछे (आईओ) मांसपेशियों के स्तर से नीचे विच्छेदन का विस्तार करने का प्रयास करते हैं। टीवीए मांसपेशी का क्षेत्र जहां आईओ भी मौजूद है, विश्लेषण करना अधिक कठिन है क्योंकि यह अंतर करना मुश्किल हो सकता है कि कौन सी मांसपेशी है। इस कारण से, हम नियमित रूप से टीवीए मांसपेशियों का सबसे बेहतर हिस्सा विच्छेदन करते हैं। इस स्तर पर, ईओ और टीवीए मांसपेशियों के बीच कोई पालन नहीं है, और इसलिए यह एक महत्वपूर्ण समस्या नहीं होनी चाहिए।
परिशिष्ट मांसपेशियों की तुलना में टीवीए मांसपेशियों का उपयोग करने में एक महत्वपूर्ण बाधा, या तो सर्जिकल जोड़तोड़ या पदार्थों के इंजेक्शन के लिए पहुंच है। किसी दी गई मांसपेशियों में एनएमजे फिजियोलॉजी की जांच करने के लिए इस प्रकार के प्रयोग महत्वपूर्ण हो सकते हैं। यद्यपि टीवीए निश्चित रूप से टिबियालिस पूर्ववर्ती या गैस्ट्रोकनेमियसजैसी अधिक सामान्य रूप से उपयोग की जाने वाली मांसपेशियों की तुलना में कम आसानी से सुलभ है , लेकिन पिछले कार्य से पता चला है कि इंटरकोस्टलनसोंकी सर्जिकल चोट से टीवीए को विकृत करना संभव है । हमने हाल ही में सामान्य संवेदनाहारी (अप्रकाशित डेटा) के तहत पदार्थों के स्थानीय प्रशासन के लिए इस मांसपेशी का भी उपयोग किया है। यद्यपि ये प्रयोग एक मध्यम तकनीकी चुनौती का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं, इस काम से पता चलता है कि वे व्यवहार्य हैं और इस प्रकार रोग और शारीरिक हेरफेर दोनों के तहत एनएमजेएस के विश्लेषण के लिए इस मांसपेशी की उपयोगिता का विस्तार करते हैं।
टीवीए मांसपेशी पूरे शरीर में स्थित कई पतली फ्लैट मांसपेशियों में से एक है जिसका उपयोग इनरवेशन पैटर्न के पूरे माउंट विश्लेषण के लिए किया जा सकता है। अन्य मांसपेशियों में कपाल की मांसपेशियों का एक समूह शामिल है जो दिमाग तंत्र के चेहरे के नाभिक से निकलने वाले मोटर न्यूरॉन्स द्वारा आंतरिक रूप से, लेवेटर ऑरिस लॉन्गस, ऑरिकुलेसिस सुपीरियरऔर एडुकेटर ऑरिस लॉन्गस,विच्छेदन शामिल है जिसके लिए पहले14,19वर्णित किया गया है। इसके अलावा, ईओ, आईओ और रेक्टस एब्डोमिनिससहित टीवीए मांसपेशी के आसपास की मांसपेशी को भी एनएमजे विश्लेषण के लिए लेबल और उपयोग किया जा सकता है। माउस मॉडल में एनएमजे पैथोलॉजी के व्यापक विश्लेषण के लिए, पूरे शरीर में स्थित कई मांसपेशियों पर विचार करना महत्वपूर्ण है और विश्लेषण को एक भी मांसपेशियों तक सीमित नहीं करना महत्वपूर्ण है। यह मोटर न्यूरॉन रोगों के माउस मॉडल में उदाहरण है जहां विभिन्न मांसपेशियों के बीच एनएमजे विकृति के स्तर में महत्वपूर्ण विषमता है20. इस तरह के अंतरमस्कुलर परिवर्तनशीलता एक अत्यंत मूल्यवान उपकरण है जब मोटर न्यूरॉन भेद्यता के तंत्र की जांच और इसलिए एक ही मांसपेशी के लिए विश्लेषण सीमित काफी अनुसंधान की क्षमता कम हो सकता है ।

