Name: production of rna for transcriptomic analysis from mouse spinal cord motor neuron cell bodies by laser capture microdissection
Uploaded: 2014-01-13T14:15:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection at JoVE.com

लेखकों को सहायक चर्चा के लिए जॉर्ज Farr और हॉर्विच लैब के सदस्यों का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । इस काम को हावर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट ने सपोर्ट किया ।

<ol>
	<li>Zhu, J., Nie, S., Wu, J., Lubman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+proteomic+profiling+of+frozen+pancreatic+CD24++adenocarcinoma+tissues+by+immuno-laser+capture+microdissection+and+nano-LC-MS/MS.">Target proteomic profiling of frozen pancreatic CD24+ adenocarcinoma tissues by immuno-laser capture microdissection and nano-LC-MS/MS.</a> J. Proteome. Res. , (2013).</li><li>Bandyopadhyay, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+profiling+of+spinal+cord+motor+neurons+from+a+presymptomatic+SOD1+ALS+mouse..">RNA-Seq profiling of spinal cord motor neurons from a presymptomatic SOD1 ALS mouse..</a> PLoS ONE. 8 (1), 10-1371 (2013).</li><li>Shea, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+in+situ+cytophotometric+estimation+of+absolute+amount+of+ribonucleic+acid+using+azure+B1.">A method for in situ cytophotometric estimation of absolute amount of ribonucleic acid using azure B1.</a> J. Histochem. Cytochem. 18 (2), 143-152 (1970).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+guidelines:+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clin. Chem. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Mol. Biol. 7, (2006).</li><li>Doebler, J. A., Rhoads, R. E., Anthony, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+RNA+in+Pick's+and+Alzheimer's+diseases.+Comparison+of+disease-susceptible+and+disease-resistant+cortical+areas.">Neuronal RNA in Pick's and Alzheimer's diseases. Comparison of disease-susceptible and disease-resistant cortical areas.</a> Arch. Neurol. 46 (2), 134-137 (1989).</li><li>Lobsiger, C. S., Boill&#233;e, S., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+from+different+SOD1+mutants+dysregulates+the+complement+system+and+the+neuronal+regenerative+response+in+ALS+motor+neurons.">Toxicity from different SOD1 mutants dysregulates the complement system and the neuronal regenerative response in ALS motor neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (18), (2007).</li><li>Ferraiuolo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+of+the+cellular+pathways+involved+in+the+adaptation+to+and+progression+of+motor+neuron+injury+in+the+SOD1+G93A+mouse+model+of+familial+ALS.">Microarray analysis of the cellular pathways involved in the adaptation to and progression of motor neuron injury in the SOD1 G93A mouse model of familial ALS.</a> J. Neurosci. 27 (34), 9201-9219 (2007).</li><li>Sturm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+protocol+for+laser+microdissection+of+human+pancreatic+islets+from+surgical+specimens.">Improved protocol for laser microdissection of human pancreatic islets from surgical specimens.</a> J. Vis. Exp. 6 (71), (2013).</li><li>Burbach, G. J., Dehn, D., Nagel, B., Del Turco, D., Deller, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+of+immunolabeled+astrocytes+allows+quantification+of+astrocytic+gene+expression.">Laser microdissection of immunolabeled astrocytes allows quantification of astrocytic gene expression.</a> J. Neurosci. Methods. 138 (1-2), 141-148 (2004).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+aggregation+despite+chaperone+associations+of+a+mutant+SOD1-YFP+in+transgenic+mice+that+develop+ALS.">Progressive aggregation despite chaperone associations of a mutant SOD1-YFP in transgenic mice that develop ALS.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (5), 1392-1397 (2009).</li></ol>

