Name: 2d and 3d chromosome painting in malaria mosquitoes
Uploaded: 2014-01-06T17:30:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about 2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health 1R21AI094289 til Igor V. Sharakhov

1) Polytene kromosom dias forberedelse til laserfangst mikrodissection
<ol><li>Dissekere halv-gravid Anopheles hunner på 25 timer post-blod fodring. Æggestokkene fikses fra ca. fem hunner til 500 μl frisk modificeret Carnoys opløsning (100% methanol: iseddike, 3:1) ved stuetemperatur i 24 timer. Der overføres æggestokke til -20 °C for at få en langtidsopbevaring.</li>
	<li>Forbered Carnoys opløsning (100% ethanol: iseddike, 3:1) og 50% propionsyre lige før kromosomdias.</li>
	<li>Placer et par æggestokke i en dråbe af Carnoys opløsning på en Zeiss 1,0 PET-membranrutrut. Afhængigt af størrelsen, opdele æggestokke i ca 2-4 sektioner med dissekere nåle og placere dem i en dråbe på 50% propionsyre på rene dias under en dissektion mikroskop.</li>
	<li>Adskil follikler og fjern resterende væv ved hjælp af køkkenrulle under et dissektion stereomikroskop. Tilsæt en ny dråbe på 50% propionsyre til folliklerne og lad dem sidde i 3-5 minutter ved stuetemperatur.</li>
	<li>Placer en siliciumbelagt coverslip oven på dråben. Lad rutsjebanen stå i ca. 1 minut.</li>
	<li>Dæk diaset med et absorberende materiale (filterpapir bruges til denne metode), og mens du bruger viskelædersiden af en blyant, skal du lægge et generøst tryk på coverlipet ved at trykke på det gentagne gange med viskelæderet.</li>
	<li>Skub til 60 °C på et glidende denaturerings-/hybridiseringssystem i 15-20 minutter for at hjælpe med at flade polytenekromosomerne ud. Placer lysbilleder i et fugtigt kammer ved 4 °C natten over, så syren yderligere kan flade kromosomer.</li>
	<li>Placer dias i koldt 50% ethanol i 10 min. Fjern forsigtigt coverlip, og udskift i koldt 50% ethanol i 10 mere min.</li>
	<li>Dehydrerer dias i 70%, 90%, 100% ethanol i 5 min hver. Lufttørre rutsjebaner.</li>
	<li>Forbered en opløsning af GURR bufferopløsning ved at tilføje en enkelt buffertablet til 1 L destilleret vand. Autoklave.</li>
	<li>Giemsa-opløsningen fremstilles ved at tilsætte 1 ml Giemsa-farvningsopløsning til 50 ml GURR-buffer.</li>
	<li>Placer lufttørrede rutsjebaner i Giemsa opløsning i 10 minutter og vask tre gange i 1X PBS. Lufttørring glider igen i et kontrolleret sterilt klima for at undgå forurening.</li>
</ol>2) Laserfangst mikrodissection af en enkelt polyten kromosom arm
Dette afsnit beskriver brugen af PALMRobo-softwaren, som leveres med PALM MicroBeam Laser Microdissection-systemet. 
<ol><li>Rengør mikroskopet med 100% ethanol. Steriliser handsker og rør med UV-lys i uv-crosslinker.</li>
	<li>Tænd palme microbeam lasermikrosfektion mikroskop og tænde laser. Åbn laserdissektionspakken, PALMRobo, og konfigurer indstillingerne "Power" og "Focus" efter behov.</li>
	<li>Søg efter polytene kromosom arm af interesse.</li>
	<li>Opret en disposition for det valgte område ved hjælp af værktøjet "Blyant".</li>
	<li>Åbn vinduet "Elementer" fra menulinjen.</li>
	<li>Vælg "Tegnet element", og sørg for, at du har valgt "Klip".</li>
	<li>Sæt klæbebåndsrøret i holderen og placer det over rutsjebanen, så der er et lille mellemrum <1 mm i størrelse, og start laserskæret.</li>
	<li>Placer "Katapultvalget" på det afskårne sted, så der er plads mellem kanten og kromosomet.</li>
	<li>Vælg "LPC" på rullelisten, og begynd katapultering.</li>
	<li>Kontroller, at prøven blev slynget ind i hætten ved at trykke på ikonet "Øje".</li>
</ol>3) Rensning af DNA fra en enkelt mikrodissected polytene kromosom arm
Følg instruktionerne i QIAamp DNA Micro Kit for at frigive og rense det indsamlede DNA. Trin 3.1 blev ændret for at imødekomme det omvendte rør. 
<ol><li>Der tilsættes 15 μl Buffer ATL og 10 μl proteinase K til det omvendte rør (inde i hætten) og inkuberes ved 56 °C i 3 timer.</li>
	<li>Der tilsættes 25 μl buffer ATL, 50 μl buffer AL og 1 μl bære RNA. blanding. Der tilsættes 50 μl 100% EtOH; blande.</li>
	<li>Overfør lysate til kolonnen QIAamp; centrifuge. Vaskes ved tilsætning af 500 μl buffer AW1; centrifuge. Kolonnen anbringes i det nye opsamlingsrør, tilsættes 500 μl buffer AW2; centrifuge. Placer kolonnen i et nyt rør; centrifuge for at fjerne overskydende væske.</li>
	<li>Kolonnen anbringes i et mikrocentrifugerør på 1,5 μl og tilsættes 20 μl vand for at elute. centrifuge.</li>
	<li>Fordamper friskt elueret DNA ned til et sidste volumen på 9 μl ved hjælp af en vakuumfuge.</li>
</ol>4) Forstærkning af DNA fra en enkelt mikrodissected polytene kromosom arm
To forskellige protokoller blev brugt til WGA af en enkelt kromosomarm. 
<ol><li>DNA-forstærkning og sondeforberedelse via GenomePlex WGA<ol>
<li>Følg GenomePlex-pakken med en enkelt celle for at producere det første parti forstærket DNA:<ol>
<li>Der tilsættes frisklavet Proteinase K-opløsning til prøven på 9 μl. blanding. Inkuber DNA ved 50 °C i 1 time, og varm derefter til 99 °C i 4 min. Bliv ved med at være på is.</li>