न्यूरोमस्कुलर जंक्शन (एनएमजे) एक कम मोटर न्यूरॉन और कंकाल मांसपेशी फाइबर के बीच सिनैप्टिक कनेक्शन हैं। उन्हें पारंपरिक रूप से एक त्रिपक्षीय सिनैप्स माना जाता है, जो न्यूरॉन (प्रेसिनैप्टिक टर्मिनल), मांसपेशी फाइबर (पोस्ट सिनैप्टिक टर्मिनल) और टर्मिनल श्वान सेल1से बना होता है। एनएमजेएस मोटर न्यूरॉन रोगों और माउस मॉडल2,3की एक श्रृंखला में पैथोलॉजी में जल्दी और महत्वपूर्ण लक्ष्य प्रतीत होते हैं। विशिष्ट लक्षणों में डिनेर्वेशन शामिल है, जहां मोटर एंडप्लेट एक प्रेसिनैप्टिक इनरवेशन, प्रेसिनैप्टिक टर्मिनल की सूजन, और एनएमजे आकृति विज्ञान4-11की जटिलता में कमी से रहित हो जाता है। प्रतिपूरक प्रतिक्रियाओं को भी नोट किया जा सकता है, जिसमें टर्मिनल और नोडल अंकुरण शामिल हैं, जहां अक्षीय प्रक्रियाएं शेष सिनैप्टिक टर्मिनलों या इंटरनोड से12,13को रेनरवेट्ड डीनरवेट्ड एंडप्लेट्स तक विस्तारित करती हैं। सिनैप्टिक गतिविधि और एनएमजे आकृति विज्ञान के बीच तंग सहसंबंध के कारण, एनएमजे आकृति विज्ञान के विश्लेषण से मोटर न्यूरॉन्स की कार्यात्मक स्थिति के बारे में जानकारी का एक बड़ा सौदा प्राप्त किया जा सकता है। एनएमजेएस का नुकसान अक्सर न्यूरोमस्कुलर पैथोलॉजी4,10के पहले पहलुओं में से एक का प्रतिनिधित्व करता है, इनरवेशन के स्तर पर मात्राकरण विकृति की प्रगति और चिकित्सीय हस्तक्षेप के संभावित प्रभाव के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी दे सकता है। इसके अलावा, एनएमजे हानि पैथोलॉजिकल प्रगति में एक महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधित्व करती है, चिकित्सा विज्ञान का विकास जो कनेक्शन को स्थिर कर सकता है और पुनर्जनन को प्रोत्साहित कर सकता है, महत्वपूर्ण लाभ प्राप्त कर सकता है।
एनएमजे आकृति विज्ञान का विश्लेषण करते समय, मांसपेशियों की पसंद का बहुत महत्व है। कुछ प्राथमिक विचारों में मांसपेशी फाइबर प्रकार, शरीर की स्थिति और मानव स्थितियों के लिए तुलनात्मक विश्लेषण शामिल हो सकते हैं। इसके अलावा, जहां पदार्थों के इंजेक्शन या दर्दनाक तंत्रिका चोट जैसे जोड़तोड़ की आवश्यकता होती है, प्रयोगात्मक पहुंच पर भी विचार करना महत्वपूर्ण है। सामान्य तौर पर, मोटर इकाई उपप्रकारों की एक श्रृंखला को दर्शाती पूरे शरीर में तैनात मांसपेशियों की एक श्रृंखला का विश्लेषण करना बेहतर है। अक्सर, हालांकि, मांसपेशियों की पसंद विच्छेदन की आसानी से प्रभावित होती है। नतीजतन, एनएमजे विश्लेषण अक्सर विशेष रूप से गैस्ट्रोकनेमियसजैसी बड़ी परिशिष्ट मांसपेशियों पर किया जाता है। ऐसी मांसपेशियों में अच्छे एनएमजे धुंधला प्राप्त करने के लिए, मांसपेशियों के तंतुओं की अनुभागिंग या यांत्रिक व्यवधान अक्सर आवश्यक होती है। नतीजतन, इनरवेशन पैटर्न बाधित हो सकता है और इनरवेशन पैटर्न, अंकुरण और डीनर्वेशन के व्यापक और उच्च गुणवत्ता वाले विश्लेषण से अक्सर समझौता किया जाता है। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण पतली सपाट मांसपेशियों का उपयोग करना है जिन्हें खंडीकरण की आवश्यकता नहीं होती है और मांसपेशियों के पूरे इनरवेशन का व्यापक अवलोकन करने की अनुमति देता है, जिससे दाग और घुड़सवार बरकरार हो सकते हैं। ऐसी कई मांसपेशियां हैं जिनका उपयोग कपाल की मांसपेशियों के समूह सहित इस तरह के विश्लेषण के लिए किया जा सकता है, (लेवेटर ऑरिस लॉन्गस, ऑरिकुलेसिस श्रेष्ठ,और एडुकक्टर ऑरिस लांगस)14,वक्ष मांसपेशियां(उदाहरण के लिए)शामिल हैं। त्रिकोणीय ों की तासीर) 15,और पेट(जैसे ट्रांस बनाम एब्डोमिनिस (टीवीए)) मांसपेशियां। ऐसी मांसपेशियों का उपयोग करने में प्रमुख बाधा उन्हें नुकसान के बिना विच्छेदन करने के लिए आवश्यक तकनीकी विशेषज्ञता है।
