Name: production of rna for transcriptomic analysis from mouse spinal cord motor neuron cell bodies by laser capture microdissection
Uploaded: 2014-01-13T14:15:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить Джорджа Фарра и членов лаборатории Хорвича за полезные дискуссии. Эта работа была поддержана Медицинским институтом Говарда Хьюза.

<ol>
	<li>Zhu, J., Nie, S., Wu, J., Lubman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+proteomic+profiling+of+frozen+pancreatic+CD24++adenocarcinoma+tissues+by+immuno-laser+capture+microdissection+and+nano-LC-MS/MS.">Target proteomic profiling of frozen pancreatic CD24+ adenocarcinoma tissues by immuno-laser capture microdissection and nano-LC-MS/MS.</a> J. Proteome. Res. , (2013).</li><li>Bandyopadhyay, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+profiling+of+spinal+cord+motor+neurons+from+a+presymptomatic+SOD1+ALS+mouse..">RNA-Seq profiling of spinal cord motor neurons from a presymptomatic SOD1 ALS mouse..</a> PLoS ONE. 8 (1), 10-1371 (2013).</li><li>Shea, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+in+situ+cytophotometric+estimation+of+absolute+amount+of+ribonucleic+acid+using+azure+B1.">A method for in situ cytophotometric estimation of absolute amount of ribonucleic acid using azure B1.</a> J. Histochem. Cytochem. 18 (2), 143-152 (1970).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+guidelines:+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clin. Chem. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Mol. Biol. 7, (2006).</li><li>Doebler, J. A., Rhoads, R. E., Anthony, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+RNA+in+Pick's+and+Alzheimer's+diseases.+Comparison+of+disease-susceptible+and+disease-resistant+cortical+areas.">Neuronal RNA in Pick's and Alzheimer's diseases. Comparison of disease-susceptible and disease-resistant cortical areas.</a> Arch. Neurol. 46 (2), 134-137 (1989).</li><li>Lobsiger, C. S., Boill&#233;e, S., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+from+different+SOD1+mutants+dysregulates+the+complement+system+and+the+neuronal+regenerative+response+in+ALS+motor+neurons.">Toxicity from different SOD1 mutants dysregulates the complement system and the neuronal regenerative response in ALS motor neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (18), (2007).</li><li>Ferraiuolo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+of+the+cellular+pathways+involved+in+the+adaptation+to+and+progression+of+motor+neuron+injury+in+the+SOD1+G93A+mouse+model+of+familial+ALS.">Microarray analysis of the cellular pathways involved in the adaptation to and progression of motor neuron injury in the SOD1 G93A mouse model of familial ALS.</a> J. Neurosci. 27 (34), 9201-9219 (2007).</li><li>Sturm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+protocol+for+laser+microdissection+of+human+pancreatic+islets+from+surgical+specimens.">Improved protocol for laser microdissection of human pancreatic islets from surgical specimens.</a> J. Vis. Exp. 6 (71), (2013).</li><li>Burbach, G. J., Dehn, D., Nagel, B., Del Turco, D., Deller, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+of+immunolabeled+astrocytes+allows+quantification+of+astrocytic+gene+expression.">Laser microdissection of immunolabeled astrocytes allows quantification of astrocytic gene expression.</a> J. Neurosci. Methods. 138 (1-2), 141-148 (2004).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+aggregation+despite+chaperone+associations+of+a+mutant+SOD1-YFP+in+transgenic+mice+that+develop+ALS.">Progressive aggregation despite chaperone associations of a mutant SOD1-YFP in transgenic mice that develop ALS.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (5), 1392-1397 (2009).</li></ol>