लेखकों की घोषणा वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।

रीढ़ की हड्डी के स्लाइस के लेजर माइक्रोडिसेक्शन द्वारा कुल आरएनए के उत्पादन के लिए इस प्रोटोकॉल की सफलता का सबसे महत्वपूर्ण उपाय आरआईआईएन मूल्य5है । उच्च यूकेरियोट्स से आरएनए नमूनों के लिए, 8.5 से ऊपर के मान नियमित रूप से उच्च गुणवत्ता वाले अनुक्रमण और क्यूआरटी-पीसीआर डेटा प्राप्त करते हैं। यदि उपज कम है लेकिन गुणवत्ता अधिक है, तो तैयारी दोहराएं। यदि अखंडता कम है (यहां तक कि 7.5-8), हालांकि, समस्या के स्रोत को ढूंढना और फिर से प्रयास करना बेहतर है। ऐसे कई कदम हैं जहां कुछ गलत हो सकता है, लेकिन वास्तव में समस्या के केवल दो स्रोत - अंतर्जात RNase संदूषण या बहिर्जात RNase संदूषण। पहले अभ्यास द्वारा संबोधित किया जा सकता है, ताकि माउस के बलिदान से उसके O.C.T-एम्बेडेड कॉर्ड को ठंडा करने के लिए समय को कम किया जा सके। प्रोटोकॉल में दूसरा बिंदु जहां अंतर्जात RNase एक खराब परिणाम में योगदान कर सकते है स्लाइस की तैयारी के दौरान है । प्रत्येक टुकड़ा एक कमरे के तापमान कलम स्लाइड जल्दी से पालन करना चाहिए, लेकिन यह पिघल जाएगा (O.C.T स्पष्ट हो जाता है) । जितनी तेजी से स्लाइस को बेहतर रीफ्रोज किया जा सकता है। हमारे द्वारा उपयोग किए जाने वाले क्रायोस्टेट में कक्ष के अंदर सपाट सतहें होती हैं जो -20 डिग्री सेल्सियस पर होती हैं, जिसका उपयोग हम स्लाइस को जल्दी से फिर से फ्रीज करने के लिए करते हैं। इस्तेमाल किया क्रायोस्टेट में एक समान स्थान का पता लगाएं और सुनिश्चित करें कि टुकड़ा फिर से तेजी से अपारदर्शी हो जाता है ।
बहिर्जात RNase के स्रोतों को ट्रैक करना मुश्किल हो सकता है, क्योंकि बहुत सारी संभावनाएं हैं। केवल अभिकर् चर का उपयोग किया जाता है जो स्पष्ट रूप से RNase-मुक्त नहीं हैं ओ.C टी और नीला बी । यदि नीला बी संतोषजनक प्रदर्शन किया है पहले, O.C T. की एक ताजा बोतल की कोशिश करो, हालांकि इस अभिवात एक समस्या कभी नहीं किया गया है । RNase मुक्त अभिकर्दक भी प्रतिस्थापित किया जा सकता है, यहां तक कि एक अलग आपूर्तिकर्ता से । एक बहुत अधिक संभावना स्रोत अन्वेषक है । कार्य क्षेत्र की पूरी तरह से सफाई के अलावा, अक्सर एक और प्रयोगशाला सदस्य का पालन करना और प्रक्रिया में सभी चरणों का पालन करना उपयोगी होता है। यहां तक कि अगर यह कोई है जो नियमित रूप से इस प्रक्रिया को नहीं करता है, आंखों का एक ताजा सेट संदूषण का एक अंयथा किसी का ध्यान नहीं स्रोत उठा सकते हैं ।