इस वीडियो में, हम इनरवेशन पैटर्न और एनएमजे आकृति विज्ञान के व्यापक विश्लेषण की अनुमति देने के लिए माउस से टीवीए मांसपेशी की इम्यूनोफ्लोर्सेंट लेबलिंग को विच्छेदन और प्रदर्शन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। टीवीए मांसपेशी एक मुख्य रूप से धीमी चिकोटी मांसपेशी है जिसमें पेट की मांसपेशी की गहरी परत शामिल होती है और निचली इंटरकोस्टल नसों द्वारा आंतरिक होती है। पिछले काम ने इसे बचपन मोटर न्यूरॉन रोग स्पाइनल मस्कुलर शोष (SMA) के कई माउस मॉडलों में और शुरुआती शुरुआत मोटर न्यूरॉन डिजनरेशन4,16के अन्य माउस मॉडलों में विकृति के लिए लगातार अत्यधिक असुरक्षित दिखाया है। इसलिए हम सुझाव देते हैं कि टीवीए परिधीय न्यूरोपैथी में एनएमजे विश्लेषण शुरू करने के लिए एक उपयोगी मांसपेशी है।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="958">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Paraformaldehyde Aqueous Solution (16% )</td>
			<td style="width:259px;">Electron Micropscopy Sciences</td>
			<td style="width:216px;">15700</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td style="width:259px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Angled Sprung Scissors</td>
			<td style="width:259px;">Fine Science Tools</td>
			<td>15006-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Fine Scissors - ToughCut</td>
			<td style="width:259px;">Fine Science Tools</td>
			<td>14058-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:259px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:216px;">dependant on local supplier</td>
			<td>Use this to make dissection dish for pinning out muscle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Minutien Pins</td>
			<td style="width:259px;">Fine science tools</td>
			<td>26002-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">&#945;-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:216px;">B-13422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Albumin from Bovine Serum</td>
			<td style="width:259px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:216px;">A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:316px;">Neurofilament Primary antibody (2H3), Supernatant</td>
			<td style="width:259px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:316px;">SV2 Primary antibody (SV2), Supernatant</td>
			<td style="width:259px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td style="width:259px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-166-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td style="width:259px;">Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Slides (Superfrost Plus; White)</td>
			<td style="width:259px;">Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Coverslips</td>
			<td style="width:259px;">Fisher</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:259px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:216px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">CD1/C57Bl6 mouse</td>
			<td style="width:259px;">Jackson Labs</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of the transversus abdominis muscle for whole-mount neuromuscular junction analysis