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Наиболее значительным показателем успеха этого протокола для производства общей РНК с помощью лазерного микропересасывания ломтиков спинного мозга является значение RIN5. Для образцов РНК из более высоких эукариот значения выше 8,5 регулярно дают высококачественное секвенирование и данные qRT-PCR. Если урожайность низкая, но качество высокое, повторите препарат. Если целостность ниже (даже 7,5-8), однако, лучше найти источник проблемы и попробовать еще раз. Есть много шагов, где что-то может пойти не так, но на самом деле только два источника проблемы - эндогенное загрязнение RNase или экзогенного загрязнения RNase. Первый из них может быть решен на практике, так что время от жертвоприношения мыши до замораживания его O.C.T-встроенный шнур сводится к минимуму. Другой момент в протоколе, где эндогенные RNase может способствовать плохой результат во время подготовки ломтиков. Каждый срез должен быстро прилипать к комнатной температуре ПЕН-слайда, но он будет таять (О.C.Т. становится ясно). Чем быстрее ломтик может быть перерезаны, тем лучше. Криостат, который мы используем, имеет плоские поверхности внутри камеры, которые находятся на -20 градусов по Цельсию, которые мы используем, чтобы быстро заморозить ломтик. Найти аналогичное место в криостат используется и убедитесь, что срез становится непрозрачным снова быстро.
Отслеживание источников экзогенных RNase может быть трудно, потому что Есть так много возможностей. Единственными реагентами, которые используются не только без RNase, являются O.C.T. и Azure B. Если Azure B раньше выполнялся удовлетворительно, попробуйте свежую бутылку O.C.T., хотя этот реагент никогда не был проблемой. Реагенты без RNase также могут быть заменены, даже у другого поставщика. Гораздо более вероятным источником является следователь. В дополнение к тщательной очистке рабочей зоны, часто полезно, чтобы другой член лаборатории следовать вместе и наблюдать все шаги в процедуре. Даже если это тот, кто обычно не выполняет эту процедуру, свежий набор глаз может забрать в противном случае незамеченным источником загрязнения.
Расширение этого протокола для восстановления РНК из других клеток спинного мозга, из клеток спинного мозга от других видов, или от конкретных типов клеток в других органах потребует изменений в нескольких областях, направленных на достижение четкой идентификации клеток, представляющих интерес при одновременном прекращении, или, по крайней мере, минимизации, влияние эндогенных RNase. В протоколе здесь, быстрое удаление и замораживание шнура, в сочетании с окрашиванием Azure B в 70% этанола, позволило как минимизации деградации РНК и легко идентификации моторных нейронов клеток органов. Azure B является устоявшимся гистохимическим пятном для нейронов, которое, как представляется, связываютсяс РНК 3 и был использован для оценки содержания РНК нейронов в образцах вскрытия тканей мозга у пациентов с нейродегенеративнымзаболеванием 6. Примечательно, что окрашивание Azure B не повлияло ни на целостность очищенной РНК, ни на ее способность быть обращенным вспять и проанализированным. Другие красители, такие как cresylфиолетовый 7 и толуидинсиний 8 были использованы в аналогичных протоколах LMD. Сбор тел клеток непосредственно в гуанидин тиоцианат решение, как они были вскрыты при условии, последний шаг, который привел к обычному восстановлению нетронутыми РНК.
Аналогичные подходы можно предусмотреть и для других клеток и органов, признавая, что определение клеток, представляющих интерес при минимизации или, желательно, предотвращение деградации РНК эндогенными РНК является критическим требованием для успешного анализа. В тканях, которые имеют высокий уровень RNase, таких как поджелудочная железа, быстрая обработка и низкая температура были объединены, чтобы позволить восстановление РНК из β-клеток, воспользовавшись их естественной аутофторесценции длявизуализации 9. Процедуры с использованием антител окрашивания для идентификации также былизарегистрированы 10, но не были полностью успешными в наших руках. Наконец, многие модели мыши доступны, которые выражают флуоресцентные белки синтеза(т.е. GFP, YFP, RFP) в клетках, представляющих интерес, которые могут быть использованы для их идентификации в тканях разделов на микроскоп LMD. В самом деле, штаммы мыши мы проанализировали с помощью этого протокола выразить синтез белка между SOD1 и YFP11, и их спинного мозга двигательных нейронов очень флуоресцентные. Мы не смогли, однако, найти набор этанола моет и / или обезвоживания условиях, которые будут одновременно удалить O.C.T., подавляют RNase деятельности, и последовательно поддерживать достаточную флуоресценцию YFP, чтобы визуализация моторных нейронов и их восстановления LMD. Возможно, новый флуоресцентный белок или вариант доступных, который поддерживает флуоресценцию в органических растворителей можно найти, чтобы преодолеть это ограничение.

