Name: 2d and 3d chromosome painting in malaria mosquitoes
Uploaded: 2014-01-06T17:30:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about 2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل من خلال منحة من المعاهد الوطنية للصحة 1R21AI094289 إلى إيغور ف. شاراخوف

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

هناك خطوات متعددة حاسمة لتضخيم الحمض النووي بنجاح من عينات كروموسوم البوليتين المصححة. يستخدم البروتوكول استخدام LCM ، وهي طريقة تزيد من الكفاءة الشاملة وتقلل من التعرض للحمض النووي الأجنبي عن طريق إزالة تفاعل الأدوات المادية مع العينة. ومع ذلك ، فإن تضخيم الحمض النووي الأجنبي لا يزال أكبر عثرة محتملة لهذه التجربة. وبالتالي ، خلال العملية برمتها ، من الضروري الحفاظ على العينات محمية من التلوث. طوال مراحل إعداد الشريحة والتشريح الدقيق ، من الضروري غسل إبر تشريح الإيثانول ، والشرائح ، وقسائم الغطاء ، وكذلك مساحة العمل.  كما ينصح بمعالجة الأشعة فوق البنفسجية لجميع المعدات المعمول بها (الإبر والشرائح والأغطية) قبل الاستخدام.
الغشاء على الشرائح تشريح يجعل انتشار الكروموسومات صعبة للغاية.  من المهم استخدام المزيد من المبيض (نصف إلى زوج كامل من المبيضين) عند إجراء هذه الشرائح ، لتوفير فرصة أكبر للعثور على نواة منتشرة بشكل جيد.  كما يوصى باستخدام الأنسجة الطازجة عند صنع الشرائح ، حيث يبدو أن معدلات التضخيم تنخفض مع تقدم الأنسجة في سن 49 وانتشار الكروموسومات يصبح أكثر تحديا.  إعداد الشرائح للقسمة الدقيقة هو الخطوة الأكثر استهلاكا للوقت في هذا البروتوكول.  يجب أن تنتشر الكروموسومات بشكل جيد لتجنب الاستحواذ العرضي على المواد غير المرغوب فيها.  تلطيخ Giemsa يسمح للمستخدم للتحقق من جودة انتشار مع المجهر النقيض المرحلة قبل استخدام نظام microdissection.
ويتيح الجمع بين التحلل الدقيق والتضخيم الفرصة لاستخراج وتحليل الأجزاء الكروموسومية التي تتراوح أحجامها بين المناطق الصغيرة ذات الأهمية وأغلبية الأسلحة.  يسمح هذا البروتوكول للمستخدم بالحصول على الحمض النووي من مناطق متميزة شكليا مثل الانعكاسات والعصابات euchromatic محددة وinterbands، التيلومريك، المركزية والتكلساتين. يمكن للمستخدم تطبيق مسابير اللوحة المتولدة لفحص الكروموسومات الشاذة ، أو دراسة الأوهام بين الأنواع في loci معينة ، أو توصيف التنظيم المكاني للكروموسومات في نواة ثلاثية الأبعاد سليمة. لتطوير الدهانات الكروموسومية، اخترنا شرائح euchromatic لتجنب تهجين الحمض النووي المتكررة مع مناطق الكروموسومات متعددة. ونتيجة لذلك، حصلنا على لوحة خاصة بالذراع دون استخدام منافس، مثل الحمض النووي الجينومي الكلي أو كسر الحمض النووي C0t-1.
اخترنا استخدام GenomePlex WGA ومجموعات REPLI-G استنادا إلى المراجعات التي قارنت معدل الكفاءة والتسرب من مجموعات تضخيم متعددة 40،44.  وكان أداء المجموعتين أفضل من بين الأساليب المتاحة في كل من معدل التسرب (كان معدل الجينومPlex 12.5٪ مقارنة مع REPLI-g 37.5٪) في 2012. ونسبة العلامات المضخمة (كان لدى GenomePlex معدل تضخيم 45.24٪ مقابل 30.0٪ في REPLI-g) 40.كما قدمت مجموعة GenomePlex كمية أعلى من الحمض النووي ، وبالتالي جعلها مرشحا أفضل لتقنيات المصب المتعددة.  كما تتوفر أيضا مجموعة أدوات لإعادة تضخيم نظام جينومبلس، مما يسمح بمزيد من تضخيم الحمض النووي. ومع ذلك ، من المهم أن نلاحظ أن التضخيم ليس مثاليا.  