			<li>Der tilsættes 2 μl 1X forberedelsesbuffer til enkeltcellebibliotek og 1 μl biblioteksstabiliseringsløsning. varmeprøve til 95 °C i 2 min. Køligt på is og centrifuge.</li>
			<li>Tilføje 1 μl bibliotekspræparatetzym; blanding og centrifuge. Inkuber på følgende måde: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq1.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
			<li>Der tilsættes 7,5 μl 10X forstærkningsmesterblanding, 48,5 μl vand. 5,0 μl WGA DNA Polymerase; blanding og centrifuge.</li>
			<li>Termocykel som følger: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq2.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Rense DNA ved hjælp af genomisk DNA Clean &Concentrator Kit. Protokollen er som følger:<ol>
<li>Der tilsættes 5:1 DNA-bindingsbuffer:DNA-prøve (specielt til genomisk DNA på mindre end 2 kb. Hvis prøve-DNA er større end 2 kb, skal du bruge et 2:1-forhold) og overføre til den angivne spinkolonne. centrifuge.</li>
			<li>Der tilsættes 200 μl DNA-vaskebuffer og centrifuge. Gentag vasketrin. Derefter tilsættes 50 μl vand og elute DNA i en ny 1,5 ml rør.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Forstærk prøve-DNA'et på en måde ved hjælp af GenomePlex WGA3-gensamplificeringssættet på følgende måde:<ol>
<li>Der tilsættes 10 μl DNA til PCR-røret (sættet anbefaler 10 ng i alt DNA) med 49,5 μl vand, 7,5 μl 10x Amplification Master Mix, 3,0 μl 10 mM DNTP mix og 5,0 μl WGA DNA Polymerase. Bland og centrifuge.</li>
			<li>Brug følgende profil til reaktionen: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq3.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
			<li>Opbevar DNA ved -20 °C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Label DNA til FISH ved hjælp af GenomePlex WGA3 Reamplification Kit som følger:<ol>
<li>Opret en masterblanding fra GenomePlex WGA3 Reamplification Kit ved at tilsætte 10 μl DNA til PCR-røret med 49,5 μl vand, 7,5 μl 10X Amplification Master Mix, 3,0 μl 1 mM dNTP mix (1 mM dATP, dCTP, dGTP, 0,3 μl 1 mM dTTP - hvis du bruger mærket dUTP), 1 μl af 25 nM mærket dUTP og 5,0 μl WGA DNA Polymerase.</li>
			<li>Brug følgende profil til reaktionen: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq3.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
			<li>Ethanol udfælder den mærkede sonde ved at tilsætte 1/10 det endelige reaktionsvolumen (7,5 μl for 75 μl reaktion) på 3 M Natriumacetat pH 5,2 og 2-3 mængder 100% ethanol. Dna-prøven nedkøles ved -80 °C i mindst 30 min.</li>
			<li>Centrifugeprøve ved 4 °C i 10 minutter for at skabe mærket pellet og fjerne supernatant og lufttørret pellet.</li>
			<li>Opret hybridiseringsbuffer på følgende måde: 0,2 g Dextran Sulfat 1200 μl Deioniseret formamid 580 μl H2O 120 μl 20X SSC</li>
			<li>Der tilsættes 40 μl hybridiseringsbuffer til lufttørret pellet.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>DNA forstærkning og sonde forberedelse via REPLI-G Single Cell WGA efterfulgt af nick-oversættelse<ol>
<li>Følg REPLI-g WGA Kit-protokollen med en enkelt celle for at producere det forstærkede DNA:<ol>
<li>Forbered Buffer D2 (3 μl af 1 M DTT + 33 μl Buffer DLB).</li>
			<li>4 μl renset mikrodisseret materiale blandes med 3 μl Buffer D2. Svirp rør til at blande. Inkuber i 10 min ved 65 °C. Der tilsættes 3 μl Stop-opløsning. blande.</li>
			<li>Der tilsættes 9 μl H2O, 29 μl REPLI-g reaktionsbuffer og 2 μl REPLI-g DNA Polymerase til prøven. Inkuber ved 30 °C i 8 timer. Inaktiver DNA-polymerase ved opvarmning til 65 °C i 3 min. Opbevar DNA ved -20 °C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Følg nick oversættelsesprotokollen for at mærke REPLI-g forstærket DNA:<ol>
<li>Forbered følgende etiketblanding: 1 μg forstærket DNA 5 μl 10X DNA Polymerase Buffer 5 μl 10X dNTP 5 μl 1X BSA 1 μl 1 mM mærket dNTP 4 μl 1 U/μl DNase I 1 μl 10 U/μl DNA Polymerase I H2O til 50 μl</li>
			<li>Inkuber ved 15 °C i 2 timer. Der tilsættes 2 μl 0,5 M EDTA for at stoppe reaktionen. Tjek DNA fragment størrelse ved at køre på gel.</li>
			<li>Følg trin fra 4.1.4.3-4.1.4.6 til bundfald og opløse pellet.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>5) 2D FISK på polyten og mitotisk kromosom squash præparater
Der henvises til detaljerede protokoller for FISK om præparater af polytene squash 47 og mitotiske kromosomdias 48. Her leverer vi korte protokoller.
<ol><li>FISK på polyten kromosom squash præparater<ol>
<li>Fordyb dias i 1X PBS i 20 min på RT. Fix dias i 4% Paraformaldehyd i 1X PBS i 1 min.</li>
		<li>Dehydrat glider gennem ethanol vasker: 50%, 70%, 90%, 100% i 5 min hver på RT. Lufttørre dias.</li>
		<li>Forvarm sonden i hybridiseringsbuffer ved 37 °C. Tilsæt 10-20 μl sonde til dias. Dæk med 22 X 22 mm coverlip. Tryk eventuelle luftbobler ud ved hjælp af en pipettespids.</li>