अन्य रीढ़ की हड्डी की कोशिकाओं से आरएनए ठीक करने के लिए इस प्रोटोकॉल का विस्तार, अन्य प्रजातियों से रीढ़ की हड्डी की कोशिकाओं से, या अन्य अंगों में विशिष्ट कोशिका प्रकार से, कई ब्याज की कोशिकाओं की स्पष्ट पहचान प्राप्त करने में निर्देशित क्षेत्रों में संशोधनों की आवश्यकता होगी, जबकि निराकरण, या कम से कम, अंतर्जात RNase के प्रभाव को कम करने। यहां प्रोटोकॉल में, तेजी से हटाने और कॉर्ड की ठंड, 70% इथेनॉल में नीला बी धुंधला के साथ मिलकर, आरएनए क्षरण और मोटर न्यूरॉन सेल निकायों की आसान पहचान दोनों को कम करने की अनुमति दी। नीला बी न्यूरॉन्स के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित हिस्टोकेमिकल दाग है जो आरएनए3 को बांधने के लिए प्रकट होता है और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग6के रोगियों से मस्तिष्क के ऊतकों के ऑटोप्सी नमूनों में न्यूरॉन्स की आरएनए सामग्री का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। विशेष रूप से, नीला बी धुंधला या तो शुद्ध आरएनए की अखंडता या उसके रिवर्स लिखित और विश्लेषण करने की क्षमता को प्रभावित नहीं किया । अन्य रंगों, जैसे क्रेसिलवायलेट 7 और टोल्यूडीन ब्लू8 का उपयोग समान एलएमडी प्रोटोकॉल में किया गया है। सेल निकायों को सीधे ग्वानिडीन थिओसाइनेट समाधान में इकट्ठा करना क्योंकि उन्हें विच्छेदित किया गया था, अंतिम चरण प्रदान किया गया था जिसके परिणामस्वरूप बरकरार आरएनए की नियमित वसूली हुई थी।
इसी तरह के दृष्टिकोण अन्य कोशिकाओं और अंगों के लिए अनुरूप किया जा सकता है, यह पहचानने कि ब्याज की कोशिकाओं की पहचान करते हुए कम या, अधिमानतः, अंतर्जात RNases द्वारा आरएनए क्षरण को रोकने के सफल विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण आवश्यकता है । जिन ऊतकों में आरएनएई के उच्च स्तर होते हैं, जैसे अग्न्याशय, तेजी से हैंडलिंग और कम तापमान को β-कोशिकाओं से आरएनए की वसूली की अनुमति देने के लिए संयुक्त किया गया है, जो दृश्य9के लिए उनके प्राकृतिक ऑटोफ्लोरेसेंस का लाभ उठाते हुए। पहचान के लिए एंटीबॉडी धुंधला का उपयोग कर प्रक्रियाओं को भी10की सूचना दी गई है, लेकिन हमारे हाथों में पूरी तरह से सफल नहीं किया गया है । अंत में, कई माउस मॉडल उपलब्ध हैं जो ब्याज की कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन(यानी जीएफपी, वाईएफपी, आरएफपी) व्यक्त करते हैं, जिसका उपयोग एलएमडी माइक्रोस्कोप पर ऊतक अनुभागों में उनकी पहचान करने के लिए किया जा सकता है। वास्तव में, माउस उपभेदों हम इस प्रोटोकॉल के साथ विश्लेषण किया है SOD1 और YFP11के बीच एक संलयन प्रोटीन व्यक्त करते हैं, और उनके रीढ़ की हड्डी मोटर न्यूरॉन्स अत्यधिक फ्लोरोसेंट हैं । हालांकि, हम इथेनॉल वॉश और/या निर्जलीकरण की स्थिति का एक सेट खोजने में सक्षम नहीं थे जो एक साथ ओ.C.टी. को हटा देंगे, RNase गतिविधि को रोकते हैं, और मोटर न्यूरॉन्स के दृश्य और एलएमडी द्वारा उनकी वसूली की अनुमति देने के लिए पर्याप्त वाईएफपी फ्लोरेसेंस को लगातार बनाए रखते हैं। शायद एक नया फ्लोरोसेंट प्रोटीन या उपलब्ध लोगों का एक संस्करण जो कार्बनिक सॉल्वैंट्स में फ्लोरेसेंस को बनाए रखता है, इस सीमा को दूर करने के लिए पाया जा सकता है।