يبقى الاحتمال أن التضخيم الناجح يمكن أن يدخل أخطاء أو يكون له تحيز نحو loci محددة في الحمض النووي المستهدف. ومن المهم النظر في حجم الجزء النهائي من أساليب تضخيم الجينوم المتاحة.  ينتج عن تجزئة GenomePlex مكتبة ذات أجزاء تتراوح بين 200-500 نقطة أساس ، في حين تنتج مجموعة REPLI-g أجزاء من الحجم حوالي 10-20 كيلوبايت. والتطبيق المقصود لهذا البروتوكول في المصب هو FISH، مما يجعل مجموعة GenomePlex خيارا أكثر جدوى، لأنها توفر حجم الشظايا المطلوب والقدرة على تسمية شظايا الحمض النووي مباشرة من خلال WGA. يجب تجزئة جزيئات الحمض النووي الطويلة التي تنتجها تضخيم REPLI-g في رد فعل وضع العلامات على ترجمة في المصب.
تم تكييف هذا البروتوكول لتضخيم الحمض النووي بنجاح من ذراع كروموسوم بوليتين واحد.  تتطلب البروتوكولات الأخرى تجميع العديد من شظايا الكروموسوم (عادة 10-30) من أجل تضخيم العينة بنجاح 7و11و28و40.  على الرغم من أن تجميع الكروموسومات المتعددة ممكن باستخدام طريقتنا ، إلا أن زيادة احتمال تلوث العينة يؤكد على أهمية بدء التجربة مع أقل عدد ممكن من الكروموسومات. إذا لم تتوفر كروموسومات البوليتين، يمكن تكييف بروتوكولنا للاستخدام في الكروموسومات الميتوتيكية. قد يكون من الضروري، ومع ذلك، لتجميع الكروموسومات 10-15 ميتوتيك قبل تضخيم لأسماك ناجحة 11. التحيز التضخيم هو أقل مع كميات عالية من بدء قالب الحمض النووي 50. توفر كروموسومات البوليتين حوالي 512 نسخة من تسلسل الحمض النووي الواحد و 1024 نسخة من تسلسلين متجانسين للحمض النووي.  وبالتالي، فإن تجميع الكروموسومات ميتوتيك تساعد على زيادة الجودة الشاملة للمنتج الحمض النووي بعد تضخيم.
هذا الإجراء له العديد من الاستخدامات المحتملة في الدراسات الجينية الخلوية والجينومية. هنا، استخدمنا دهانات الكروموسوم لإنشاء المراسلات بين شرائح euchromatic من الأسلحة الكروموسوم البوليتين والميتوتيك في An. غامبيا. ويمكن تطبيق نفس المسابير اللوحة على توصيف الخلوية من خطوط الخلية الغامبية. إعادة ترتيب الجينوم واسعة النطاق والتغيرات في أعداد الكروموسومات هي السمات الشائعة لخطوط الخلية 51،52. تم الكشف عن الأنوبلويدية، والتعددية، وإعادة ترتيب الكروموسومات مثل عمليات النقل، والانقلابات، والحذف، والكروموسومات الحلقية في خطوط خلايا البعوض المختلفة 53،54. وقد أظهرت الملاحظات الجينية الخلوية الكلاسيكية 55 ورسم الخرائط الفيزيائية 56 حدوث انتقالات كروموسومية كاملة الذراع في تطور بعوض الملاريا. لذلك، يمكن استخدام المواد الممسوصة بالميكروستات جنبا إلى جنب مع تجارب FISH لمقارنة التماثل في المناطق الكروموسومية بين الأنواع. لقد نجحنا في تنفيذ 3D FISH مع مسبار 2R-painting على كروموسومات البوليتين في خلايا ممرضة المبيض الكاملة. هذه الطريقة سوف تسهل تتبع مسارات الكروموسوم ودراسة العمارة النووية في أنوفيليس. تقنيات مثل dna genotyping 57،58، الجيل التالي من تسلسل الجينوم 26،27، المادية وتطوير خريطة الربط ، وتوليد من تحقيقات للكروموسوم اللوحة 33،59 يمكن أن تستفيد جميع من التشحم الدقيق الذراع والمنطقة محددة. من خلال الجمع بين تكنولوجيا LCM والنهوض WGA خلية واحدة، ونحن نظهر كفاءة، وطريقة عملية لإنتاج كميات معقولة من الحمض النووي من ذراع كروموسوم البوليتين واحد.