		<li>Denaturer kromosomer og sonde ved 90 °C i 10 min. Forsegl kanter af coverslip med gummicement. Overfør rutsjebanen til fugtigt kammer og inkuber ved 39 °C natten over.</li>
		<li>Rutsjebanerne vaskes med 1X SSC ved 39 °C i 20 min. Vask rutsjebanerne med 1X SSC ved RT i 20 min. Skyl dias i 1X PBS, og tilsæt derefter Prolonger anti-fade med DAPI. Dæk med coverlip, og opbevar i glidekassen ved 4 °C i mindst en time før visualisering.</li>
	</ol>
</li>
	<li>FISK på mitotiske kromosom squash præparater<ol>
<li>Ekstrakt mitotiske kromosomer fra imaginaale diske af 4th instar larve af An. gambiae.</li>
		<li>Forbered kromosom dias egnet til FISK.</li>
		<li>Der tilsættes 2-3 μl mærket DNA-sonde til hybridiseringsbuffer i et rør og blandes forsigtigt ved pipettering.</li>
		<li>Påfør 10 μl af sondeblandingen på rutsjebanen og dækslet med en 22 X 22 mm coverlip. Tryk eventuelle luftbobler ud ved hjælp af en pipettespids.</li>
		<li>Til modbevaring og detektion skal du anvende Prolonger anti-fade med DAPI på præparatet og holde det mørkt i mindst en time før visualisering.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6) 3D FISK på hele montere æggestokkene væv
<ol><li>Forbered følgende buffer A-blanding: 60 mM KCl 15 mM NaCl 0,5 mM Spermidin 0,15 mM spermin 2 mM EDTA 0,5 mM EGTA 15 mM RØR</li>
	<li>Forbered dias til nuklear visualisering ved at tilføje et lag af nailpolish i et firkantet mønster, der matcher størrelsen af coverlips. Dette skaber en hævet overflade for at forhindre squashing af kerner, når du placerer på coverslip i fremtiden.</li>
	<li>Disseker friske æggestokke fra Christophers scene 3 hunner og hold i en opløsning på 150-250 μl Buffer A med 0,5% digitonin. Kør større dissektion nål over follikler (i rør med Buffer A med 0,5% digitonin) for at ødelægge follikulær membran.</li>
	<li>Vortex i 5-10 minutter for yderligere at forstyrre follikler. Skrab eventuelle store follikulære stykker og centrifuge rør i 30 sek ved laveste indstilling af ~ 500 omdrejninger i minuttet (RPM). Supernatant overføres til et nyt 2 ml Eppendorf-rør, og der tilsættes 100 μl Buffer A. Gentag trin 6.3 mellem 5-7 gange, indtil det synlige væv er brudt i små partikler.</li>
	<li>Drej begge rør i 10 minutter ved 2.000 omdrejninger i minuttet. Kassér supernatant i begge rør. Bemærk: Begge rør vil blive brugt til at gøre endelige nukleare visualisering dias. Røret med opsamlet supernatant bør indeholde primært ekstraheret kerner, mens det oprindelige rør med væv vil indeholde en blanding af væv og kerner indlejret i sygeplejerskeceller. Der tilsættes 200 μl buffer A – 0,1% Triton og inkuber natten over ved 4 °C. Centrifuge 5 min ved 10.000 RPM (10.621 x G) og fjern supernatant.</li>
	<li>Der tilsættes 200 μl 4% Paraformaldehyd i PBS. Inkuber i termomixer i 30 min. Centrifuge 5 min ved 5.000 omdrejninger (2.655 x G) og fjern supernatant. Vask med Buffer A med 0,1% Triton i 5 min, bland ved 450 RPM i thermomixer. Centrifuge 5 min ved 5.000 RPM (2.655 G) og fjern supernatant.</li>
	<li>Forvarmet ved 37 °C mærket sonde til rør. Denaturer ved 95 °C i termomixer, blanding ved 450 omdrejninger i 10 min. Denatureringen fortsættes ved 80 °C i 15 minutter med fortsat blanding. Inkuber ved 37 °C i termomixer, med 450 RPM blanding natten over. Centrifuge 5 min ved 5.000 omdrejninger (2.655 x G). Fjern supernatant.</li>
	<li>Vask med Buffer A med 0,1% Triton i 5 min. Centrifuge 5 min ved 5.000 omdrejninger (2.655 x G). Gentag 2 gange. Påfør slip af Prolong Anti-fade med DAPI.</li>
	<li>Pipet ud nuclei / DAPI løsning omhyggeligt (undgå bobler), gælder for dias, og dække med coverslip.</li>
</ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Der er flere trin, der er afgørende for at kunne forstærke DNA fra mikrodisserede polytenkromosomprøver. Protokollen anvender brugen af LCM, en metode, der både øger den samlede effektivitet og reducerer eksponeringen for fremmed DNA ved at fjerne samspillet mellem fysiske værktøjer med prøven. Forstærkningen af udenlandsk DNA er dog stadig den største potentielle faldgrube i dette eksperiment. Under hele processen er det derfor vigtigt at holde prøverne beskyttet mod forurening. I hele diasforberedelsen og mikrodisseringsfaserne er det vigtigt at ethanolvaske dissektionsnåle, dias, dæksedler samt arbejdsområdet.  Det anbefales også at UV behandle alt relevant udstyr (nåle, rutsjebaner, coverslips) før brug.
Membranen på dissektionsdiasene gør det meget vanskeligt at sprede kromosomerne.  Det er vigtigt at bruge mere af æggestokken (halvdelen til et helt par æggestokke), når du foretager disse dias, for at give en større chance for at finde en godt spredt kerne.  Det anbefales også at bruge frisk væv, når du foretager dias, som forstærkning satser synes at falde som væv alder 49 og kromosom spredning bliver mere udfordrende.  Forberedelsen af dias til mikrodissection er det mest tidskrævende trin i denne protokol.  Kromosomer skal spredes godt for at undgå utilsigtet erhvervelse af uønsket materiale.  Giemsa farvning giver brugeren mulighed for at kontrollere spredning kvalitet med en fase kontrast mikroskop før du bruger microdissection system.