कई अलग-अलग सेल प्रकारों से बने स्तनधारी ऊतकों में, लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन (एलएमडी) इंस्ट्रूमेंटेशन के आगमन ने आरएनए या प्रोटीन स्तर पर विश्लेषण के लिए एक विशिष्ट सेल प्रकार का चयन करने की संभावना को वहन किया है। वर्तमान में, प्रवर्धन और अगली पीढ़ी की अनुक्रमण तकनीकें कुछ हजार कोशिकाओं से कुल आरएनए के एक पूल का उपयोग करने के लिए ट्रांसक्रिप्टोम की अपेक्षाकृत पूरी तरह से सूची प्राप्त करने में सक्षम बनाती हैं, जिसमें आरएनए के सापेक्ष स्तरों का आकलन और विभिन्न स्प्लिट किए गए रूपों की पहचान शामिल है। आज तक, कुछ हजार कोशिकाओं के प्रोटेओमिक्स विश्लेषण केवल अधिक प्रचुर मात्रा में प्रजातियों के माध्यम से नीचे पहुंच जाएगा । उदाहरण के लिए, हमने 3000-4,000 मोटर न्यूरॉन सेल निकायों (नहीं दिखाए गए) से सबसे प्रचुर मात्रा में प्रोटीन के <1,000 की पहचान की है, और झू और सहकर्मियों ने हाल ही में ~ 15,000 ट्यूमर कोशिकाओं1से 2,665 प्रोटीन की पहचान करने की सूचना दी है। हालांकि, बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के आगे के विकास के साथ, यह संभावना है कि इस तरह के विश्लेषण कहीं अधिक गहराई तक विस्तारित होंगे।
यहां, हम चूहों की रीढ़ की हड्डी से मोटर न्यूरॉन सेल निकायों के एलएमडी के लिए उपयोग किए जाने वाले एक विशिष्ट प्रोटोकॉल पेश करते हैं, जिसके बाद आरएनए की तैयारी होती है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग आरएनए की तुलना प्रेसिम्प्टोमैटिक ट्रांसजेनिक म्यूटेंट सुपरऑक्साइड डिस्मुटेज़ (एसओडी) 1 एमियोट्रोफिक लेटरल स्क्लेरोसिस (एएलएस) चूहों के मोटर न्यूरॉन्स से करने के संदर्भ में किया गया था, जिसमें आरएनए से तैयार आरएनए से आरएनए-एसईक्यू और क्यूआरटी-पीसीआर सत्यापन2दोनों द्वारा जंगली प्रकार के एसओडी1 ट्रांसजेनिक तनाव से तैयार किया गया था। विशेष रूप से, रीढ़ की हड्डी में ग्रे पदार्थ के पूर्वकाल सींग में मोटर न्यूरॉन्स, कुल सेल आबादी का <10% शामिल है, जो एस्ट्रोसाइट्स के समुद्र से घिरा हुआ है, और इस तरह, उनके ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइल को पूरी कॉर्ड के अध्ययन से आसानी से विघटित नहीं किया जा सकता है। एक लेजर कैप्चर दृष्टिकोण इस प्रकार इन कोशिकाओं में आरएनए अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए आदर्श है, जिसमें शरीर विज्ञान को संक्षिप्त इंट्राकार्डिएक खारा परफ्यूजन के बाद कॉर्ड को तेजी से उत्तेजित और ठंडा करके संरक्षित किया जाता है। मोटर न्यूरॉन सोमता बड़े हैं और इस प्रकार आसानी से पता लगाने योग्य हैं, यहां एक डाई का उपयोग करके जिसमें न्यूरॉन्स3के लिए मजबूत आत्मीयता है। इसके अलावा, इस तरह के आकार के साथ, ये कोशिकाएं प्रति सेल अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा में आरएनए प्रदान करती हैं। उपयोग की जाने वाली प्रक्रिया, जैसा कि नीचे विस्तृत है, अन्य न्यूरोनल सेल प्रकारों के साथ-साथ संभावित अन्य सेल प्रकारों को प्राप्त करने के लिए आसानी से समायोजित किया जा सकता है, विशेष रूप से डाई स्टेनिंग तकनीकों द्वारा या एंटीबॉडी धुंधला द्वारा पहचाना जाता है।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">Ketamine</td>
			<td style="width:195px;">Webster Veterinary</td>
			<td style="width:155px;">26637041101</td>
			<td style="width:339px;">Any source approved by the institutional veterinary service</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">Dissection tools (scissors, forceps,&#160;etc.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:339px;">Any convenient source of high-quality dissection instruments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">Cryostat&#160;</td>
			<td>Leica Microsystem</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td style="width:339px;">Other cryostats should be suitable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">LMD6000 B</td>
			<td>Leica Microsystem</td>
			<td></td>
			<td style="width:339px;">Other LMD systems have not been tested</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">RNase-free PEN-membrane 2 &#956;m slides&#160;</td>
			<td>Leica Microsystem</td>
			<td>11505189</td>
			<td style="width:339px;">Other slide types have been tested and do not perform well</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:268px;">RNeasy Micro kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td style="width:339px;">Any kit that uses guanidine thiocyanate lysis buffer and has been tested for recovering small quantities of RNA can be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">Agilent 2100 BioAnalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939A</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">Azure B Certified&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>190520</td>
			<td style="width:339px;">Critical! Product from any source has to be tested before use for its ability to maintain RNA integrity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">PBS</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>D8537</td>
			<td style="width:339px;">Any reliable source of RNase-free PBS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">RNA Ethanol 70% (made with DEPC treated water)</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB04010-00500</td>
			<td style="width:339px;">Any reliable source, can be lab-made</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">Water, RNase-free, Endotoxin tested (treated with DEPC to eliminate RNase)</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB02128-00500</td>
			<td style="width:339px;">Any reliable source, can be lab-made</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">RNase AWAY</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>10328-011</td>
			<td style="width:339px;">Other similar RNase removal reagents, such as RNaseZAP (also from Invitrogen) can be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">2-Methylbutane&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78-78-4</td>
			<td style="width:339px;">Any source</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">Maxymum Recovery microfuge tubes (0.6 and 1.5 ml) and pipette tips&#160;</td>
			<td>Axygen&#160;</td>
			<td>311-03-051 &#38; 311-09-051</td>
			<td style="width:339px;">Ultra-low retention, RNase free tubes and tips; test other manufacturer&#39;s products before using</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">O.C.T. Compound</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">Cryomold Intermediate Size</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4566</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">Lab wipes (Kimwipes)</td>
			<td>KIMTECH</td>
			<td>34155</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of rna for transcriptomic analysis from mouse spinal cord motor neuron cell bodies by laser capture microdissection

