Name: 2d and 3d chromosome painting in malaria mosquitoes
Uploaded: 2014-01-06T17:30:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about 2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de subsidie van national institutes of health 1R21AI094289 aan Igor V. Sharakhov

1) Polytene chromosoom dia voorbereiding voor laser capture microdissection
<ol><li>Ontleed half-gravid Anopheles vrouwtjes op 25 uur post-bloed voeding. Fixeer eierstokken van ongeveer vijf vrouwtjes in 500 μl vers gemodificeerde Carnoy's oplossing (100% methanol: ijsazijnzuur, 3:1) bij kamertemperatuur gedurende 24 uur. Breng de eierstokken over naar -20 °C voor langdurige opslag.</li>
	<li>Bereid carnoy's oplossing (100% ethanol: ijsazijnzuur, 3:1) en 50% propionzuur vlak voor het maken van chromosoomdia's.</li>
	<li>Plaats een paar eierstokken in één druppel Carnoy's oplossing op een Zeiss 1.0 PET membraanschuif. Afhankelijk van de grootte, splits eierstokken in ongeveer 2-4 secties met ontleden naalden en plaats ze in een druppel van 50% propionzuur op schone dia's onder een dissectiemicroscoop.</li>
	<li>Scheid de follikels en verwijder het resterende weefsel met keukenpapier onder een dissectiesteremicoscoop. Voeg een nieuwe druppel van 50% propionzuur toe aan de follikels en laat ze 3-5 minuten op kamertemperatuur zitten.</li>
	<li>Plaats een gesiliconiseerde afdeklip op de druppel. Laat de schuif ongeveer 1 minuut staan.</li>
	<li>Bedek de dia met een absorberend materiaal (filterpapier wordt voor deze methode gebruikt) en oefen tijdens het gebruik van de gumzijde van een potlood een royale hoeveelheid druk uit op de afdeklip door er herhaaldelijk op te tikken met de gum.</li>
	<li>Verwarm de dia tot 60 °C op een diadenaturatie/hybridisatiesysteem gedurende 15-20 minuten om te helpen bij het afvlakken van de polytene chromosomen. Plaats dia's 's nachts in een vochtige kamer bij 4 °C om het zuur de chromosomen verder af te vlakken.</li>
	<li>Plaats dia's 10 minuten in koude 50% ethanol. Verwijder voorzichtig de afdeklip en vervang in koude 50% ethanol gedurende nog 10 minuten.</li>
	<li>Dehydrateer dia's in 70%, 90%, 100% ethanol gedurende elk 5 minuten. Luchtdroge dia's.</li>
	<li>Bereid een oplossing van GURR-bufferoplossing voor door een enkele buffertablet toe te voegen aan 1 L gedestilleerd water. autoclaaf.</li>
	<li>Bereid de Giemsa-oplossing door 1 ml Giemsa-kleuroplossing toe te voegen aan 50 ml GURR-buffer.</li>
	<li>Plaats luchtgedroogde dia's in Giemsa-oplossing gedurende 10 minuten en was driemaal in 1X PBS. Luchtdroge glijdt opnieuw in een gecontroleerd steriel klimaat om verontreiniging te voorkomen.</li>
</ol>2) Laser capture microdissection van een enkele polytene chromosoom arm
In deze sectie wordt het gebruik van de PALMRobo-software behandeld, die wordt geleverd met het PALM MicroBeam Laser Microdissection-systeem. 
<ol><li>Reinig de microscoop met 100% ethanol. Steriliseer handschoenen en tubes met een UV-licht in een UV-crosslinker.</li>
	<li>Zet de PALM MicroBeam Laser Microdissection microscoop aan en schakel laser in. Open de laserdissectiesuite, PALMRobo, en configureer indien nodig de instellingen "Power" en "Focus".</li>
	<li>Zoek naar polytene chromosoom arm van belang.</li>
	<li>Schets met het gereedschap Potlood het geselecteerde gebied.</li>
	<li>Open het venster "Elementen" in de menubalk.</li>
	<li>Selecteer het element 'Getekend', zorg ervoor dat u 'Knippen' hebt geselecteerd.</li>
	<li>Installeer de zelfklevende dopbuis in de houder en plaats deze boven de glijbaan, laat een kleine opening <1 mm groot en start de lasersnede.</li>
	<li>Plaats de "Katapultselectie" binnen de snijplaats en laat ruimte tussen de rand en het chromosoom.</li>
	<li>Selecteer "LPC" in de vervolgkeuzelijst en begin met katapulteren.</li>
	<li>Controleer of het monster in de dop is gekatapulteerd door op het pictogram "Oog" te drukken.</li>
</ol>3) Zuivering van DNA uit een enkele microdissecte polytene chromosoomarm
Volg de instructies van de QIAamp DNA Micro Kit om het verzamelde DNA vrij te geven en te zuiveren. Stap 3.1 is aangepast aan de omgekeerde buis. 