الكروموسوم اللوحة هي تقنية مفيدة لدراسة تطور karyotypes 1-5 وتصور التشوهات الوراثية الخلوية عن طريق التهجين من الحمض النووي الصبغي المسمى فلوريا 1،6-8. يتم تطبيق هذه الطريقة أيضا على دراسة الديناميات ثلاثية الأبعاد لأقاليم الكروموسوم في التنمية 9 وعلم الأمراض 10. وتستخدم الدهانات الكروموسومية المسماة بشكل تفاضلي لتصور الفردية mitotic 11،12، meiotic 13،14، أو interphase غير البوليتين 15،16 وpolytene 9،11،17 الكروموسومات. ومن شأن وجود بروتوكول بسيط وقوي للحصول على دهانات الكروموسومات أن يكون مفيدا جدا في توسيع نطاق هذه التقنية لتشمل الكائنات الحية غير النموذجية، مثل البعوض. مجمع أنوفيليس غامبيا هو مجموعة من سبعة بعوض لا يمكن تمييزه من الناحية الشكلية يختلف في السلوك والتكيف، بما في ذلك القدرة على نقل الملاريا.  هذه البعوض بمثابة نموذج ممتاز لفهم أفضل لتطور الأنواع ذات الصلة الوثيقة التي تختلف اختلافا كبيرا في قدرتها ناقلات.  وقد أجريت معظم الدراسات الجينية الخلوية في بعوض الملاريا باستخدام كروموسومات متطورة وعالية تعدد الأضلاع (تمت مراجعتها في 18،19). سمحت أنماط الربط القابلة للقراءة لكروموسومات البوليتين للباحثين بإظهار الارتباط بين التقلبات المتعددة الأشكال والتكيفات البيئية في Anopheles gambiae 20. أيضا، وقد تم وصف الأنسجة محددة 21 والأنواع محددة 22 ملامح منظمة كروموسوم البوليتين 3D في مجمع An. macullipennis. ومع ذلك، يمكن أن توفر دراسة الكروموسومات ميتوتيك معلومات هامة إضافية. على سبيل المثال، ارتبط مستوى أعلى من تعدد الأشكال التريلوكروماتين لوحظ في الكروموسومات ميتوتيك مع انخفاض نشاط التزاوج والخصوبة في An. gambiae 23. قد يكون من الصعب تحديد المراسلات بين الأجزاء euchromatic من أذرع الكروموسومات المتعددة والميتوتيك فقط من خلال مقارنة أطوالها النسبية. وذلك لأن هيتيركروماتين تشكل جزءا كبيرا من الكروموسومات ميتوتيك, ولكن ممثلة تمثيلا ناقصا في الكروموسومات البوليتين 24. ومن شأن توافر الدهانات الكروموسومية لطاعوض الملاريا أن يسمح للباحثين بتوسيع الدراسات الجينية الخلوية بشكل كبير من خلال إدراج أنواع إضافية، مع تقليل التكلفة والوقت بشكل كبير في تحليلات تطور karyotypic والديناميات ثلاثية الأبعاد للكروموسومات في هذه المجموعة من الحشرات المهمة وبائيا.
من أجل الحصول على مساحات كبيرة من الكروموسومات ، أصبح الالتصاط الدقيق تقنية متكاملة للتلاعب وعزل مناطق محددة ذات أهمية للمكمل الكروموسومي.  عندما يقترن تضخيم الجينوم كله (WGA)، يؤدي التشحم الدقيق في تطبيقات المصب قوية بما في ذلك FISH 11،12 وتسلسل الجينوم الجيل القادم 25-27. في السابق ، كانت التقنية تتطلب استخدام إبر التشتيت الدقيق المتخصصة التي كان لا بد من التحكم فيها يدويا من قبل مستخدم متمرس 28.  أدى تقدم الالتصيع الدقيق لالتقاط الليزر (LCM) إلى أداة مبسطة أكثر ملاءمة لعزل الخلايا المفردة 29أو30 أو الكروموسومات الفردية 31-33 مع تقليل خطر التلوث. هذا النهج يسمح للمستخدم لدراسة التغايريات الوراثية والتشوهات الكروموسومية التي تحدث في خلايا واحدة، بدلا من المناظر الطبيعية توافق الآراء التي تنتج عن تجميع خلايا متعددة معا 34-36. وقد استخدمت أساليب متعددة لتضخيم الحمض النووي المنتجة من التشتيت الدقيق.  DOP-PCR، وهي تقنية مفيدة لتضخيم تسلسل متكررة للغاية، وقد استخدمت لتضخيم الكروموسومات microdissected من الأنواع بما في ذلك جندب 37،ثعبان البحر الشوكي 38،والبلطي النيل 39.  في الآونة الأخيرة ، أصبحت مجموعة GenomePlex WGA4 أحادية الخلية القائمة على PCR والتضخيم المتعدد القائم على الإزاحة (MDA) Repli-G Single Cell أدوات قيمة للتجارب التي تنطوي على التحليل الجيني للخلايا البشرية الفردية وكذلك الكروموسومات40-42، بما في ذلك أنظمة الكروموسوم B في الجنادب 37 والجراد 43. هذه المجموعات اثنين من كل مزايا وعيوب، ولكن تفوقهم الواضح فوق غيرها من أنظمة التضخيم المتاحة وقد ثبت 44.
كمية الحمض النووي التي يمكن الحصول عليها من كروموسوم واحد أو جزء كروموسوم أقل بكثير من تلك الموجودة في نواة كاملة. ولذلك فإن التجسيد الدقيق والتضخيم والتحليل اللاحق لكروموسوم واحد أكثر تحديا بكثير ، خاصة في الكائنات الحية ذات الجينوم الصغير كما هو الحال في Drosophila أو Anopheles.  على الرغم من أن الدهانات قد تم تطويرها من كروموسومات صغيرة واحدة للإنسان 33 و دبور 45، فإن تجربة FISH الناجحة تتطلب عدة (على الأقل 10-15) كروموسومات ميتوتيك مبتزة صغيرة لذبابة الفاكهة 11. ومع ذلك، فإن القدرة على microdissect وتضخيم كروموسوم واحد سيكون من المهم ل(1) الحد من فرصة التلوث مع المواد من كروموسوم مختلف، (2) التقليل من عدد الاستعدادات الكروموسومية اللازمة للانصاع المجهري، (3) خفض النيوكليوتيدات والتعددية الهيكلية للعينة المشقوقة في كل من FISH وتسلسل تطبيقات المصب. الكروموسومات البوليتين وجدت في العديد من الأنواع Dipteran توفر فرصة فريدة من نوعها للحصول على كمية أعلى بكثير بدءا من الحمض النووي. كما أنها توفر دقة أعلى وبنية كروموسوم لا يمكن تحقيقها من خلال استخدام الكروموسومات الميتوتيكية. يمكن أن تكون هذه الدقة المضافة حاسمة في تصور إعادة ترتيب الكروموسومات ، وهيكل الكروماتين ، وشرائح الكروموسومات ليتم تقسيمها 28،46.
هنا نقدم إجراء لعزل بكفاءة شريحة euchromatic من ذراع كروموسوم متعدد التين واحد، تضخيم الحمض النووي، واستخدامه في تطبيقات FISH المصب في البعوض الملاريا.  أولا، نحن نطبق LCM لعزل واستخراج ذراع كروموسوم واحد من الشرائح الغشاء المعدة خصيصا. ثانيا، يستخدم WGA لتضخيم الحمض النووي من المواد المجهرية. ثالثا، نحن تهجين الحمض النووي تضخيمها في تجارب FISH لمستحضرات الاسكواش البوليتين 47،ميتافيزي والشرائح الكروموسوم بين المراحل 48،فضلا عن عينات جبل المبيض 3D كله. وقد تم هذا الإجراء لرسم بنجاح غالبية euchromatin في أذرع الكروموسومات من An. غامبيا .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="562">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">A491-212</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Methanol</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:120px;">A412-4</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Propionic acid&#160;</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">402907</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Membrane slides 1.0 PET</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;">415190-9051-000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Buffer tablets &#8220;GURR&#8221;</td>