Kombinationen af mikrodissection og forstærkning giver mulighed for at udtrække og analysere kromosomale fragmenter, der spænder i størrelse fra små regioner af interesse til et flertal af armene.  Denne protokol giver brugeren mulighed for at få DNA fra morfologisk forskellige regioner såsom inversioner, specifikke eukromatiske bånd og interbånd, telomerisk, centromerisk og intercalær heterochromatin. Brugeren kan anvende de genererede malesonder til at undersøge afvigende kromosomer, studere homologi mellem arter på bestemte loci eller karakterisere rumlig organisering af kromosomer i en intakt 3D-kerne. Til udvikling af kromosommaling valgte vi eukromatiske segmenter for at undgå hybridisering af gentagen DNA med flere kromosomale regioner. Som et resultat opnåede vi armspecifikt maleri uden at bruge en konkurrent, som total genomisk DNA eller C0t-1 DNA-fraktion.
Vi valgte at bruge GenomePlex WGA- og REPLI-G-kits baseret på anmeldelser, der sammenlignede effektiviteten og frafaldet af flere forstærkningssæt 40,44.  Begge sæt klarede sig bedst blandt de tilgængelige metoder i både frafaldsprocent (GenomePlex havde en 12,5% sats sammenlignet med REPLI-g's 37,5%) og procentdel af forstærkede markører (GenomePlex havde en 45,24% forstærkningshastighed vs REPLI-g's 30,0%) 40. GenomePlex-sættet leverede også en større mængde DNA og gjorde det dermed til en bedre kandidat til flere downstream-teknikker.  Der findes også et genforstærkningssæt til GenomePlex-systemet, hvilket giver mulighed for yderligere forstærkning af DNA. Det er dog vigtigt at bemærke, at forstærkning ikke er perfekt.  Muligheden er fortsat, at vellykket forstærkning kan indføre fejl eller have en bias mod specifikke loci i målet DNA. Det er vigtigt at overveje den endelige fragmentstørrelse af de tilgængelige genomforstærkningsmetoder.  GenomePlex fragmentering resulterer i et bibliotek med fragmenter fra 200-500 bp, mens REPLI-g-sættet producerer fragmenter på ca. 10-20 kb i størrelse. Den tilsigtede downstream-anvendelse af denne protokol er FISH, hvilket gør GenomePlex-sættet til en mere realistisk mulighed, da det gav den ønskede fragmentstørrelse og evnen til at mærke DNA-fragmenter direkte gennem WGA. Lange DNA-molekyler, der produceres af REPLI-g-forstærkningen, skal fragmenteres i den nedstrøms nickoversættelsesmærkningsreaktion.
Denne protokol er blevet tilpasset for at forstærke DNA fra en enkelt polytenkromosomarm.  Andre protokoller kræver samling af mange (typisk 10-30) kromosomfragmenter for at kunne forstærke prøven 7,11,28,40.  Selvom samling af flere kromosomer er mulig ved hjælp af vores metode, understreger den øgede sandsynlighed for prøveforurening vigtigheden af at starte eksperimentet med så få kromosomer som muligt. Hvis polytenkromosomer ikke er tilgængelige, kan vores protokol tilpasses til brug i mitotiske kromosomer. Det kan dog være nødvendigt at samle 10-15 mitotiske kromosomer inden forstærkning for vellykket FISH 11. Forstærkning bias er lavere med store mængder af startskabelon DNA 50. Polytenekromosomer giver ca. 512 kopier af en enkelt DNA-sekvens og 1024 kopier af to homologe DNA-sekvenser.  Således vil samling af mitotiske kromosomer bidrage til at øge den samlede kvalitet af DNA-produktet efter forstærkning.
Denne procedure har mange potentielle anvendelser i cytogenetiske og genomiske undersøgelser. Her brugte vi kromosom maling til at etablere korrespondancen mellem eukromatiske segmenter af polytene og mitotiske kromosomarme i An. gambiae. De samme malesonder kan anvendes til cytogenetisk karakterisering af An. gambiae cellelinjer. Omfattende genomiske omlægninger og ændringer i kromosomnumre er fælles træk ved cellelinjer 51,52. Aneuploidy, polyploidy og kromosomale omlejringer såsom translokationer, inversioner, sletninger og ringkromosomer er blevet opdaget i forskellige mygcellelinjer 53,54. Klassiske cytogenetiske observationer 55 og fysisk kortlægning 56 har vist forekomsten af fuldarmskromosomale translokationer i udviklingen af malariamyg. Derfor kan mikrodiskriteret materiale anvendes i forbindelse med FISH-forsøg til at sammenligne homologi af kromosomale regioner mellem arter. Vi har med succes udført 3D FISH med 2R-maleri sonde på polytene kromosomer i hele montere æggestokkene sygeplejerske celler. Denne metode vil lette sporingen af kromosombaner og studere den nukleare arkitektur i Anopheles. Teknikker som DNA genotyping 57,58, næste generation genom sekventering 26,27, fysisk og sammenkobling kort udvikling, og generering af sonder til kromosom maleri 33,59 alle kan drage fordel af arm-og regionsspecifikke microdissection. Ved at kombinere LCM-teknologi og fremme encellet WGA demonstrerer vi en effektiv, praktisk metode til fremstilling af rimelige mængder DNA fra en enkelt polytenkromosomarm.