<ol><li>Voeg 15 μl Buffer ATL en 10 μl proteïnase K toe aan de omgekeerde buis (in de dop) en incubeer bij 56 °C gedurende 3 uur.</li>
	<li>Voeg 25 μl buffer ATL, 50 μl buffer AL en 1 μl drager RNA toe; mix. Voeg 50 μl 100% EtOH toe; mengen.</li>
	<li>Lysaat overbrengen naar qiaamp-kolom; centrifuge. Wassen door toevoeging van 500 μl buffer AW1; centrifuge. Plaats de kolom in de nieuwe opvangbuis, voeg 500 μl buffer AW2 toe; centrifuge. Plaats de kolom in een nieuwe buis; centrifugeer om overtollige vloeistof te verwijderen.</li>
	<li>Plaats de kolom in een microcentrifugebuis van 1,5 μl en voeg 20 μl water toe aan elute; centrifuge.</li>
	<li>Verdampt vers geëuteerd DNA tot een eindvolume van 9 μl met behulp van een vacuümfuge.</li>
</ol>4) Versterking van DNA uit een enkele microdissecte polytene chromosoomarm
Voor de WGA van een enkele chromosoomarm werden twee verschillende protocollen gebruikt. 
<ol><li>DNA-versterking en sondevoorbereiding via GenomePlex WGA<ol>
<li>Volg het GenomePlex Single Cell WGA4 Kit-protocol om de eerste batch versterkt DNA te produceren:<ol>
<li>Voeg vers bereide Proteinase K-oplossing toe aan het monster van 9 μl; mix. Incubeer DNA bij 50 °C gedurende 1 uur en verwarm vervolgens tot 99 °C gedurende 4 min. Blijf op ijs.</li>
			<li>Voeg 2 μl 1x eencellige bibliotheekvoorbereidingsbuffer en 1 μl bibliotheekstabilisatieoplossing toe; mengen. Verwarm het monster gedurende 2 minuten op 95 °C. Koel af op ijs en centrifugeer.</li>
			<li>Voeg 1 μl bibliotheekpreparaatenzym toe; mengen en centrifugeren. Incubeer als volgt: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq1.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
			<li>Voeg 7,5 μl 10X Amplification Master Mix, 48,5 μl water toe. 5,0 μl WGA DNA-polymerase; mengen en centrifugeren.</li>
			<li>Thermocycle als volgt: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq2.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Zuiver DNA met behulp van de Genomic DNA Clean &Concentrator Kit. Het protocol is als volgt:<ol>
<li>Voeg 5:1 DNA-bindingsbuffer toe: DNA-monster (specifiek voor genomisch DNA van minder dan 2 kb. Als het DNA van het monster groter is dan 2 kb, gebruikt u een verhouding van 2:1) en wordt het overgedragen naar de meegeleverde spinkolom. centrifuge.</li>
			<li>Voeg 200 μl DNA Wash Buffer en centrifugeer toe. Herhaal de wasstap. Voeg vervolgens 50 μl water toe en elute het DNA in een nieuwe buis van 1,5 ml.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Versterk het DNA van het monster opnieuw met behulp van de GenomePlex WGA3 Reamplification Kit als volgt:<ol>
<li>Voeg 10 μl DNA toe aan de PCR-buis (de kit beveelt 10 ng totaal DNA aan) met 49,5 μl water, 7,5 μl 10x Amplification Master Mix, 3,0 μl 10 mM DNTP-mix en 5,0 μl WGA DNA Polymerase. Mix en centrifugeer.</li>
			<li>Gebruik het volgende profiel voor de reactie: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq3.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
			<li>Bewaar DNA bij -20 °C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Label DNA voor VIS met behulp van de GenomePlex WGA3 Reamplification Kit als volgt:<ol>
<li>Maak een mastermix van de GenomePlex WGA3 Reamplification Kit door 10 μl DNA toe te voegen aan pcr-buis met 49,5 μl water, 7,5 μl 10X Amplification Master Mix, 3,0 μl 1 mM dNTP-mix (1 mM dATP, dCTP, dGTP, 0,3 μl 1 mM dTTP- en 5,0 μl WGA DNA Polymerase.</li>
			<li>Gebruik het volgende profiel voor de reactie: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq3.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
			<li>Ethanol precipitaat de gelabelde sonde door 1/10 het uiteindelijke reactievolume (7,5 μl voor 75 μl reactie) van 3 M natriumacetaat pH 5,2 en 2-3 volumes van 100% ethanol toe te voegen. Koel dna-monster bij -80 °C gedurende ten minste 30 minuten.</li>
			<li>Centrifugeer het monster gedurende 10 minuten bij 4 °C om gelabelde pellets te maken en supernatante en luchtdroge pellets te verwijderen.</li>
			<li>Maak als volgt een hybridisatiebuffer: 0,2 g Dextransulfaat 1200 μl Gedeioniseerd formamide 580 μl H2O 120 μl 20X SSC</li>
			<li>Voeg 40 μl hybridisatiebuffer toe aan luchtgedroogde pellets.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>DNA-versterking en sondevoorbereiding via REPLI-G Single Cell WGA gevolgd door nick-translation<ol>
<li>Volg het REPLI-g Single Cell WGA Kit protocol om het versterkte DNA te produceren:<ol>
<li>Bereid Buffer D2 (3 μl van 1 M DTT + 33 μl Buffer DLB) voor.</li>
			<li>Meng 4 μl gezuiverd microdissected materiaal met 3 μl Buffer D2. Flick buis te mengen. Incubeer gedurende 10 minuten bij 65 °C. Voeg 3 μl Stop-oplossing toe; mengen.</li>
			<li>Voeg 9 μl H2O, 29 μl REPLI-g reactiebuffer en 2 μl REPLI-g DNA-polymerase toe aan het monster. Incubeer bij 30 °C gedurende 8 uur. Inactiveren DNA polymerase door verhitting tot 65 °C gedurende 3 min. Bewaar DNA bij -20 °C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Volg het nick vertaalprotocol om REPLI-g versterkt DNA te labelen:<ol>
<li>Bereid de volgende etiketteringsmix voor: 1 μg versterkt DNA 5 μl 10X DNA Polymerase Buffer 5 μl 10x dNTP 5 μl 1X BSA 1 μl 1 mM Gelabelde dNTP 4 μl 1 U/μl DNase I 1 μl 10 U/μl DNA Polymerase I H2O tot 50 μl</li>
			<li>Incubeer bij 15 °C gedurende 2 uur. Voeg 2 μl 0,5 M EDTA toe om de reactie te stoppen. Controleer de grootte van het DNA-fragment door op gel te lopen.</li>
			<li>Volg stappen van 4.1.4.3-4.1.4.6 om pellet te precipitaat en oplosbaar te maken.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>5) 2D FISH op polytene en mitotische chromosoompompoenpreparaten
Raadpleeg gedetailleerde protocollen voor FISH over preparaten van polytene squashen 47 en mitotische chromosoomdia's 48. Hier geven we korte protocollen.