			<td style="width:112px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">10582-013</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">KaryoMAX Giemsa Stain</td>
			<td style="width:112px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">10092-013</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">ThermoBrite Slide Denaturation/Hybridization System</td>
			<td style="width:112px;">Abbott Molecular</td>
			<td style="width:120px;">30-144110</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Vacufuge vacuum concentrator</td>
			<td style="width:112px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:120px;">22820001</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">Spectroline Microprocessor-Controlled UV Crosslinker XL-1000</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">11-992-89</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:59px;width:191px;">Thermo Scientific NanoDrop</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">ND-2000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">REPLI-g Single Cell Kit</td>
			<td style="width:112px;">Qiagen</td>
			<td style="width:120px;">150343</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:191px;">GenomePlex Single Cell Kit (WGA4)</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">WGA4-10RXN</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">GenomePlex WGA Reamplification Kit (WGA3)</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">WGA3-50RXN</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:191px;">MZ6 Leica stereomicroscope</td>
			<td style="width:112px;">Leica</td>
			<td style="width:120px;">VA-OM-E194-354</td>
			<td style="width:139px;">A different stereomicroscope can be used</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">Olympus CX41 Phase Microscope</td>
			<td style="width:112px;">Olympus</td>
			<td style="width:120px;">CX41RF-5</td>
			<td style="width:139px;">A different phase microscope can be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">PALM MicroBeam Laser Microdissection Microscope</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Thermomixer</td>
			<td style="width:112px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:120px;">22670000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">10x PBS</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:120px;">P5493</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">50x Denhardt&#8217;s solution</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">D2532</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">99% Formamide</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP227500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Dextran sulfate sodium salt</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td style="width:120px;">D8906</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">20x SSC buffer</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:120px;">AM9765</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">ProLong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:120px;">P-36931</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">dATP, dCTP, dGTP, dTTP</td>
			<td style="width:112px;">Fermentas</td>
			<td style="width:120px;">R0141, R0151, R0161, R0171</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Cy3-dUTP, Cy5-dUTP</td>
			<td style="width:112px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:120px;">PA53022, PA55022</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">BSA</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">A3294</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">DNA polymerase I</td>
			<td style="width:112px;">Fermentas</td>
			<td style="width:120px;">EP0041</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">DNase I&#160;</td>
			<td style="width:112px;">Fermentas</td>
			<td style="width:120px;">EN0521</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Spermine</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">S3256-1G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Spermidine</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">S0266-1G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP366-500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP3581</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">EGTA</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">E0396-25G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">PIPES</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">P6757-25G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">EDTA</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">S311-500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Digitonin</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">D141-100MG</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Triton-X100</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP151-100</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">AdhesiveCap 500 clear</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;">415190-9211-000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">QIAamp DNA Micro Kit (50)</td>
			<td style="width:112px;">Qiagen</td>
			<td style="width:120px;">56304</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Genomic DNA Clean and Concentrator Kit</td>
			<td style="width:112px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:120px;">D4010</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">37% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">F79-500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