ब्याज की कोशिकाओं से उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए की तैयारी सेल प्रकारों के बीच या स्वास्थ्य और रोग में एक ही सेल प्रकार या फार्माकोलॉजिक उपचार के बाद प्रतिलेखन मतभेदों के सटीक और सार्थक विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है। रीढ़ की हड्डी में, मोटर न्यूरॉन्स से इस तरह की तैयारी, कई न्यूरोलॉजिक और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में रुचि का लक्ष्य, इस तथ्य से जटिल है कि मोटर न्यूरॉन्स कुल सेल आबादी का <10% प्रतिनिधित्व करते हैं। इस समस्या के समाधान के लिए लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन (एलएमडी) विकसित किया गया है। यहां, हम अंतर्जात और बहिर्जात आरएनएस द्वारा आरएनए क्षति से बचने के लिए जल्दी से ठीक होने, फ्रीज और सेक्शन माउस स्पाइनल कॉर्ड के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जिसके बाद 70% इथेनॉल में नीला बी के साथ धुंधला हो जाता है, जबकि अंतर्जात आरएनएस को बाधित रखते हुए मोटर न्यूरॉन्स की पहचान की जाती है। एलएमडी का उपयोग आरएनए अखंडता को बनाए रखते हुए सीधे ग्वानिडीन थिओसायनेट लाइसिस बफर में दाग न्यूरॉन्स को पकड़ने के लिए किया जाता है। मानक तकनीकों का उपयोग कुल आरएनए को ठीक करने और इसकी अखंडता को मापने के लिए किया जाता है। इस सामग्री का उपयोग आरएनए-सेक्यू और क्यूआरटी-पीसीआर द्वारा टेप के डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए किया जा सकता है।