<ol><li>VIS op polytene chromosoompompoenpreparaten<ol>
<li>Dompel dia's 20 minuten onder in 1X PBS bij RT. Bevestig dia's in 4% Paraformaldehyde in 1X PBS gedurende 1 min.</li>
		<li>Dehydrateer dia's door ethanolwassingen: 50%, 70%, 90%, 100% gedurende elk 5 min bij RT. Luchtdroge dia's.</li>
		<li>Verwarm de sonde voor in de hybridisatiebuffer bij 37 °C. Voeg 10-20 μl sonde toe om te schuiven. Deksel met 22 X 22 mm afdeklip. Druk eventuele luchtbellen uit met behulp van een pipetpunt.</li>
		<li>Denature chromosomen en sonde bij 90 °C gedurende 10 min. Afdichtingsranden van coverslip met rubbercement. Breng de schuif over naar de vochtige kamer en incubeer 's nachts bij 39 °C.</li>
		<li>Was de dia's met 1X SSC op 39 °C gedurende 20 min. Was de dia's met 1X SSC bij RT gedurende 20 min. Spoel dia's af in 1X PBS en voeg vervolgens Prolong anti-fade toe met DAPI. Dek af met een afdeklip en bewaar deze ten minste een uur voor visualisatie in een diavak bij 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>VIS op mitotische chromosoompompoenpreparaten<ol>
<li>Extract mitotische chromosomen uit imaginale schijven van 4e instar larve van An. gambiae.</li>
		<li>Bereid chromosoomdia's voor die geschikt zijn voor FISH.</li>
		<li>Voeg 2-3 μl gelabelde DNA-sonde toe aan de hybridisatiebuffer in een buis en meng voorzichtig door pipetten.</li>
		<li>Breng 10 μl van het sondemengsel aan op de glijbaan en dek af met een afdeklip van 22 x 22 mm. Druk eventuele luchtbellen uit met behulp van een pipetpunt.</li>
		<li>Voor counterstaining en detectie past u Prolong anti-fade met DAPI toe op het preparaat en blijft u ten minste een uur voor visualisatie in het donker.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6) 3D VISSEN op geheel-onderstel ovariumweefsel
<ol><li>Bereid de volgende Buffer A mix voor: 60 mM KCl 15 mM NaCl 0,5 mM Spermidine 0,15 mM Spermine 2 mM EDTA 0,5 mM EGTA 15 mM BUIZEN</li>
	<li>Bereid dia's voor op nucleaire visualisatie door een laag nailpolish toe te voegen in een vierkant patroon dat overeenkomt met de grootte van de coverslips. Dit creëert een verhoogd oppervlak om verplettering van kernen te voorkomen bij het plaatsen op de afdeklip in de toekomst.</li>
	<li>Ontleed verse eierstokken van Christopher's stadium 3 vrouwtjes en bewaar in een oplossing van 150-250 μl Buffer A met 0,5% digitonine. Voer grotere dissectienaald over follikels (in buis met buffer A met 0,5% digitonine) om folliculaire membraan te vernietigen.</li>
	<li>Vortex gedurende 5-10 minuten om de follikels verder te verstoren. Schraap alle grote folliculaire stukken en centrifugebuis gedurende 30 seconden bij de laagste instelling van ~ 500 omwentelingen per minuut (RPM). Breng supernatant over naar een nieuwe Eppendorf-buis van 2 ml en voeg 100 μl buffer A toe. Herhaal stap 6.3 tussen 5-7 keer, totdat het zichtbare weefsel in kleine deeltjes is gebroken.</li>
	<li>Draai beide buizen 10 minuten bij 2.000 rpm. Gooi supernatant weg in beide buizen. Opmerking: Beide buizen worden gebruikt voor het maken van definitieve nucleaire visualisatiedia's. De buis met verzameld supernatans moet voornamelijk geëxtraheerde kernen bevatten, terwijl de oorspronkelijke buis met weefsel een mengsel van weefsel en kernen bevat die zijn ingebed in verpleegkundige cellen. Voeg 200 μl buffer A – 0,1% Triton toe en incubeer 's nachts bij 4 °C. Centrifugeer 5 min bij 10.000 RPM (10.621 x G) en verwijder supernatant.</li>
	<li>Voeg 200 μl 4% Paraformaldehyde toe aan PBS. Incubeer in thermomixer gedurende 30 minuten, mengen bij 450 RPM. Centrifugeer 5 min bij 5.000 RPM (2.655 x G) en verwijder supernatant. Wassen met Buffer A met 0,1% Triton gedurende 5 min, mengen bij 450 RPM in thermomixer. Centrifugeer 5 min bij 5.000 RPM (2.655 G) en verwijder supernatant.</li>
	<li>Voeg voorverwarmde sonde met een label van 37 °C toe aan de buis. Denature bij 95 °C in thermomixer, mengen bij 450 RPM, gedurende 10 min. Blijf gedurende 15 minuten bij 80 °C denatureren met voortdurend mengen. Incubeer bij 37 °C in thermomixer, met 450 RPM 's nachts mengen. Centrifugeer 5 min bij 5.000 RPM (2.655 x G). Verwijder supernatant.</li>
	<li>Wassen met Buffer A met 0,1% Triton gedurende 5 min. Centrifugeer 5 min bij 5.000 RPM (2.655 x G). Herhaal dit 2 keer. Breng drop van Prolong Anti-fade aan met DAPI.</li>
	<li>Pipet kernen/DAPI-oplossing voorzichtig uit (vermijd bubbels), breng aan op dia en dek af met een afdeklip.</li>