न्यूरोमस्कुलर जंक्शन आकृति विज्ञान का विश्लेषण किसी दिए गए मोटर न्यूरॉन की शारीरिक स्थिति में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि दे सकता है। पतली सपाट मांसपेशियों का विश्लेषण पारंपरिक रूप से उपयोग की जाने वाली मोटी मांसपेशियों पर महत्वपूर्ण लाभ प्रदान कर सकता है, जैसे कि हिंद अंग(उदाहरण के लिए)से। गैस्ट्रोकनेमियस)। पतली मांसपेशियां किसी दिए गए मांसपेशियों के लिए पूरे इनरवेशन पैटर्न के व्यापक अवलोकन के लिए अनुमति देती हैं, जो बदले में मोटर न्यूरॉन्स के चुनिंदा कमजोर पूल की पहचान की अनुमति देती है। ये मांसपेशियां मोटर यूनिट साइज, एक्सोनल ब्रांचिंग और टर्मिनल/नोडल स्प्राउटिंग जैसे मापदंडों के विश्लेषण की भी अनुमति देती हैं । ऐसी मांसपेशियों का उपयोग करने में एक आम बाधा उन्हें विच्छेदन करने के लिए तकनीकी विशेषज्ञता प्राप्त कर रही है। इस वीडियो में, हम युवा चूहों से ट्रांसवर्स एब्डोमिनिस (टीवीए) मांसपेशी को विच्छेदन करने और एक्सोन और न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों (एनएमजेएस) की कल्पना करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस करने के लिए प्रोटोकॉल का विस्तार करते हैं। हम प्रदर्शित करते हैं कि यह तकनीक टीवीए मांसपेशियों के इनरवेशन पैटर्न का पूरा अवलोकन देती है और बचपन की मोटर न्यूरॉन रोग, स्पाइनल मस्कुलर शोष के माउस मॉडल में एनएमजे विकृति की जांच करने के लिए उपयोग किया जा सकता है।