В тканях млекопитающих, состоящих из нескольких различных типов клеток, появление лазерного захвата микродиссекции (LMD) приборов предоставила возможность выбрать конкретный тип клеток для анализа на уровне РНК или белка. В настоящее время методы усиления и секвенирования следующего поколения позволяют использовать пул общей РНК из нескольких тысяч ячеек для получения относительно тщательной инвентаризации транскриптома, включая оценку относительных уровней РНК и идентификацию различных сращиваемых форм. На сегодняшний день протеомический анализ нескольких тысяч клеток будет достигать вниз через только более обильные виды. Например, мы определили < 1000 из наиболее распространенных белков из 3000-4000 моторных нейронов клеток тела (не показано), и Чжу и коллеги недавно сообщили выявления 2665 белков из 15000 опухолевыхклеток 1. Однако с дальнейшим развитием массовой спектрометрии, вероятно, такие анализы будут распространяться на гораздо большую глубину.
Здесь мы представляем специальный протокол, используемый для LMD моторных нейронных клеток органов из спинного мозга мышей, а затем препарат РНК. Этот протокол был использован в контексте сравнения РНК от моторных нейронов предсимптомных трансгенных трансгенных мутантов супероксид дисмутазы (SOD)1 боковой амиотрофический склероз (ALS) мышей с РНК, подготовленных из дикого типа SOD1 трансгенного штамма как РНК-сек и qRT-PCRпроверки 2. Примечательно, что моторные нейроны, в передней рог серого вещества в спинном мозге, составляют <10% от общей популяции клеток, окруженных морем астроцитов, и как таковой, их транскрипционные профиль не может быть легко деконволюционных исследований всего мозга. Таким образом, подход к лазерному захвату идеально подходит для анализа экспрессии РНК в этих клетках, при этом физиология сохраняется путем быстрого и замораживания шнура после краткой интракардиарной солевой перфузии. Моторные нейроны сомата являются большими и, таким образом, легко обнаружить, здесь с помощью красителя, который имеет сильное сродство кнейронам 3. Кроме того, при таком размере эти клетки обеспечивают относительно большое количество РНК на захваченную клетку. Процедура, используемая, как описано ниже, может быть легко скорректирована для получения других типов нейронных клеток, а также потенциально других типов клеток, специально определенных либо методы окрашивания красителя или окрашивания антителами.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">Ketamine</td>
			<td style="width:195px;">Webster Veterinary</td>
			<td style="width:155px;">26637041101</td>
			<td style="width:339px;">Any source approved by the institutional veterinary service</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">Dissection tools (scissors, forceps,&#160;etc.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:339px;">Any convenient source of high-quality dissection instruments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">Cryostat&#160;</td>
			<td>Leica Microsystem</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td style="width:339px;">Other cryostats should be suitable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">LMD6000 B</td>
			<td>Leica Microsystem</td>
			<td></td>
			<td style="width:339px;">Other LMD systems have not been tested</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">RNase-free PEN-membrane 2 &#956;m slides&#160;</td>
			<td>Leica Microsystem</td>
			<td>11505189</td>
			<td style="width:339px;">Other slide types have been tested and do not perform well</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:268px;">RNeasy Micro kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td style="width:339px;">Any kit that uses guanidine thiocyanate lysis buffer and has been tested for recovering small quantities of RNA can be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">Agilent 2100 BioAnalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939A</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">Azure B Certified&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>190520</td>
			<td style="width:339px;">Critical! Product from any source has to be tested before use for its ability to maintain RNA integrity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">PBS</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>D8537</td>
			<td style="width:339px;">Any reliable source of RNase-free PBS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">RNA Ethanol 70% (made with DEPC treated water)</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB04010-00500</td>
			<td style="width:339px;">Any reliable source, can be lab-made</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">Water, RNase-free, Endotoxin tested (treated with DEPC to eliminate RNase)</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB02128-00500</td>
			<td style="width:339px;">Any reliable source, can be lab-made</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">RNase AWAY</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>10328-011</td>
			<td style="width:339px;">Other similar RNase removal reagents, such as RNaseZAP (also from Invitrogen) can be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">2-Methylbutane&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78-78-4</td>
			<td style="width:339px;">Any source</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">Maxymum Recovery microfuge tubes (0.6 and 1.5 ml) and pipette tips&#160;</td>
			<td>Axygen&#160;</td>
			<td>311-03-051 &#38; 311-09-051</td>
			<td style="width:339px;">Ultra-low retention, RNase free tubes and tips; test other manufacturer&#39;s products before using</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">O.C.T. Compound</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">Cryomold Intermediate Size</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4566</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">Lab wipes (Kimwipes)</td>
			<td>KIMTECH</td>
			<td>34155</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of rna for transcriptomic analysis from mouse spinal cord motor neuron cell bodies by laser capture microdissection