</ol>

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Er zijn meerdere stappen cruciaal om DNA uit microdissecte polytene chromosoommonsters succesvol te versterken. Het protocol maakt gebruik van het gebruik van LCM, een methode die zowel de algehele efficiëntie verhoogt als de blootstelling aan vreemd DNA vermindert door de interactie van fysieke hulpmiddelen met het monster te verwijderen. De versterking van vreemd DNA is echter nog steeds de grootste potentiële valkuil van dit experiment. Daarom is het tijdens het hele proces essentieel om de monsters te beschermen tegen verontreiniging. Tijdens de diavoorbereidings- en microdissectiefasen is het essentieel om dissectienaalden, dia's, afdekstroken en de werkruimte te wassen.  Het wordt ook aangeraden om alle toepasselijke apparatuur (naalden, dia's, afdeklips) voor gebruik te UV-behandelen.
Het membraan op de dissectieglaasjes maakt het verspreiden van de chromosomen erg moeilijk.  Het is belangrijk om meer van de eierstok (half tot een volledig paar eierstokken) te gebruiken bij het maken van deze dia's, om een grotere kans te bieden op het vinden van een goed gespreide kern.  Het wordt ook aanbevolen om vers weefsel te gebruiken bij het maken van dia's, omdat de versterkingspercentages lijken te dalen naarmate weefsels 49 jaar oud worden en chromosoomverspreiding uitdagender wordt.  De voorbereiding van dia's voor microdissection is de meest tijdrovende stap in dit protocol.  Chromosomen moeten goed worden verspreid om onbedoelde verwerving van ongewenst materiaal te voorkomen.  Giemsa-kleuring stelt de gebruiker in staat om de verspreidingskwaliteit te controleren met een fasecontrastmicroscoop voordat het microdissectiesysteem wordt gebruikt.
De combinatie van microdissection en amplification biedt de mogelijkheid om chromosomale fragmenten te extraheren en te analyseren, variërend in grootte van kleine gebieden van belang tot een meerderheid van de armen.  Dit protocol stelt de gebruiker in staat om DNA te verkrijgen uit morfologisch verschillende gebieden zoals inversies, specifieke euchromatische banden en interbanden, telomerische, centromere en intercalaire heterochromatine. De gebruiker kan de gegenereerde schilderijsondes toepassen op het onderzoeken van afwijkende chromosomen, het bestuderen van inter-species homologie op bepaalde loci, of het karakteriseren van ruimtelijke organisatie van chromosomen in een intacte 3D-kern. Voor het ontwikkelen van chromosoomverven selecteerden we euchromatische segmenten om hybridisatie van repetitief DNA met meerdere chromosomale gebieden te voorkomen. Als gevolg hiervan hebben we armspecifiek schilderen verkregen zonder een concurrent te gebruiken, zoals totaal genomisch DNA of C0t-1 DNA-fractie.
We kozen ervoor om de GenomePlex WGA- en REPLI-G-kits te gebruiken op basis van beoordelingen die de efficiëntie en uitvalsnelheid van meerdere versterkingskits 40,44vergeleken.  Beide kits presteerden het beste onder de beschikbare methoden in beide uitvalpercentages (GenomePlex had een tarief van 12,5% in vergelijking met REPLI-g's 37,5%) en percentage versterkte markers (GenomePlex had een versterkingspercentage van 45,24% versus REPLI-g's 30,0%) 40. De GenomePlex-kit leverde ook een grotere hoeveelheid DNA en maakte het dus een betere kandidaat voor meerdere downstream-technieken.  Er is ook een re-amplificatiekit voor het GenomePlex-systeem beschikbaar, waardoor DNA verder kan worden versterkt. Het is echter belangrijk op te merken dat versterking niet perfect is.  De mogelijkheid blijft bestaan dat succesvolle versterking fouten kan veroorzaken of een voorkeur kan hebben voor specifieke loci in het doel-DNA. Het is belangrijk om de uiteindelijke fragmentgrootte van de beschikbare genoomversterkingsmethoden te overwegen.  GenomePlex-fragmentatie resulteert in een bibliotheek met fragmenten variërend van 200-500 bp, terwijl de REPLI-g-kit fragmenten produceert van ongeveer 10-20 kb groot. De beoogde downstream-toepassing van dit protocol is FISH, waardoor de GenomePlex-kit een meer haalbare optie is, omdat deze de gewenste fragmentgrootte en de mogelijkheid bood om DNA-fragmenten rechtstreeks via WGA te labelen. Lange DNA-moleculen geproduceerd door de REPLI-g-versterking moeten worden gefragmenteerd in de downstream nick-translation labeling reactie.