ऊपर उल्लिखित प्रोटोकॉल और चित्रा 1 में 3000-4000 रीढ़ की हड्डी मोटर न्यूरॉन सेल निकायों से >8.5 की एक RIN के साथ कुल आरएनए के 50 एनजी या अधिक उत्पादन करना चाहिए के बारे में 20 कलम स्लाइड पर 9-10 20 माइक्रोम स्लाइस से विच्छेदन। क्योंकि स्लाइड की यह संख्या माउस रीढ़ की हड्डी के ओ.C.टी.-एम्बेडेड ब्लॉक के 10% से भी कम का प्रतिनिधित्व करती है, इसलिए ब्लॉक पर लौटना संभव है, जिसे -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया है, और आरएनए तैयारी के एक और दौर से गुजरने के लिए अधिक स्लाइस काटें। यदि विश्लेषण के लिए आरएनए की बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है, तो एक समय में केवल स्लाइड(उदाहरण के लिए 20) की संख्या बनाना बेहतर होता है जिसे कुछ दिनों में विच्छेदन और आरएनए तैयारी के माध्यम से संसाधित किया जा सकता है, फिर दूसरे दौर के लिए और अधिक स्लाइड बनाएं और उत्पादों को जोड़ें। एक बुरे के साथ एक अच्छा एक संयोजन से बचने के लिए पहले प्रत्येक तैयारी के RIN की जांच करने के लिए सुनिश्चित करें । आरएनए-एसईक्यू विधियां अधिक संवेदनशील होती जा रही हैं और नई पीसीआर प्रौद्योगिकियां वर्तमान लोगों की तुलना में उच्च संवेदनशीलता का वादा कर रही हैं । इस प्रकार, कम न्यूरॉन सेल निकायों से कम आरएनए की आवश्यकता होगी, जिससे अधिक अनुक्रमण गहराई और दिलचस्प हिट के अधिक व्यापक सत्यापन की अनुमति मिलेगी। दूसरी ओर, क्यूआरटी-पीसीआर विश्लेषण और सत्यापन4 के लिए MIQE सिफारिशों का पूर्ण पालन कम भरपूर आरएनए के लिए आवश्यक नियंत्रण प्रतिक्रियाओं के लिए अनुमति देने के लिए बड़ी मात्रा में आवश्यकता हो सकती है।
चित्रा 2 नीला बी धुंधला और विच्छेदन के बाद एक रीढ़ की हड्डी वेंट्रल सींग अनुभाग के एक हिस्से की छवियों की एक विशिष्ट श्रृंखला से पता चलता है । पैनल ए में, बड़े, गहरे दाग वाले सेल निकाय मोटर न्यूरॉन्स हैं, जो एंटी-चैट एंटीबॉडी स्टेनिंग2द्वारा पुष्टि किए जाते हैं, और आसानी से छोटे पड़ोसी कोशिकाओं से अलग होते हैं। पैनल बी प्रकाश कलम के साथ उल्लिखित और माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर द्वारा गिने गए व्यक्तिगत सेल निकायों के साथ एक ही क्षेत्र दिखाता है। रूपरेखा बारीकी से सेल निकायों के हाशिए का पालन करें, लेजर की काटने की चौड़ाई के लिए एक छोटे से भत्ते के साथ । इस अंतर को मोटर न्यूरॉन साइटोसोल के नुकसान से बचने के दौरान बाहरी सामग्री के समावेश को कम करने के लिए प्रत्येक लेजर पावर सेटिंग के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए। पैनल सी और डी लेजर कटौती के बाद अनुभाग दिखाने के लिए और व्यक्तिगत सेल निकायों संग्रह टोपी में गिरा दिया है । ध्यान दें कि काटने मार्जिन वास्तव में पैनल सी में प्रकाश कलम रूपरेखा का पालन नहीं करता है, लेकिन काफी हद तक इसके बाहर रहता है । यह अनियमितता पैनल डी में स्पष्ट है, जैसा कि प्रत्येक कट के आसपास काला क्षेत्र है, जो लेजर के कारण ऊतक को गर्मी की क्षति को दर्शाता है। इस वजह से, यदि दो सेल निकाय एक दूसरे के बहुत करीब हैं, तो उन्हें एक कट के लिए तैयार करना बेहतर है, बजाय उन्हें अलग से काटने की कोशिश करने और निकट संपर्क के अपने क्षेत्र में गर्मी के नुकसान के लिए कुछ आरएनए खोने के बजाय।
चित्रा 3 एलएमडी द्वारा एकत्र ~ 4,000 माउस मोटर न्यूरॉन सेल निकायों से तैयार आरएनए के नमूने के आरएनए अखंडता के इलेक्ट्रोफोरेटिक विश्लेषण के विशिष्ट परिणाम दिखाता है। ऊपरी पैनल कुल आरएनए के 1 माइक्रोन द्वारा उत्पादित इलेक्ट्रोफेरोग्राम है; दाईं ओर इनसेट जेल की एक छवि है। दोनों में, प्रमुख राइबोसोमल आरएनए चोटियों पर ध्यान दें। निचला पैनल आरएनए आकार मानकों वाले लेन का इलेक्ट्रोफेरोग्राम है। विश्लेषण सॉफ्टवेयर 4.9 एनजी/ विश्लेषण के बाद इस समाधान के कुल 13 माइक्रोन उपलब्ध थे, जो ट्रांसक्रिप्ट राशि के डाउनस्ट्रीम क्यूआरटी-पीसीआर सत्यापन के लिए आरएनए के 64 एनजी प्रदान करते थे। मामूली