Подготовка высококачественной РНК из клеток, представляющих интерес, имеет решающее значение для точного и содержательного анализа транскрипционных различий между типами клеток или между одним и тем же типом клеток в области здравоохранения и болезней или после фармакологического лечения. В спинном мозге, такой препарат от моторных нейронов, цель интереса во многих неврологических и нейродегенеративных заболеваний, осложняется тем, что двигательные нейроны составляют <10% от общей популяции клеток. Для решения этой проблемы была разработана микродиссеция лазерного захвата (LMD). Здесь мы описываем протокол для быстрого восстановления, замораживания и секции спинного мозга мыши, чтобы избежать повреждения РНК эндогенными и экзогенными RNases, а затем окрашивание с Azure B в 70% этанола для идентификации моторных нейронов при сохранении эндогенных RNase ингибируется. LMD затем используется для захвата окрашенных нейронов непосредственно в гуанидин тиоцианат лиза буфера, поддержание целостности РНК. Стандартные методы используются для восстановления общей РНК и измерения ее целостности. Этот материал может быть использован для анализа стенограмм РНК-сек и qRT-PCR ниже по течению.

Протокол, изложенный выше, и на рисунке 1 должен производить 50 нг или более от общего количества РНК с RIN >8,5 от 3000-4000 спинного мозга двигательных нейронов органов, расчлененных из 9-10 20 мкм ломтиками около 20 ПЕН слайдов. Поскольку это количество слайдов составляет менее 10% от O.C.T.-встроенный блок спинного мозга мыши, можно вернуться в блок, который был сохранен при -80 градусов по Цельсию, и сократить больше ломтиков, чтобы пройти через еще один раунд подготовки РНК. Если для анализа требуется большее количество РНК, то лучше сделать только количество слайдов (например, 20) за один раз, которые могут быть обработаны путем вскрытия и подготовки РНК в течение нескольких дней, а затем сделать больше слайдов для второго раунда и объединить продукты. Не забудьте проверить RIN каждого препарата, чтобы избежать объединения хороший с плохим. Методы РНК-сек становятся все более чувствительными, а новые технологии ПЦР обещают более высокую чувствительность, чем нынешние. Таким образом, меньше РНК от меньшего количества нейронных клеток органов потребуется, что позволяет большую глубину последовательности и более полную проверку интересных хитов. С другой стороны, полное соблюдение рекомендаций МИЗЭ для анализа и проверки4 qRT-PCR может потребовать больших сумм для обеспечения необходимых контрольных реакций для низкоо изобилия РНК.
На рисунке 2 показана типичная серия изображений части брюшного рога спинного мозга после окрашивания и вскрытия Azure B. В панели А, большие, темно окрашенные тела клеток моторных нейронов, подтвержденных анти-Чатантитела окрашивания 2, и легко отличить от небольших соседних клеток. Панель B показывает ту же область с отдельными телами клеток, очерченными световой ручкой и проумеровано программным обеспечением микроскопа. Очертания внимательно следить за полями клеток органов, с небольшим пособием для резки шириной лазера. Это расстояние должно быть определено для каждого параметра мощности лазера, чтобы свести к минимуму включение посторонних материалов, избегая при этом потери цитозола моторных нейронов. Панели C и D показывают раздел после того, как лазер разрезается и отдельные тела клеток упали в крышку коллекции. Обратите внимание, что режущие поля точно не следовать свету контур пера в панели C, но в значительной степени остаться за его пределами. Эта неровностями очевидна в панели D, как и затемненная область вокруг каждого разреза, которая отражает тепловое повреждение ткани, вызванное лазером. Из-за этого, если два тела клеток очень близко друг к другу, лучше изложить их для одного разреза, а не пытаться сократить их отдельно и потерять некоторые РНК тепла повреждения в их области ближнего контакта.