Dit protocol is aangepast om dna van een enkele polytene chromosoomarm met succes te versterken.  Andere protocollen vereisen het bundelen van veel (meestal 10-30) chromosoomfragmenten om het monster 7,11,28,40met succes te versterken .  Hoewel het bundelen van meerdere chromosomen mogelijk is met behulp van onze methode, benadrukt de verhoogde kans op monsterbesmetting het belang van het starten van het experiment met zo min mogelijk chromosomen. Als polytene chromosomen niet beschikbaar zijn, kan ons protocol worden aangepast voor gebruik in mitotische chromosomen. Het kan echter nodig zijn om 10-15 mitotische chromosomen te bundelen voordat ze worden versterkt voor succesvolle FISH 11. Versterkingsbias is lager bij grote hoeveelheden startsjabloon DNA 50. Polytene chromosomen leveren ongeveer 512 kopieën van een enkele DNA-sequentie en 1024 kopieën van twee homologe DNA-sequenties.  Het bundelen van mitotische chromosomen zal dus helpen om de algehele kwaliteit van dna-producten na versterking te verhogen.
Deze procedure heeft vele potentiële toepassingen in cytogenetische en genomische studies. Hier gebruikten we chromosoomverven om de correspondentie tussen euchromatische segmenten van polytene en mitotische chromosoomarmen in An. gambiaevast te stellen . Dezelfde schilderij sondes kunnen worden toegepast op cytogenetische karakterisering van An. gambiae cellijnen. Uitgebreide genomische herschikkingen en veranderingen in chromosoomnummers zijn gemeenschappelijke kenmerken van cellijnen 51,52. Aneuploïdie, polyploïdie en chromosomale herschikkingen zoals translocaties, inversies, deleties en ringchromosomen zijn gedetecteerd in verschillende muggencellijnen 53,54. Klassieke cytogenetische observaties 55 en fysieke mapping 56 hebben aangetoond dat chromosomale translocaties van de hele arm voorkomen in de evolutie van malariamuggen. Daarom kan microdissected materiaal worden gebruikt in combinatie met FISH-experimenten om homologie van chromosomale regio's tussen soorten te vergelijken. We hebben met succes 3D FISH uitgevoerd met de 2R-schilderende sonde op polytene chromosomen in hele berg eierstokverpleegkundige cellen. Deze methode zal het traceren van chromosoombanen vergemakkelijken en de nucleaire architectuur in Anophelesbestuderen . Technieken zoals DNA genotypering 57,58, next-generation genoom sequencing 26,27, fysieke en linkage kaart ontwikkeling, en generatie van sondes voor chromosoom schilderen 33,59 kunnen allemaal profiteren van arm- en regio-specifieke microdissection. Door LCM-technologie te combineren met het bevorderen van eencellige WGA, demonstreren we een efficiënte, praktische methode voor het produceren van redelijke hoeveelheden DNA uit een enkele polytene-chromosoomarm.

Chromosoomschilderen is een nuttige techniek voor het bestuderen van de evolutie van karyotypes 1-5 en voor het visualiseren van cytogenetische afwijkingen via hybridisatie van fluorescerend gelabeld chromosoom-DNA 1,6-8. Deze methode wordt ook toegepast op het bestuderen van de 3D-dynamiek van chromosoomgebieden in ontwikkeling 9 en pathologie 10. Differentieel gelabelde chromosoomverven worden gebruikt voor de visualisatie van individuele mitotische 11,12, meiotische 13,14, of interfase niet-polytene 15,16 en polytene 9,11,17 chromosomen. Een eenvoudig en robuust protocol om chromosoomverven te verkrijgen zou zeer nuttig zijn bij het uitbreiden van deze techniek naar niet-modelorganismen, zoals muggen. Het Anopheles gambiae complex is een groep van zeven morfologisch niet te onderscheiden muggen die variëren in gedrag en aanpassing, waaronder het vermogen om malaria over te brengen.  Deze muggen dienen als een uitstekend model om de evolutie van nauw verwante soorten die sterk verschillen in hun vectoriële capaciteit beter te begrijpen.  De meeste cytogenetische studies bij malariamuggen zijn gedaan met behulp van goed ontwikkelde, sterk gepolyteniseerde chromosomen (beoordeeld in 18,19). De leesbare banderollerenpatronen van polytene chromosomen stelden onderzoekers in staat om de associatie tussen polymorfe inversies en ecologische aanpassingen in Anopheles gambiae 20aan te tonen. Ook weefselspecifieke 21 en soortspecifieke 22 kenmerken van 3D-polytene-chromosoomorganisatie zijn gekarakteriseerd in het An. macullipennis-complex. Het bestuderen van mitotische chromosomen kan echter aanvullende belangrijke informatie opleveren. Bijvoorbeeld, een hoger niveau van heterochromatine polymorfisme waargenomen in mitotische chromosomen is gecorreleerd met verminderde paringsactiviteit en vruchtbaarheid in An. gambiae 23. De overeenstemming tussen euchromatische segmenten van polytene en mitotische chromosoomarmen kan moeilijk vast te stellen zijn door alleen hun relatieve lengtes te vergelijken. Dit komt omdat heterochromatine een aanzienlijk deel van de mitotische chromosomen uitmaakt, maar ondervertegenwoordigd is in polytene-chromosomen 24. De beschikbaarheid van chromosoomverven voor malariamuggen zou onderzoekers in staat stellen om cytogenetische studies aanzienlijk uit te breiden door extra soorten op te neemt, terwijl de kosten en tijd aanzienlijk worden verminderd in de analyses van karyotypische evolutie en 3D-dynamiek van chromosomen in deze groep epidemiologisch belangrijke insecten.