Kromosommaleri er en nyttig teknik til at studere udviklingen af karyotyper 1-5 og til visualisering af cytogenetiske abnormiteter via hybridisering af fluorescerende mærket kromosomal DNA 1,6-8. Denne metode anvendes også til at studere 3D-dynamikken i kromosomområder i udvikling 9 og patologi 10. Differentieret mærket kromosom maling anvendes til visualisering af individuelle mitotiske 11,12, meiotiske 13,14eller interfase ikke-polyten 15,16 og polyten 9,11,17 kromosomer. En enkel og robust protokol til at opnå kromosommaling ville være meget nyttig til at udvide denne teknik til ikke-modelorganismer, såsom myg. Anopheles gambiae-komplekset er en gruppe på syv morfologisk ikke skelnelige myg, der varierer i adfærd og tilpasning, herunder evnen til at overføre malaria.  Disse myg tjener som en fremragende model for bedre at forstå udviklingen af nært beslægtede arter, der adskiller sig meget i deres vektoriske kapacitet.  De fleste cytogenetiske undersøgelser i malaria myg er blevet udført ved hjælp af veludviklede, højt polyteniserede kromosomer (gennemgået i 18,19). De læsbare banding mønstre af polytene kromosomer tillod forskere at demonstrere sammenhængen mellem polymorfe inversioner og økologiske tilpasninger i Anopheles gambiae 20. Også vævsspecifikke 21 og artsspecifikke 22 funktioner i 3D polytenkromosomorganisation er blevet karakteriseret i An. macullipennis-komplekset. Men at studere mitotiske kromosomer kan give yderligere vigtige oplysninger. For eksempel er et højere niveau af heterochromatin polymorfi observeret i mitotiske kromosomer blevet korreleret med reduceret parringsaktivitet og frugtbarhed i An. gambiae 23. Det kan være vanskeligt kun at fastslå overensstemmelsen mellem eukromatiske segmenter af polyten- og mitotiske kromosomarme ved at sammenligne deres relative længder. Dette skyldes, at heterochromatin udgør en betydelig del af mitotiske kromosomer, men er underrepræsenteret i polytenkromosomer 24. Tilgængeligheden af kromosommaling til malariamyg vil gøre det muligt for forskere at udvide cytogenetiske undersøgelser betydeligt ved at inkludere yderligere arter, samtidig med at omkostningerne og tiden i analyserne af karyopatisk evolution og 3D-dynamikken i kromosomer i denne gruppe af epidemiologisk vigtige insekter reduceres betydeligt.
For at opnå store strækninger af kromosomer er mikrodissection blevet en integreret teknik til at manipulere og isolere specifikke regioner af interesse for det kromosomale supplement.  Når mikrodissection kombineres med helgenomforstærkning (WGA), resulterer det i kraftfulde downstream-applikationer, herunder FISH 11,12 og næste generations genomsekvensering 25-27. Tidligere krævede teknikken brug af specialiserede mikrodissection nåle, der skulle styres manuelt af en erfaren bruger 28.  Udviklingen af laserfangstmikreringsmikrektion (LCM) har resulteret i et forenklet værktøj, der er bedre egnet til isolering af enkeltceller 29,30 eller individuelle kromosomer 31-33 med en mindsket risiko for forurening. Denne tilgang giver brugeren mulighed for at studere de genetiske heterogeniteter og kromosomale abnormiteter, der forekommer i enkelte celler, i stedet for et konsensuslandskab, der skyldes at samle flere celler sammen 34-36. Flere metoder er blevet brugt til at forstærke DNA produceret af microdissection.  DOP-PCR, en teknik, der er nyttig til forstærkning af meget gentagne sekvenser, er blevet brugt til at forstærke mikrodissected kromosomer fra arter, herunder græshoppe 37, den spiny ål 38, og Nilen tilapia 39.  For nylig er pcr-baserede GenomePlex WGA4 Single Cell kit og flere forskydning forstærkning baseret (MDA) Repli-G Single Cell kit blevet værdifulde værktøjer til eksperimenter, der involverer genetisk analyse af enkelt menneskelige celler samt kromosomer40-42, herunder B-kromosomsystemer i græshopper 37 og græshopper 43. Disse to kits har hver især fordele og ulemper, men deres tilsyneladende overlegenhed over andre tilgængelige forstærkningssystemer er blevet påvist 44.
Mængden af DNA, der kan opnås fra et enkelt kromosom eller et kromosomsegment, er betydeligt mindre end en hel kerne. Derfor er mikrodissection, forstærkning og efterfølgende analyse af et enkelt kromosom langt mere udfordrende, især hos organismer med små genomer som i Drosophila eller Anopheles.  Selv om maling er udviklet fra enkelt microdissected kromosomer af et menneske 33 og en hveps 45, en vellykket FISK eksperiment krævede flere (mindst 10-15) mikrodissected mitotiske kromosomer af en frugt flyve 11. Evnen til at mikrodissektere og forstærke et enkelt kromosom ville imidlertid være vigtig for (i) at reducere risikoen for kontaminering med materiale fra et andet kromosom, (ii) at minimere antallet af kromosompræparater, der er nødvendige for mikrodissection, (iii) at sænke nukleotid og strukturel polymorfi af den mikrodisserede prøve i både FISH og sekventering af downstream-applikationer. Polytene kromosomer findes i mange Dipteran arter giver en unik mulighed for at erhverve en langt højere startmængde af DNA. De giver også en højere opløsning og kromosomstruktur, der ikke kan opnås ved brug af mitotiske kromosomer. Denne ekstra opløsning kan være afgørende for at visualisere kromosomale omlejringer, kromatinstruktur og kromosomale segmenter, der skal mikrodissected 28,46.
Her præsenterer vi en procedure for effektivt at isolere et eukromatisk segment fra en enkelt polytenkromosomarm, forstærke DNA'et og bruge det i downstream FISH-applikationer i malariamyg.  Først anvender vi LCM til at isolere og udtrække en enkelt kromosomarm fra specielt forberedte membrandias. For det andet bruges WGA til at forstærke DNA'et fra det mikrodisserede materiale. For det tredje hybridiserer vi det forstærkede DNA i FISH-eksperimenter til polytene squashpræparater 47, metafase og interfasekromosom dias 48, samt 3D-æggestokke hele mount prøver. Denne procedure er blevet gjort for at kunne male et flertal af euchromatin i kromosomale arme af An. gambiae.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="562">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">A491-212</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Methanol</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:120px;">A412-4</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Propionic acid&#160;</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">402907</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Membrane slides 1.0 PET</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;">415190-9051-000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Buffer tablets &#8220;GURR&#8221;</td>
			<td style="width:112px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">10582-013</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">KaryoMAX Giemsa Stain</td>
			<td style="width:112px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">10092-013</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">ThermoBrite Slide Denaturation/Hybridization System</td>
			<td style="width:112px;">Abbott Molecular</td>
			<td style="width:120px;">30-144110</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Vacufuge vacuum concentrator</td>
			<td style="width:112px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:120px;">22820001</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">Spectroline Microprocessor-Controlled UV Crosslinker XL-1000</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">11-992-89</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:59px;width:191px;">Thermo Scientific NanoDrop</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">ND-2000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">REPLI-g Single Cell Kit</td>
			<td style="width:112px;">Qiagen</td>
			<td style="width:120px;">150343</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:191px;">GenomePlex Single Cell Kit (WGA4)</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">WGA4-10RXN</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">GenomePlex WGA Reamplification Kit (WGA3)</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">WGA3-50RXN</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:191px;">MZ6 Leica stereomicroscope</td>
			<td style="width:112px;">Leica</td>
			<td style="width:120px;">VA-OM-E194-354</td>
			<td style="width:139px;">A different stereomicroscope can be used</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">Olympus CX41 Phase Microscope</td>
			<td style="width:112px;">Olympus</td>
			<td style="width:120px;">CX41RF-5</td>
			<td style="width:139px;">A different phase microscope can be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">PALM MicroBeam Laser Microdissection Microscope</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Thermomixer</td>
			<td style="width:112px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:120px;">22670000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">10x PBS</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:120px;">P5493</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">50x Denhardt&#8217;s solution</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">D2532</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">99% Formamide</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP227500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Dextran sulfate sodium salt</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td style="width:120px;">D8906</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">20x SSC buffer</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:120px;">AM9765</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">ProLong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:120px;">P-36931</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">dATP, dCTP, dGTP, dTTP</td>
			<td style="width:112px;">Fermentas</td>
			<td style="width:120px;">R0141, R0151, R0161, R0171</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Cy3-dUTP, Cy5-dUTP</td>
			<td style="width:112px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:120px;">PA53022, PA55022</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">BSA</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">A3294</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">DNA polymerase I</td>
			<td style="width:112px;">Fermentas</td>
			<td style="width:120px;">EP0041</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">DNase I&#160;</td>
			<td style="width:112px;">Fermentas</td>
			<td style="width:120px;">EN0521</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Spermine</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">S3256-1G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Spermidine</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">S0266-1G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP366-500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP3581</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">EGTA</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">E0396-25G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">PIPES</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">P6757-25G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">EDTA</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">S311-500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Digitonin</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">D141-100MG</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Triton-X100</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP151-100</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">AdhesiveCap 500 clear</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;">415190-9211-000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">QIAamp DNA Micro Kit (50)</td>
			<td style="width:112px;">Qiagen</td>
			<td style="width:120px;">56304</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Genomic DNA Clean and Concentrator Kit</td>
			<td style="width:112px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:120px;">D4010</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">37% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">F79-500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