На рисунке 3 показаны типичные результаты электрофоретического анализа целостности РНК образца РНК, подготовленного из 4000 тел моторных нейронов мыши, собранных LMD. Верхняя панель — это электроферограмма, вырабатываемая 1 мл общей РНК; вставка справа является изображением геля. В обоих, обратите внимание на видные рибосомные пики РНК. Нижняя панель является электроферограммой полосы, содержащей стандарты размера РНК. Программное обеспечение для анализа вычислило RIN 9,8 для этой выборки, с концентрацией 4,9 нг/дл. В общей сложности 13 зл этого решения было доступно после анализа, обеспечивая 64 нг РНК для вниз по течению qRT-PCR проверки суммы стенограммы. Для типичного анализа qRT-PCR умеренно обильные стенограммы, 0,15-0,20 нг от общего КОЛИЧЕСТВА достаточно для получения точнойколичественной оценки 2, так что количество РНК, доступных из этого препарата достаточно для проверки ряда стенограмм с несколькими наборами грунтовки,как рекомендуется 4. Конечно, большие объемы входной РНК могут быть использованы для проверки редких стенограмм. Эта сумма также более чем достаточна для подготовки библиотеки и РНК-сек следующего поколения.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51168/51168fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51168/51168fig1.jpg"> Рисунок 1. Обзор производства ломтик спинного мозга и лазерного захвата микропересасывания спинного мозга двигательных нейронов клеток органов. A)Основные шаги в производстве ломтиков и окрашивания. B) Мультфильм зрения спинного мозга раздел и лазерного вскрытия. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51168/51168fig1highres.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.</a> 
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51168/51168fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51168/51168fig2.jpg"> Рисунок 2. До и после изображения лазерного вскрытия Azure B окрашенных моторных нейронов клеток органов. A)Часть брюшного рога окрашенной секции. Обратите внимание на четыре больших, темно окрашенных клеток. Есть также несколько слегка окрашенных и несколько меньших клеток, которые не являются моторными нейронами (подтверждено анти-Чат антитела окрашивания; не показано, но см. Bandyopadhyay2) и которые не будут выбраны для вскрытия. Многие небольшие темные пятна, вероятно, являются нейронными процессами (дендриты и аксоны), но это не было подтверждено. B)Четыре тела клеток, очерченные световой ручкой. Обратите внимание, что контуры внимательно следуют за полями ячеек с минимальным расстоянием между ними. Это расстояние должно быть установлено эмпирически для каждого микроскопа и лазера. Программное обеспечение номера отдельных нейронов, что упрощает отслеживание того, сколько было собрано. C и D) После того, как лазер разрезается и части, содержащие тела клеток упали в крышку коллекции. Обратите внимание, что отверстие, оставленное позади, несколько больше контура и является нерегулярным. Это отражает ширину лазерного луча и его слегка переменную эффективность резки в зависимости от местного состава ткани. Также очевидным является край затемненной ткани, окружающей каждое отверстие из-за повреждения местного отопления, вызванного лазером. 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51168/51168fig2highres.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51168/51168fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51168/51168fig3.jpg"> Рисунок 3. Электрофоретический анализ целостности РНК, подготовленный из образцов ЛМД. A) Алицит 1 мкл РНК, подготовленный из 4000 моторных нейронных клеток тела по вышеупомянутому протоколу, был проанализирован микрокапильярной электрофорезом на микрофлюиде чипа. Электроферограмма показана, с выдающимися рибосомных пиков РНК. Справа находится изображение самого геля. B) Показана электроферограмма стандартов размера с соответствующей полосой геля справа. Программное обеспечение прибора вычислило RIN 9.8 для этой выборки и концентрации 4.9 ng/l. Нажмите <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51168/51168fig3highres.jpg" target="_blank">здесь, чтобы просмотреть большее изображение.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection at JoVE.com