Om grote delen van chromosomen te verkrijgen, is microdissection een integrale techniek geworden om specifieke gebieden van belang van de chromosomale aanvulling te manipuleren en te isoleren.  In combinatie met whole genome amplification (WGA) resulteert microdissection in krachtige downstream toepassingen, waaronder FISH 11,12 en next-generation genome sequencing 25-27. Voorheen vereiste de techniek het gebruik van gespecialiseerde microdissectienaalden die handmatig moesten worden bediend door een ervaren gebruiker 28.  De vooruitgang van laser capture microdissection (LCM) heeft geresulteerd in een vereenvoudigd hulpmiddel dat beter geschikt is voor het isoleren van enkele cellen 29,30 of individuele chromosomen 31-33 met een verminderd risico op besmetting. Deze aanpak stelt de gebruiker in staat om de genetische heterogeniteiten en chromosomale afwijkingen te bestuderen die optreden in afzonderlijke cellen, in plaats van een consensuslandschap dat het resultaat is van het bundelen van meerdere cellen 34-36. Er zijn meerdere methoden gebruikt om het DNA van microdissection te versterken.  DOP-PCR, een techniek die nuttig is voor de versterking van zeer repetitieve sequenties, is gebruikt om microdissected chromosomen van soorten te versterken, waaronder de sprinkhaan 37, de stekelige paling 38, en de Nijl tilapia 39.  Meer recentelijk zijn de PCR-gebaseerde GenomePlex WGA4 Single Cell kit en multiple displacement amplification based (MDA) Repli-G Single Cell kit waardevolle tools geworden voor experimenten met genetische analyse van enkelvoudige menselijke cellen en chromosomen40-42, waaronder de B-chromosoomsystemen in sprinkhanen 37 en sprinkhanen 43. Deze twee kits hebben elk voor- en nadelen, maar hun schijnbare superioriteit ten opzichte van andere beschikbare versterkingssystemen is aangetoond 44.
De hoeveelheid DNA die kan worden verkregen uit een enkel chromosoom of een chromosoomsegment is aanzienlijk kleiner dan die van een hele kern. Daarom zijn microdissection, amplificatie en daaropvolgende analyse van een enkel chromosoom veel uitdagender, vooral bij organismen met kleine genomen zoals in Drosophila of Anopheles.  Hoewel verven zijn ontwikkeld uit enkele microdissected chromosomen van een mens 33 en een wesp 45, vereiste een succesvol FISH-experiment meerdere (ten minste 10-15) microdissected mitotische chromosomen van een fruitvlieg 11. Het vermogen om een enkel chromosoom te microdisectie en te versterken zou echter belangrijk zijn voor (i) het verminderen van de kans op besmetting met materiaal van een ander chromosoom, (ii) het minimaliseren van het aantal chromosomale preparaten dat nodig is voor microdissection, (iii) het verlagen van nucleotide en structureel polymorfisme van het microgedisseceerde monster in zowel FISH- als sequencing downstreamtoepassingen. Polytene chromosomen gevonden in veel Dipteran soorten bieden een unieke kans om een veel hogere starthoeveelheid DNA te verwerven. Ze bieden ook een hogere resolutie en chromosoomstructuur die niet kan worden bereikt door het gebruik van mitotische chromosomen. Deze toegevoegde resolutie kan van cruciaal belang zijn bij het visualiseren van chromosomale herschikkingen, chromatinestructuur en chromosomale segmenten die moeten worden gemicrodissecteerd 28,46.