उपरोक्त प्रोटोकॉल एनएमजे विश्लेषण के लिए टीवीए मांसपेशी के अलगाव और धुंधला करने का निर्देश देता है। यह मांसपेशियों के अंतर्मन पैटर्न के पूरे माउंट विश्लेषण के साथ-साथ एनएमजे आकृति विज्ञान(चित्र 2)के उच्च-संकल्प विश्लेषण की अनुमति देता है। इस तकनीक को सफलतापूर्वक मोटर न्यूरॉन रोग के माउस मॉडल में एनएमजे विकृति प्रकट करने के लिए लागू किया जा सकता है, जैसे SMA4,17(चित्रा 3)। SMA के माउस मॉडल में पैथोलॉजी में महत्वपूर्ण इंट्रामस्क्युलर परिवर्तनशीलता है, हालांकि टीवीए मांसपेशी लगातार अत्यधिक प्रभावित होती है। इसका सबूत मोटर एंडप्लेट के डिनेरवेशन, प्रेसिनैप्टिक टर्मिनल पर न्यूरोफिलामेंट्स का संचय और टर्मिनल स्प्राउटिंग(चित्र 3) से होता है। यहां प्रस्तुत परिणाम इस प्रकार प्रदर्शित करते हैं कि ऊपर वर्णित तकनीक माउस मॉडल में एनएमजे विकृति के इनरवेशन और विश्लेषण का व्यापक अवलोकन प्रदान करने के लिए एक शक्तिशाली विधि हो सकती है।
<img alt="Figure 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51162/51162fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51162/51162fig1.jpg" width="600px"> चित्रा 1. माउस के पेट की मांसपेशी का अवलोकन। (क)छवि संलग्न पेट मांसपेशी के साथ वक्ष पिंजरे, जो हाल ही में एक इच्छामृत्यु माउस से हटा दिया गया है और एक विच्छेदन पकवान सतही पक्ष(ए)में टिकी दिखाने के लिए । (ख)पेट की मांसपेशियों की अनुमानित सीमाओं को चिह्नित करने के लिए ए में विच्छेदन को एनोटेट किया गया है । सतही पेट की मांसपेशियों को विच्छेदन के बाईं ओर देखा जा सकता है, और इसमें बाहरी तिरछे (नीले रंग में उल्लिखित) और रेक्टस एब्डोमिनिस (लाल रंग में उल्लिखित) शामिल हैं। विच्छेदन के दाहिने हाथ की ओर, सतही मांसपेशियों को ट्रांस बनाम एब्डोमिनिस मांसपेशी (हरे रंग में उल्लिखित) और आंतरिक तिरछी मांसपेशी (पीले रंग में उल्लिखित) के दृश्य की अनुमति दी गई है। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य टीवीए मांसपेशियों के बेहतर हिस्से के विच्छेदन को निर्देशित करना है, जो यहां एक ठोस हरे त्रिकोण के रूप में दिखाया गया है। <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51162/51162fig1highres.jpg" target="_blank">बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें</a>।
<img alt="Figure 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51162/51162fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51162/51162fig2.jpg" width="600px"> चित्रा 2। टीवीए मांसपेशी में न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों का संपूर्ण माउंट अवलोकन। टीवीए की मांसपेशियों से उदाहरण दिखाने वाली छवियां न्यूरोफिलामेंट (एनएफ; ग्रीन), सिनैप्टिक वेसिकल प्रोटीन 2 (एसवी 2; ग्रीन) और बुंगरोटॉक्सिन (बीटीएक्स; लाल) के लिए इम्यूनोफ्लोरोसेंट स्टेनिंग के साथ कल्पना की गई हैं। छवियों को पूरी मांसपेशी(ए)या कॉन्फोकल छवियों को दिखाने वाले फ्लोरोसेंट माइक्रोग्राफ हैं जो समूहों(बी)या व्यक्तिगत(सी)एनएमजेएस दिखाते हैं। स्केल बार = 800 माइक्रोन(ए),70 माइक्रोन(बी),25 माइक्रोन(सी)। <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51162/51162fig2highres.jpg" target="_blank">बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें</a>।
<img alt="Figure 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51162/51162fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51162/51162fig3.jpg" width="600px"> चित्र 3। एसएमए के माउस मॉडल से टीवीए मांसपेशी में न्यूरोमस्कुलर जंक्शन पैथोलॉजी। टीवीए की मांसपेशी से एनएमजे को दिखाने वाले कॉन्फोकल माइक्रोग्राफ न्यूरोफिलामेंट (एनएफ; ग्रीन), सिनैप्टिक वेसिकल प्रोटीन 2 (एसवी 2; ग्रीन) और बुंगारोटॉक्सिन (बीटीएक्स; रेड) या तो नियंत्रण(Smn2B/+)या एसएमए माउस मॉडल(Smn2B/-)के लिए इम्यूनोफ्लोरोसेंट स्टेनिंग के साथ कल्पना करते हैं । ध्यान दें कि सामान्य एनएमजे आकृति विज्ञान को नियंत्रण चूहों में देखा जा सकता है, एसएमएन2 बी/-चूहों से टीवीए मांसपेशियों में पूर्ण डिनेर्वेशन (सफेद एरोहेड), आंशिक डिनेरवेशन (बैंगनी एरोहेड) टर्मिनल स्प्राउटिंग (ब्लू एरोहेड) और प्रेसिनैप्टिक सूजन (पीला एरोहेड) का सबूत है। सिनैप्टिक एंडप्लेट के बाद भी कम जटिल हैं जो जाहिरा तौर पर कम परिपक्व फेनोटाइप को दर्शाते हैं। स्केल बार = 50 माइक्रोन. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51162/51162fig3highres.jpg" target="_blank">बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें</a>।

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Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

इस वीडियो में हम माउस की ट्रांसवर्स एब्डोमिनिस मांसपेशी के विच्छेदन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदर्शित करते हैं और न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों की कल्पना करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस और माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हैं।

पूरे माउंट न्यूरोमस्कुलर जंक्शन विश्लेषण के लिए ट्रांस बनाम एब्डोमिनिस मांसपेशी का विच्छेदन

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

एक माउस आँखों के रेटिना वर्णक उपकला के एक पूरे पर्वत के लिए विच्छेदन

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

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