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Высококачественная общая РНК была подготовлена из клеточных тел моторных нейронов спинного мозга мыши путем лазерного захвата микроперемида после окрашивания секций спинного мозга с Azure B в 70% этанола. Достаточное количество РНК (40-60 нг) восстанавливается у 3000-4000 моторных нейронов, чтобы позволить вниз по течению анализ РНК РНК-сек и qRT-PCR.

Производство РНК для транскриптомного анализа от мыши спинного мозга Моторные нейронные клетки органов лазерного захвата microdissection

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Лазерная Захват микродиссекции Drosophila Периферийные Нейроны

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Номера для лазерной микроскопии Захват подход к микродиссекция дискретных областей мозга мыши для полной изоляции РНК и переработки нового поколения Секвенирование и профилирование экспрессии генов

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Лазерная Захват микродиссекция нейронов от Дифференцированный человека нейрональные клетки в культуре

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

Секвенирование РНК анализ дифференциальных экспрессии генов в электропорации Чик эмбрионального спинного мозга

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

рерио<em&gt; В Ситу</em&gt; Спинной мозг Подготовка к Электрофизиологическим записям из спинномозговых сенсорных и двигательных нейронов

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

Стереотаксическая Атлас руководствуясь лазерная захватить Microdissection регионов мозга, пострадавших от травмы

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

Оптимизации лазер захват Microdissection для изоляции кишечных ганглиев от свежемороженые тканей человека

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Изоляция взрослых спинной ядра для массивно параллельной сингл ядро РНК последовательности

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Understanding Motor Neuron Responses to Spinal Cord Stimulation

The Ex vivo Preparation of Spinal Cord Slice for the Whole-Cell Patch-Clamp Recording in Motor Neurons During Spinal Cord Stimulation

Advancing Spinal Cord Stimulation - Exploring the Cellular Responses of Motor Neurons Through Patch-Clamp Electrophysiology (Video) | JoVE

Подготовка ex vivo среза спинного мозга для регистрации цельноклеточного патча-зажима в двигательных нейронах при стимуляции спинного мозга

Spinal cord stimulation (SCS) can effectively restore locomotor function after spinal cord injury (SCI). Because the motor neurons are the final unit to ...

Efficient Extraction of Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord

Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord For In Vitro Assays and Transcriptomic Studies

Isolation of Glial Cells from the Adult Mouse Spinal Cord (Video) | JoVE

Выделение чистых астроцитов и микроглии из спинного мозга взрослой мыши для анализов in vitro и транскриптомных исследований

Astrocytes and microglia play pivotal roles in central nervous system development, injury responses, and neurodegenerative diseases. These highly dynamic ...