Hier presenteren we een procedure om een euchromatisch segment efficiënt te isoleren van een enkele polytene chromosoomarm, het DNA te versterken en te gebruiken in downstream FISH-toepassingen bij malariamuggen.  Eerst passen we LCM toe om een enkele chromosoomarm te isoleren en te extraheren uit speciaal voorbereide membraanglijbanen. Ten tweede wordt WGA gebruikt om het DNA van het microdissected materiaal te versterken. Ten derde hybridiseren we het versterkte DNA in FISH-experimenten tot polytene squashpreparaten 47,metafase en interfasechromosoomdia's 48,evenals 3D-eierstokmonsters. Deze procedure is gedaan om met succes een meerderheid van de euchromatine te schilderen in chromosomale armen van An. gambiae.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="562">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">A491-212</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Methanol</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:120px;">A412-4</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Propionic acid&#160;</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">402907</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Membrane slides 1.0 PET</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;">415190-9051-000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Buffer tablets &#8220;GURR&#8221;</td>
			<td style="width:112px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">10582-013</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">KaryoMAX Giemsa Stain</td>
			<td style="width:112px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">10092-013</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">ThermoBrite Slide Denaturation/Hybridization System</td>
			<td style="width:112px;">Abbott Molecular</td>
			<td style="width:120px;">30-144110</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Vacufuge vacuum concentrator</td>
			<td style="width:112px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:120px;">22820001</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">Spectroline Microprocessor-Controlled UV Crosslinker XL-1000</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">11-992-89</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:59px;width:191px;">Thermo Scientific NanoDrop</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">ND-2000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">REPLI-g Single Cell Kit</td>
			<td style="width:112px;">Qiagen</td>
			<td style="width:120px;">150343</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:191px;">GenomePlex Single Cell Kit (WGA4)</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">WGA4-10RXN</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">GenomePlex WGA Reamplification Kit (WGA3)</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">WGA3-50RXN</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:191px;">MZ6 Leica stereomicroscope</td>
			<td style="width:112px;">Leica</td>
			<td style="width:120px;">VA-OM-E194-354</td>
			<td style="width:139px;">A different stereomicroscope can be used</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">Olympus CX41 Phase Microscope</td>
			<td style="width:112px;">Olympus</td>
			<td style="width:120px;">CX41RF-5</td>
			<td style="width:139px;">A different phase microscope can be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">PALM MicroBeam Laser Microdissection Microscope</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Thermomixer</td>
			<td style="width:112px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:120px;">22670000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">10x PBS</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:120px;">P5493</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">50x Denhardt&#8217;s solution</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">D2532</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">99% Formamide</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP227500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Dextran sulfate sodium salt</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td style="width:120px;">D8906</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">20x SSC buffer</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:120px;">AM9765</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">ProLong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:120px;">P-36931</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">dATP, dCTP, dGTP, dTTP</td>
			<td style="width:112px;">Fermentas</td>
			<td style="width:120px;">R0141, R0151, R0161, R0171</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Cy3-dUTP, Cy5-dUTP</td>
			<td style="width:112px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:120px;">PA53022, PA55022</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">BSA</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">A3294</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">DNA polymerase I</td>
			<td style="width:112px;">Fermentas</td>
			<td style="width:120px;">EP0041</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">DNase I&#160;</td>
			<td style="width:112px;">Fermentas</td>
			<td style="width:120px;">EN0521</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Spermine</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">S3256-1G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Spermidine</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">S0266-1G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP366-500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP3581</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">EGTA</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">E0396-25G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">PIPES</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">P6757-25G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">EDTA</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">S311-500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Digitonin</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">D141-100MG</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Triton-X100</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP151-100</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">AdhesiveCap 500 clear</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;">415190-9211-000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">QIAamp DNA Micro Kit (50)</td>
			<td style="width:112px;">Qiagen</td>
			<td style="width:120px;">56304</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Genomic DNA Clean and Concentrator Kit</td>
			<td style="width:112px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:120px;">D4010</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">37% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">F79-500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

2d and 3d chromosome painting in malaria mosquitoes

Fluorescente in situ hybridisatie (FISH) van hele armchromosoomsondes is een robuuste techniek voor het in kaart brengen van genomic regio's van belang, het detecteren van chromosomale herschikkingen en het bestuderen van driedimensionale (3D) organisatie van chromosomen in de celkern. De komst van laser capture microdissection (LCM) en whole genome amplification (WGA) maakt het mogelijk om grote hoeveelheden DNA uit enkele cellen te verkrijgen. De verhoogde gevoeligheid van WGA-kits bracht ons ertoe om chromosoomverven te ontwikkelen en deze te gebruiken voor het verkennen van chromosoomorganisatie en evolutie in niet-modelorganismen. Hier presenteren we een eenvoudige methode voor het isoleren en versterken van de euchromatische segmenten van enkele polytene chromosoomarmen uit eierstokverpleegkundige cellen van de Afrikaanse malariamug Anopheles gambiae. Deze procedure biedt een efficiënt platform voor het verkrijgen van chromosoomverven, terwijl het algehele risico op het introduceren van vreemd DNA in het monster wordt verminderd. Het gebruik van WGA maakt verschillende rondes van re-amplificatie mogelijk, wat resulteert in grote hoeveelheden DNA die kunnen worden gebruikt voor meerdere experimenten, waaronder 2D en 3D FISH. We hebben aangetoond dat de ontwikkelde chromosoomverven met succes kunnen worden gebruikt om de overeenstemming tussen euchromatische delen van polytene en mitotische chromosoomarmen in An. gambiaevast te stellen . Over het algemeen biedt de vereniging van LCM en WGA met één chromosoom een efficiënt instrument voor het creëren van aanzienlijke hoeveelheden doel-DNA voor toekomstige cytogenetische en genomische studies.

Figuur 1 beschrijft de algehele doorstroming van het protocol dat in dit artikel wordt beschreven.  De gebruiker begint in eerste instantie met het microdissecteren van chromosoom-DNA-monsters van membraanglijbanen.  Microdissected materiaal wordt geëxtraheerd en gezuiverd. Het gezuiverde DNA wordt vervolgens versterkt, opnieuw versterkt, gelabeld en vervolgens gebruikt voor FISH om chromosoomspreads te labelen.
Het LCM-protocol kan worden onderverdeeld in drie algemene stappen: 1) Het vinden van interessechromosomen en het voorbereiden van het snijgebied(figuur 2A),2) Het snijden en katapulteren van het chromosoomgebied van belang via laser(figuur 2B) en 3) Controleren of het monster daadwerkelijk in kleefdop wordt gekatapulteerd (figuur 2C). Het proces van LCM dat wordt gebruikt op de Polytene chromosomen van de An. gambiae Sua stam wordt getoond in Video 1. De video beschrijft het hele proces vanaf het opstarten van het programma, inclusief belangrijke softwarefuncties en tips.