2d and 3d chromosome painting in malaria mosquitoes

الفلورسنت في التهجين الموقعي (FISH) من مسابير كروموسوم الذراع كله هو تقنية قوية لرسم خرائط المناطق الجينومية ذات الاهتمام، والكشف عن إعادة ترتيب الكروموسومات، ودراسة تنظيم ثلاثي الأبعاد (3D) من الكروموسومات في نواة الخلية. ظهور الليزر التقاط الالتصيع الدقيق (LCM) وتضخيم الجينوم كله (WGA) يسمح بالحصول على كميات كبيرة من الحمض النووي من خلايا واحدة. دفعتنا الحساسية المتزايدة لمجموعات WGA إلى تطوير دهانات الكروموسوم واستخدامها لاستكشاف تنظيم الكروموسوم وتطوره في الكائنات غير النموذجية. هنا، نقدم طريقة بسيطة لعزل وتضخيم شرائح euchromatic من الأسلحة كروموسوم البوليتين واحد من خلايا ممرضة المبيض من البعوض الملاريا الأفريقية Anopheles غامبيا. يوفر هذا الإجراء منصة فعالة للحصول على دهانات الكروموسوم ، مع تقليل الخطر العام لإدخال الحمض النووي الأجنبي إلى العينة. استخدام WGA يسمح لعدة جولات من إعادة تضخيم، مما أدى إلى كميات عالية من الحمض النووي التي يمكن استخدامها لتجارب متعددة، بما في ذلك 2D و 3D FISH. أثبتنا أن الدهانات الكروموسومية المطورة يمكن استخدامها بنجاح لإنشاء المراسلات بين الأجزاء euchromatic من أذرع الكروموسوم البوليتين والميتوتيك في An. gambiae. بشكل عام ، يوفر اتحاد LCM و WGA أحادي الكروموسوم أداة فعالة لإنشاء كميات كبيرة من الحمض النووي المستهدف للدراسات الجينية الخلوية والجينومية المستقبلية.