2d and 3d chromosome painting in malaria mosquitoes

Fluorescerende in situ hybridisering (FISH) af hele armkromosomsonder er en robust teknik til kortlægning af genomiske interesseregioner, påvisning af kromosomale omlægninger og undersøgelse af tredimensionel (3D) organisering af kromosomer i cellekernen. Fremkomsten af laserfangst mikrodissection (LCM) og hele genomforstærkning (WGA) giver mulighed for at opnå store mængder DNA fra enkelte celler. Den øgede følsomhed af WGA kits fik os til at udvikle kromosom maling og bruge dem til at udforske kromosom organisation og udvikling i ikke-model organismer. Her præsenterer vi en enkel metode til isolering og forstærkning af de eukromatiske segmenter af enkelt polytenkromosomarme fra æggestokkene sygeplejerskeceller i den afrikanske malaria myg Anopheles gambiae. Denne procedure giver en effektiv platform til at opnå kromosommaling, samtidig med at den samlede risiko for at introducere udenlandsk DNA til prøven reduceres. Brugen af WGA giver mulighed for flere runder af re-forstærkning, hvilket resulterer i store mængder af DNA, der kan bruges til flere eksperimenter, herunder 2D og 3D FISH. Vi viste, at de udviklede kromosommaling med succes kan bruges til at etablere korrespondancen mellem eukromatiske dele af polyten og mitotiske kromosomarme i An. gambiae. Samlet set giver foreningen af LCM og single-kromosom WGA et effektivt værktøj til at skabe betydelige mængder mål-DNA til fremtidige cytogenetiske og genomiske undersøgelser.

Figur 1 beskriver den overordnede gennemstrømning af protokollen, der er beskrevet i denne artikel.  Brugeren starter i første omgang med at mikrodissecting kromosom DNA-prøver fra membran dias.  Mikrodisseret materiale udvindes og renses. Det rensede DNA forstærkes derefter, forstærkes igen, mærkes og bruges derefter til FISH til at mærke kromosomspredninger.
LCM-protokollen kan opdeles i tre overordnede trin: 1) At finde kromosomer af interesse og forberede regionen til skæring (Figur 2A), 2) Skæring og katapult af det kromosomområde af interesse via laser (Figur 2B) og 3) Kontrol for at afgøre, om prøven faktisk slynges ind i klæbende hætte (Figur 2C). Processen med LCM, der anvendes på An. gambiae Sua stamme polytene kromosomer er vist i Video 1. Videoen beskriver hele processen fra programstart, herunder vigtige softwarefunktioner og tip.
GenomePlex og REPLI-g enkeltcellede WGA-sæt, der bruges i denne protokol, adskiller sig meget i resulterende produktstørrelse såvel som samlet udbytte.  Figur 3 viser resultaterne af gel elektroforese løb for GenomePlex og REPLI-g kits, samt kvantificering af prøverne ved Nanodrop.
Mikrodisseret materiale er blevet brugt til at skabe FISH-sonder, der er målrettet mod eukromatiske områder af et kromosom.  Figur 4 viser FISH af fem sonder genereret af mikrodisseret materiale på polytene kromosomer i An. gambiae.  Fire autosomale arme var mærket med tre fluorophorer ved hjælp af WGA3-sættet: 3R-kromosomet er mærket med grønt (fluorescein), 3L-kromosomet er i en blanding af rødt (Cy-3) og gult (Cy-5), 2R-kromosomet er i gult (Cy-5), og 2L-kromosomet er i rødt (Cy-3). X-kromosomet blev mærket i orange (Cy-3) ved hjælp af nick-oversættelse af REPLI-g materialet i et separat eksperiment. For at fastslå overensstemmelsen mellem eukromatiske dele af polyten og mitotiske kromosomarme er kromosommaling blevet hybridiseret til interfase, profase, prometaphase og metafasekromosomer i An. gambiae (Figur 5).  For at visualisere 3D-organiseringen af en enkelt polytenkromosomarm i cellekernen blev hele mount FISH udført på An. gambiae Sua stamme æggestokkene sygeplejerske celler (Video 2).  Forskellige kromosomarmområder ses tydeligt i kerner med interfase (Figur 5D) og polyten (Video 2) kromosomer.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig1.jpg"> Figur 1. Skematisk repræsentation af de eksperimentelle procedurer mod fremstilling af kromosommaling. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig1highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se større billede.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig2.jpg"> Figur 2. De vigtigste skridt i kromosom mikrodissection. A) Laserassisteret skæring af det kromosomale område af interesse gennem membranen. B) Membranen med et hul efter katapulten udføres. C) Visningen af det katapulterede stykke af membranen med et kromosomalt segment i det fastgjort til klæbehætten. Pilen angiver heterochromatin af X-kromosomet, der forblev på diaset. Stjernen viser et stykke af et andet kromosom, der forblev på diaset. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig2highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se større billede.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig3.jpg"> Figur 3. Agarose gel billeder, der viser DNA efter WGA. A) Lav molekylvægt (200-500 bp) DNA fra arm 3R efter brug af WGA4- og WGA3 GenomePlex-kits. B) Høj molekylvægt (10-20 kb) DNA fra arm 2L efter REPLI-g forstærkning. 100 bp stigen er vist i venstre vognbane. Tabellerne under gelbillederne viser DNA-koncentrationer målt ved Nanodrop. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig3highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se større billede.</a>
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig4.jpg"> Figur 4. Maling af polytenkromosomer fra æggestokkene sygeplejerske celler i An. gambiae ved hjælp af fire sonder genereret fra mikrodiskuterede materiale. X-kromosomet er mærket i orange (Cy-3) ved nick-oversættelse af REPLI-g materialet. 2R armen er mærket i gult (Cy-5); 2L armen er i rødt (Cy-3); 3R-armen er mærket med grønt (fluorescerende) 3L-armen er mærket i en blanding af rød (Cy-3) og gul (Cy-5). Autosomer er mærket med WGA3 forstærkningssættet. Chromatin er farvet i blåt (DAPI). Kromosomnavne er placeret i nærheden af telomeriske regioner. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig4highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se større billede.</a>
<img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig5.jpg"> Figur 5. Maling af interfase (A), profase (B), prometaphase (C) og metafase (D) kromosomer fra larvemaginaler fra An. gambiae Mopti-stammen ved hjælp af tre sonder genereret af mikrodisseret materiale mærket af WGA3. 2R-armen er mærket med grønt (fluorescerende); 2L-armen er umærket; 3R-armen er i pink, en blanding af rød (Cy-3) og orange (Cy-5); 3L armen er mærket i orange (Cy-5). X-kromosomet har en rød etiket svarende til 18S rDNA-sonden. Chromatin er farvet i blåt (DAPI). Farvestrålende områder af kromosomer svarer til heterochromatin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig5highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se større billede.</a>
Video 1. Processen med LCM af An. gambiae polytene kromosomer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/Sharakhov_video1.mp4" target="_blank">Klik her for at se Video 1.</a>
Video 2. Hele mount 3D FISH udført på En. gambiae æggestokkene sygeplejerske celler. Sonden er mærket i Cy-3 (afbildet i blåt) og blev lavet af en mikrodissected 2R kromosom arm.  Chromatin blev plettet med DAPI og er afbildet af cyan pseudo-farve (lyseblå). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/Video2.avi" target="_blank">Klik her for at se Video 2.</a>