प्रचुर मात्रा में प्रतिलिपियों के एक विशिष्ट क्यूआरटी-पीसीआर विश्लेषण के लिए, कुल आरएनए का 0.15-0.20 एनजी सटीक क्वांटिटेशन2का उत्पादन करने के लिए पर्याप्त है, इसलिए इस तैयारी से उपलब्ध आरएनए की मात्रा कई प्राइमर सेट के साथ कई प्रतिलिपियों को मान्य करने के लिए पर्याप्त है, जैसा कि अनुशंसित4। बेशक, इनपुट आरएनए की बड़ी मात्रा का उपयोग दुर्लभ प्रतिलिपियों के सत्यापन की अनुमति देने के लिए किया जा सकता है। यह राशि पुस्तकालय तैयार करने और अगली पीढ़ी के आरएनए-सेक्यू की अनुमति देने के लिए भी पर्याप्त से अधिक है।
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51168/51168fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51168/51168fig1.jpg"> चित्रा 1. रीढ़ की हड्डी के टुकड़े उत्पादन और लेजर का अवलोकन रीढ़ की हड्डी मोटर न्यूरॉन सेल निकायों के माइक्रोडिसेक्शन पर कब्जा। A)स्लाइस उत्पादन और धुंधला में प्रमुख कदम। B)रीढ़ की हड्डी के खंड और लेजर विच्छेदन का कार्टून दृश्य। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51168/51168fig1highres.jpg" target="_blank">बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a> 
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51168/51168fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51168/51168fig2.jpg"> चित्रा 2। नीला बी दाग मोटर न्यूरॉन सेल निकायों के एक लेजर विच्छेदन की छवियों से पहले और बाद में । ए)एक दागदार खंड के वेंट्रल सींग का एक हिस्सा। चार बड़े, गहरे दाग कोशिकाओं पर ध्यान दें। कुछ हल्के दाग और कुछ हद तक छोटी कोशिकाएं भी हैं, जो मोटर न्यूरॉन्स नहीं हैं (एंटी-चैट एंटीबॉडी स्टेनिंग द्वारा पुष्टि की गई; नहीं दिखाया गया है, लेकिन बंदोपाध्याय2देखें) और जिन्हें विच्छेदन के लिए नहीं चुना जाएगा। कई छोटे, काले धब्बे शायद न्यूरोनल प्रक्रियाएं (डेंड्राइट्स और एक्सॉन) हैं, लेकिन इसकी पुष्टि नहीं की गई है। ख)प्रकाश कलम के साथ उल्लिखित चार सेल निकाय। ध्यान दें कि रूपरेखा बारीकी से कोशिकाओं के हाशिए का पालन करें, उन दोनों के बीच एक ंयूनतम दूरी के साथ । यह अंतर प्रत्येक माइक्रोस्कोप और लेजर के लिए अनुभवजन्य रूप से स्थापित किया जाना चाहिए। सॉफ्टवेयर व्यक्तिगत न्यूरॉन्स, जो कितने एकत्र किया गया है की ट्रैक रखने को सरल संख्या । सी और डी)लेजर कट जाने के बाद और सेल निकायों वाले टुकड़े संग्रह टोपी में गिर गए हैं। ध्यान दें कि पीछे छोड़ा गया छेद रूपरेखा से कुछ बड़ा है और अनियमित है। यह ऊतक की स्थानीय संरचना के आधार पर लेजर बीम की चौड़ाई और इसकी थोड़ी चर काटने की दक्षता को दर्शाता है। इसके अलावा स्पष्ट लेजर की वजह से स्थानीय हीटिंग क्षति के कारण प्रत्येक छेद आसपास के अंधेरे ऊतकों की रिम है । 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51168/51168fig2highres.jpg" target="_blank">बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51168/51168fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51168/51168fig3.jpg"> चित्र 3। एलएमडी नमूनों से तैयार आरएनए की अखंडता का इलेक्ट्रोफोरेटिक विश्लेषण। A)उपरोक्त प्रोटोकॉल द्वारा ~ 4,000 मोटर न्यूरॉन सेल निकायों से तैयार आरएनए के 1 माइक्रोल एलिकोट का विश्लेषण माइक्रोकैपिलरी इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा माइक्रोफ्लुइडिक्स चिप पर किया गया था। इलेक्ट्रोफेरोग्राम दिखाया गया है, जिसमें प्रमुख राइबोसोमल आरएनए चोटियां हैं। दाईं ओर जेल की एक छवि है। B)आकार मानकों का इलेक्ट्रोफेरोग्राम दिखाया गया है, सही करने के लिए इसी जेल लेन के साथ । इंस्ट्रूमेंट सॉफ्टवेयर ने इस नमूने के लिए 9.8 की रिन की गणना की और 4.9 एनजी/माइक्रोन की एकाग्रता की गणना की। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51168/51168fig3highres.jpg" target="_blank">बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>