يصف الشكل 1 إجمالي تدفق عبر البروتوكول الموضحة في هذه المقالة.  يبدأ المستخدم في البداية عن طريق قطع عينات الحمض النووي الكروموسومية من شرائح الغشاء.  يتم استخراج المواد المنقصة وتنقية. ثم يتم تضخيم الحمض النووي المنقى، وإعادة تضخيمه، وتسميته، ثم استخدامه ل FISH لتسمية ينتشر الكروموسوم.
يمكن تقسيم بروتوكول LCM إلى ثلاث خطوات عامة: 1) العثور على الكروموسومات ذات الاهتمام وإعداد المنطقة لقطع(الشكل 2A)،2) قطع والمنجنيق منطقة الكروموسوم ذات الأهمية عن طريق الليزر (الشكل 2B)، و 3) التحقق لتحديد ما إذا كانت العينة هي في الواقع قفزت إلى غطاء لاصق (الشكل 2C). تظهر عملية LCM المستخدمة على كروموسومات البوليتين سلالة An. غامبيا سوا في الفيديو 1. الفيديو تفاصيل العملية برمتها من بدء تشغيل البرنامج ، بما في ذلك وظائف البرنامج الهامة والنصائح.
GenomePlex و REPLI-g مجموعات WGA خلية واحدة المستخدمة في هذا البروتوكول تختلف اختلافا كبيرا في حجم المنتج الناتج، فضلا عن العائد العام.  ويبين الشكل 3 نتائج الكهروفورسيس الهلامي الذي أجري لمجموعات الجينومPlex و REPLI-g، فضلا عن تحديد كمية العينات عن طريق Nanodrop.
وقد استخدمت المواد المجهرية لإنشاء تحقيقات FISH التي تستهدف المناطق euchromatic من الكروموسوم.  يوضح الشكل 4 الأسماك من خمسة تحقيقات ولدت من المواد الممسكتة على كروموسومات البوليتين من An. غامبيا.  تم تسمية أربعة أذرع أوتوسومال بثلاثة فلوروفورس باستخدام مجموعة WGA3: يتم تسمية كروموسوم 3R باللون الأخضر (الفلورسين) ، وكروموسوم 3L في خليط من الأحمر (Cy-3) والأصفر (Cy-5) ، وكروموسوم 2R باللون الأصفر (Cy-5) ، وكروموسوم 2L باللون الأحمر (Cy-3). تم تصنيف كروموسوم X باللون البرتقالي (Cy-3) باستخدام ترجمة للمواد REPLI-g في تجربة منفصلة. لإنشاء المراسلات بين أجزاء euchromatic من الأسلحة الكروموسوم البوليتين والميتوتيك، وقد تم تهجين الدهانات الكروموسوم إلى إنترباز، prophase، بروميتافاس والكروموسومات ميتافايز من An. غامبيا (الشكل 5).  لتصور تنظيم 3D من ذراع كروموسوم البوليتين واحد في نواة الخلية، تم تنفيذ جبل كله FISH على An. غامبيا سوا سلالة خلايا ممرضة المبيض (فيديو 2).  وينظر بوضوح مناطق ذراع الكروموسوم متميزة في نواة مع إنترباتيز(الشكل 5D)وpolytene (فيديو 2) الكروموسومات.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig1.jpg"> الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 تمثيل تخطيطي للإجراءات التجريبية نحو إعداد دهانات الكروموسوم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig1highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض صورة أكبر.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig2.jpg"> الشكل 2 - الأرقام 2- الأرقام التي تم الخطوات الرئيسية في التشجر الدقيق الكروموسوم. أ) قطع بمساعدة الليزر من المنطقة الكروموسومية من الفائدة من خلال الغشاء. ب) يتم تنفيذ الغشاء مع ثقب بعد المنجنيق. ج) وجهة نظر قطعة منجنيق من الغشاء مع جزء الكروموسومات في ذلك تعلق على غطاء لاصق. يشير السهم إلى الهتيروماتين من كروموسوم X الذي بقي على الشريحة. تظهر النجمة قطعة من كروموسوم آخر بقي على الشريحة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig2highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض صورة أكبر.