Watch this Scientific Journal Video about 2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes at JoVE.com

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

Kromosommaleri er en nyttig metode til at studere organiseringen af cellekernen og udviklingen af karyotypen. Her demonstrerer vi en tilgang til at isolere og forstærke specifikke interesseregioner fra enkelt polytenkromosomer, der efterfølgende bruges til to- og tredimensionel fluorescerende in situ-hybridisering (FISH).

2D og 3D kromosom maleri i malaria myg

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

2d-and-3d-chromosome-painting-in-malaria-mosquitoes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

A Simple Chelex protokol til DNA-ekstraktion fra<em&gt; Anopheles</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes. Investigation of transcripts and gene regulators that are expressed in tissues in which the mosquito host and pathogen interact, and in organs involved in reproduction are of great interest for strategies to reduce mosquito-borne disease transmission and disrupt egg development. A number of tools have been employed to study and validate the temporal and tissue-specific regulation of gene expression. Here, we describe protocols that have been developed to obtain spatial information, which enhances our understanding of where specific genes are expressed and their products accumulate. The protocol described has been used to validate expression and determine accumulation patterns of transcripts in tissues related to mosquito-borne pathogen transmission, such as female salivary glands, as well as subcellular compartments of ovaries and embryos, which relate to mosquito reproduction and development. 
 The following procedures represent an optimized methodology that improves the efficiency of various steps in the protocol without loss of target-specific hybridization signals. Guidelines for RNA probe preparation, dissection of soft tissues and the general procedure for fixation and hybridization are described in Part A, while steps specific for the collection, fixation, pre-hybridization and hybridization of mosquito embryos are detailed in Part B.

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Temporal and spatial gene expression analyses have a crucial role in functional genomics. Whole-mount hybridization in situ is useful for determining the localization of transcripts within tissues and subcellular compartments. Here we outline a hybridization in situ protocol with modifications for specific target tissues in mosquitoes.

Hybridisering<em&gt; In situ</em&gt; Af spytkirtler, æggestokke og embryoner af Vector Myg

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. One important application of this method is the development of high-quality physical maps useful for improving the genome assemblies for various organisms. The natural banding pattern of polytene and mitotic chromosomes provides guidance for the precise ordering and orientation of the genomic supercontigs. Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, a well-established chromosome-based mapping technique has been developed only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes 1. As a result of genome mapping efforts, 88% of the An. gambiae genome has been placed to precise chromosome positions 2,3 . Two other mosquito genera, Aedes and Culex, have poorly polytenized chromosomes because of significant overrepresentation of transposable elements in their genomes 4, 5, 6. Only 31 and 9% of the genomic supercontings have been assigned without order or orientation to chromosomes of Ae. aegypti 7 and Cx. quinquefasciatus 8, respectively. Mitotic chromosome preparation for these two species had previously been limited to brain ganglia and cell lines. However, chromosome slides prepared from the brain ganglia of mosquitoes usually contain low numbers of metaphase plates 9. Also, although a FISH technique has been developed for mitotic chromosomes from a cell line of Ae. aegypti 10, the accumulation of multiple chromosomal rearrangements in cell line chromosomes 11 makes them useless for genome mapping. Here we describe a simple, robust technique for obtaining high-quality mitotic chromosome preparations from imaginal discs (IDs) of 4th instar larvae which can be used for all three genera of mosquitoes. A standard FISH protocol 12 is optimized for using BAC clones of genomic DNA as a probe on mitotic chromosomes of Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus, and for utilizing an intergenic spacer (IGS) region of ribosomal DNA (rDNA) as a probe on An. gambiae chromosomes. In addition to physical mapping, the developed technique can be applied to population cytogenetics and chromosome taxonomy/systematics of mosquitoes and other insect groups.

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, physical genome mapping techniques were established only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes. For the genera of Aedes and Culex, however, cytogenetic mapping remains challenging because of the poor quality of polytene chromosomes. Here we present a universal protocol for obtaining high-quality preparations of mitotic chromosomes and an optimized FISH protocol for all three genera of mosquitoes.

Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering på mitotiske kromosomer af myg

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency and type of chromosome aberrations in different cell types allows defects in DNA repair pathways to be elucidated. Understanding mammalian DNA repair biology has been greatly helped by the production of mice with knockouts in specific genes. The goal of this protocol is to quantify genomic instability in mouse B lymphocytes. Labeling of the telomeres using PNA-FISH probes (peptide nucleic acid - fluorescent in situ hybridization) facilitates the rapid analysis of genomic instability in metaphase chromosome spreads. B cells have specific advantages relative to fibroblasts, because they have normal ploidy and a higher mitotic index. Short-term culture of B cells therefore enables precise measurement of genomic instability in a primary cell population which is likely to have fewer secondary genetic mutations than what is typically found in transformed fibroblasts or patient cell lines.