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Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

उच्च गुणवत्ता वाले कुल आरएनए को 70% इथेनॉल में नीला बी के साथ रीढ़ की हड्डी के वर्गों को धुंधला करने के बाद लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन द्वारा माउस रीढ़ की हड्डी मोटर न्यूरॉन्स के सेल निकायों से तैयार किया गया है। आरएनए-सेक्यू और क्यूआरटी-पीसीआर द्वारा डाउनस्ट्रीम आरएनए विश्लेषण की अनुमति देने के लिए पर्याप्त आरएनए (~ 40-60 एनजी) 3000-4000 मोटर न्यूरॉन्स से बरामद किया जाता है।

लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन द्वारा माउस स्पाइनल कॉर्ड मोटर न्यूरॉन सेल निकायों से ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण के लिए आरएनए का उत्पादन

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

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लेजर कैद की Microdissection ड्रोसोफिला परिधीय न्यूरॉन्स

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

कुल शाही सेना अलगाव और डाउनस्ट्रीम अगली पीढ़ी के अनुक्रमण और जीन एक्सप्रेशन प्रोफाइलिंग के लिए कैद गैर अलहदा माउस ब्रेन क्षेत्र के Microdissection के लिए लेजर माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

संस्कृति में विभेदित मानव Neuroprogenitor कोशिकाओं से न्यूरॉन्स की लेजर कब्जा MICRODISSECTION

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

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zebrafish<em&gt; सीटू</em&gt; रीढ़ की हड्डी रीढ़ की हड्डी में संवेदी और मोटर न्यूरॉन्स से electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए तैयारी

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Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

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