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig3.jpg"> الشكل 3 - الأرقام 3- الأرقام التي يمكن أن صور هلام Agarose تظهر الحمض النووي بعد WGA. أ) انخفاض الوزن الجزيئي (200-500 نقطة أساس) الحمض النووي من الذراع 3R بعد استخدام مجموعات WGA4 و WGA3 GenomePlex. ب) الوزن الجزيئي العالي (10-20 kb) الحمض النووي من الذراع 2L بعد تضخيم REPLI-g. يظهر سلم 100 نقطة أساس في الممرات اليسرى. تظهر الجداول أدناه صور الجل تركيزات الحمض النووي التي تقاس بالانودروب. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig3highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض صورة أكبر.</a>
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig4.jpg"> الشكل 4 - الأرقام 4- الأرقام التي تم ال رسم كروموسومات البوليتين من خلايا ممرضة المبيض في An. gambiae باستخدام أربعة مسابير تم إنشاؤها من مواد مجزرة. تم تصنيف كروموسوم X باللون البرتقالي (Cy-3) من خلال ترجمة لمادة REPLI-g. وسم الذراع 2R باللون الأصفر (Cy-5)؛ الذراع 2L باللون الأحمر (Cy-3)؛ وسم الذراع 3R باللون الأخضر (الفلورسين); وسم الذراع 3L في خليط من الأحمر (Cy-3) والأصفر (Cy-5). تم تصنيف الوسومات التلقائية مع مجموعة تضخيم WGA3. الكروماتين ملطخ باللون الأزرق (DAPI). يتم وضع أسماء الكروموسومات بالقرب من المناطق التيلومريك. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig4highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض صورة أكبر.</a>
<img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig5.jpg"> الشكل 5 - الأرقام 5- الأرقام التي تم رسم الكروموسومات بين المراحل (A) والبروبهاز (B) والبروميتافاس (C) والميتافيزي (D) من أقراص اليرقات الماجينالية لسلالة An. gambiae Mopti باستخدام ثلاثة مسابير تم إنشاؤها من مواد مشقوقة صغيرة وصفتها WGA3. وسم الذراع 2R باللون الأخضر (الفلورسين); ذراع 2L غير تسمية; الذراع 3R باللون الوردي، وهو خليط من الأحمر (Cy-3) والبرتقال (Cy-5)؛ وسم الذراع 3L باللون البرتقالي (Cy-5). الكروموسوم X لديه تسمية حمراء المقابلة للمسبار rDNA 18S. الكروماتين ملطخ باللون الأزرق (DAPI). المناطق الملونة الزاهية من الكروموسومات تتوافق مع heterochromatin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig5highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض صورة أكبر.</a>
فيديو 1. عملية LCM من الكروموسومات بوليتين An. غامبي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/Sharakhov_video1.mp4" target="_blank">انقر هنا لمشاهدة الفيديو 1.</a>
فيديو 2. جبل كامل 3D FISH يؤديها على خلايا ممرضة المبيض غامبيا. تم تسمية المسبار في Cy-3 (يصور باللون الأزرق) ومصطغ من ذراع كروموسوم 2R مجزئي.  كان ملطخا كروماتين مع DAPI ويصور بواسطة سماوية زائفة التلوين (الأزرق الفاتح). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/Video2.avi" target="_blank">انقر هنا لعرض الفيديو 2.</a>