DNA repair pathways are essential for maintenance of genomic integrity and preventing mutation and cancer. The goal of this protocol is to quantify genomic instability by direct observation of chromosome aberrations in metaphase spreads from mouse B cells using fluorescent in situ hybridization (FISH) for telomeric DNA repeats.

Hurtig analyse af kromosomafvigelser i Mouse B lymfocytter ved PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria

Despite decades of eradication efforts, malaria remains a global burden. Recent renewed interest in regional elimination and global eradication has been accompanied by increased genomic information about Plasmodium parasite species responsible for malaria, including characteristics of geographical populations as well as variations associated with reduced susceptibility to anti-malarial drugs.
One common genetic variation, single-nucleotide polymorphisms (SNPs), offers attractive targets for parasite genotyping. These markers are useful not only for tracking drug resistance markers but also for tracking parasite populations using markers not under drug or other selective pressures.
SNP genotyping methods offer the ability to track drug resistance as well as to fingerprint individual parasites for population surveillance, particularly in response to malaria control efforts in regions nearing elimination status.
While informative SNPs have been identified that are agnostic to specific genotyping technologies, high-resolution melting (HRM) analysis is particularly suited to field-based studies. Compared to standard fluorescent-probe based methods that require individual SNPs in a single labeled probe and offer at best 10% sensitivity to detect SNPs in samples that contain multiple genomes (polygenomic), HRM offers 2-5% sensitivity. Modifications to HRM, such as blocked probes and asymmetric primer concentrations as well as optimization of amplification annealing temperatures to bias PCR towards amplification of the minor allele, further increase the sensitivity of HRM. While the sensitivity improvement depends on the specific assay, we have increased detection sensitivities to less than 1% of the minor allele.
In regions approaching malaria eradication, early detection of emerging or imported drug resistance is essential for prompt response. Similarly, the ability to detect polygenomic infections and differentiate imported parasite types from cryptic local reservoirs can inform control programs.
This manuscript describes modifications to high resolution melting technology that further increase its sensitivity to identify polygenomic infections in patient samples.

While high resolution melting analysis offers the ability to differentiate between single nucleotide polymorphisms in a heterogeneous population, mutant allele amplification bias can increase its ability to detect alleles present at relatively low percentages within a sample. This protocol describes improvements that improve the sensitivity of high resolution melting analysis.

Metoder til at øge følsomheden af ​​High Resolution Melting enkelt-nukleotid polymorfisme Genotypning i Malaria

Despite decades of eradication efforts, malaria remains a global burden. Recent renewed interest in regional elimination and global eradication has been ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

En<em&gt; In vitro</em&gt; Model til måling immunresponser på malaria i forbindelse med hiv co-infektion

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible for most malaria-related deaths globally. Several factors including parasite sequestration in tissues, vascular dysfunction, and inflammatory responses influence the evolution of the disease in malaria-infected people. P. falciparum-infected red blood cells (iRBCs) release small extracellular vesicles (EVs) containing different kinds of cargo molecules that mediate pathogenesis and cellular communication between parasites and host. EVs are efficiently taken up by cells in which they modulate their function. Here we discuss strategies to address the role of EVs in parasite-host interactions. First, we describe a straightforward method for labeling and tracking EV internalization by endothelial cells, using a green cell linker dye. Second, we report a simple way to measure permeability across an endothelial cell monolayer by using a fluorescently labeled dextran. Finally, we show how to investigate the role of small non-coding RNA molecules in endothelial cell function.

In this work, we describe protocols to investigate the role of extracellular vesicles (EVs) released by Plasmodium falciparum infected erythrocytes. In particular, we focus on the interactions of EVs with endothelial cells.

Evaluering af ekstracellulære vesikel funktion under Malaria infektion

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines and/or antivirals have underscored the urgent need to develop ZIKV reverse genetic systems to facilitate the study of ZIKV biology and the development of therapeutic and/or prophylactic approaches. However, like with other flaviviruses, the generation of ZIKV full-length infectious cDNA clones has been hampered due to the toxicity of viral sequences during its amplification in bacteria. To overcome this problem, we have developed a nontraditional approach based on the use of bacterial artificial chromosomes (BACs). Using this approach, the full-length cDNA copy of the ZIKV strain Rio Grande do Norte Natal (ZIKV-RGN) is generated from four synthetic DNA fragments and assembled into the single-copy pBeloBAC11 plasmid under the control of the human cytomegalovirus (CMV) immediate-early promoter. The assembled BAC cDNA clone is stable during propagation in bacteria, and infectious recombinant (r)ZIKV is recovered in Vero cells after transfection of the BAC cDNA clone. The protocol described here provides a powerful technique for the generation of infectious clones of flaviviruses, including ZIKV, and other positive-strand RNA viruses, particularly those with large genomes that have stability problems during bacterial&#160;propagation.

The recent epidemic of Zika virus highlights the importance of establishing reverse genetic approaches to develop vaccines and/or therapeutic strategies. Here, we describe the protocol to rescue an infectious recombinant Zika virus from a full-length cDNA clone assembled in a bacterial artificial chromosome under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter.

Redning af rekombinant Zikavirus fra en bakteriel kunstig kromosom cDNA-klon

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

Vektor kompetence analyser på Aedes aegypti Myg ved hjælp af Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of disease cases each year. E. aedis causes mortality and reduced reproductive fitness in the mosquito vector and has been explored for its potential as a biocontrol agent. The protocol we present for culturing E. aedis is based on its natural infection cycle, which involves both horizontal and vertical transmission at different life stages of the mosquito host. Ae. aegypti mosquitoes are exposed to spores in the larval stage. These infected larvae then mature into adults and transmit the parasite vertically to their offspring. Infected offspring are then used as a source of spores for future horizontal transmission. Culturing E. aedis can be challenging to the uninitiated given the complexities of the parasite&#8217;s life cycle, and this protocol provides detailed guidance and visual aids for clarification.

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

A protocol to culture the microsporidian parasite Edhazardia aedis. The parasite is passaged from one generation of Aedes aegypti mosquitoes to the next via horizontal transfer at the larval stage followed by vertical transmission at the adult stage. Live sporoplasms survive long-term in infected eggs.

Udbredelse af microsporidian parasit Edhazardia aedis i Aedes aegypti Myg

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of ...