Watch this Scientific Journal Video about 2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes at JoVE.com

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

الكروموسوم اللوحة هي طريقة مفيدة لدراسة تنظيم نواة الخلية وتطور karyotype. هنا، نظهر نهجا لعزل وتضخيم مناطق محددة ذات أهمية من كروموسومات البوليتين المفردة التي تستخدم لاحقا للفلورسنت ثنائي وثلاثي الأبعاد في التهجين الموقعي (FISH).

2D و 3D كروموسوم اللوحة في البعوض الملاريا

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A Chelex بروتوكول بسيط لاستخراج الحمض النووي من<em&gt; الأنوفيلة</em&gt; النيابة.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

فلوري<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين على الكروموسومات الميتوزى من البعوض

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

تحليل السريع للشذوذ الكروموسومات في الخلايا الليمفاوية B الماوس بواسطة PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

البروتين من التنميط الضامة التي كتبها 2D الكهربائي

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria

طرق لزيادة حساسية عالية الدقة ذوبان واحدة النكليوتيد تعدد الأشكال التنميط الجيني في الملاريا

Despite decades of eradication efforts, malaria remains a global burden. Recent renewed interest in regional elimination and global eradication has been ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

ل<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج لقياس الاستجابات المناعية لمكافحة الملاريا في سياق الفيروس المسبب للإيدز

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

تقييم الدالة حويصلة خارج الخلية أثناء الإصابة بالملاريا

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone

إنقاذ فيروس زيكا المؤتلف من استنساخ cDNA كروموسوم اصطناعي جرثومي

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

تحليلات كفاءة النواقل على بعوض Aedes aegypti باستخدام فيروس زيكا

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

انتشار الطفيلي Microsporidian Edhazardia aedis في Aedes aegypti البعوض

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of ...