GenomePlex- en REPLI-g eencellige WGA-kits die in dit protocol worden gebruikt, verschillen sterk in de resulterende productgrootte en de algehele opbrengst.  Figuur 3 toont de resultaten van gel-elektroforese voor de GenomePlex- en REPLI-g-kits, evenals kwantificering van de monsters door Nanodrop.
Microdissected materiaal is gebruikt om FISH-sondes te maken die zich richten op euchromatische gebieden van een chromosoom.  Figuur 4 toont FISH van vijf sondes gegenereerd uit microdissected materiaal op polytene chromosomen van An. gambiae.  Vier autosomale armen werden gelabeld met drie fluoroforen met behulp van de WGA3-kit: het 3R-chromosoom is gelabeld in groen (fluoresceïne), het 3L-chromosoom is in een mengsel van rood (Cy-3) en geel (Cy-5), het 2R-chromosoom is geel (Cy-5) en het 2L-chromosoom is rood (Cy-3). Het X-chromosoom werd in een apart experiment in oranje (Cy-3) geëtiketteerd met behulp van nick-vertaling van het REPLI-g-materiaal. Om de overeenstemming tussen euchromatische delen van polytene en mitotische chromosoomarmen vast te stellen, zijn chromosoomverven gehybridiseerd tot interfase-, profase-, prometafase- en metafasechromosomen van An. gambiae (figuur 5).  Om de 3D-organisatie van een enkele polytene chromosoomarm in de celkern te visualiseren, werd whole mount FISH uitgevoerd op An. gambiae Sua stam ovariële verpleegkundige cellen (Video 2).  Verschillende chromosoomarmgebieden zijn duidelijk te zien in kernen met interfase (figuur 5D) en polytene (Video 2) chromosomen.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig1.jpg"> Figuur 1. Schematische weergave van de experimentele procedures voor de bereiding van chromosoomverven. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig2.jpg"> Figuur 2. De belangrijkste stappen in chromosoommicrodsectie. A) Laserondersteund snijden van het chromosomale gebied van belang door het membraan. B) Het membraan met een gat na het katapulteren wordt uitgevoerd. C) Het zicht op het gekatapulteerde stuk van het membraan met daarin een chromosoomsegment bevestigd aan de kleefdop. De pijl geeft de heterochromatine van het X-chromosoom aan die op de dia bleef. Het sterretje toont een stuk van een ander chromosoom dat op de dia bleef. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig2highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig3.jpg"> Figuur 3. Agarose gel afbeeldingen tonen DNA na WGA. A) Laag moleculair gewicht (200-500 bp) DNA van arm 3R na gebruik van de WGA4- en WGA3 GenomePlex-kits. B) Hoog moleculair gewicht (10-20 kb) DNA van arm 2L na REPLI-g versterking. De 100 bp ladder is te zien in de linker rijstroken. De onderstaande gelafbeeldingen tonen DNA-concentraties gemeten door Nanodrop. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig3highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig4.jpg"> Figuur 4. Het schilderen van polytenechromosomen van eierstokverpleegkundigecellen van An. gambiae met behulp van vier sondes gegenereerd uit microdissected materiaal. Het X-chromosoom is gelabeld in oranje (Cy-3) door nick-vertaling van het REPLI-g-materiaal. De 2R-arm is geel gelabeld (Cy-5); de 2L-arm is rood (Cy-3); de 3R-arm is groen gelabeld (fluoresceïne); de 3L-arm is gelabeld in een mengsel van rood (Cy-3) en geel (Cy-5). Autosomen zijn gelabeld met de WGA3-versterkingskit. Chromatine is blauw gekleurd (DAPI). Chromosoomnamen worden geplaatst in de buurt van telomerische gebieden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig4highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig5.jpg"> Figuur 5. Het schilderen van interfase (A), profase (B), prometafase (C) en metafase (D) chromosomen van larvale imaginele schijven van de An. gambiae Mopti stam met behulp van drie sondes gegenereerd uit microdissected materiaal gelabeld door WGA3. De 2R-arm is gelabeld in groen (fluoresceïne); de 2L-arm is niet gelabeld; de 3R-arm is in roze, een mengsel van rood (Cy-3) en oranje (Cy-5); de 3L-arm is oranje gelabeld (Cy-5). Het X-chromosoom heeft een rood label dat overeenkomt met de 18S rDNA-sonde. Chromatine is blauw gekleurd (DAPI). Felgekleurde gebieden van chromosomen komen overeen met de heterochromatine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig5highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.</a>
Video 1. Het proces van LCM van de An. gambiae polytene chromosomen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/Sharakhov_video1.mp4" target="_blank">Klik hier om Video 1 te bekijken.</a>
Video 2. Hele mount 3D FISH uitgevoerd op An. gambiae eierstokverpleegkundige cellen. De sonde is gelabeld in Cy-3 (afgebeeld in blauw) en is gemaakt van een microdissected 2R chromosoomarm.  Chromatine is gekleurd met DAPI en wordt afgebeeld door cyaan pseudo-kleuring (lichtblauw). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/Video2.avi" target="_blank">Klik hier om Video 2 te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about 2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes at JoVE.com

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

Chromosoomschilderen is een handige methode voor het bestuderen van de organisatie van de celkern en de evolutie van het karyotype. Hier demonstreren we een aanpak om specifieke interessegebieden te isoleren en te versterken van enkele polytene chromosomen die vervolgens worden gebruikt voor twee- en driedimensionale fluorescerende in situ hybridisatie (FISH).

2D en 3D Chromosoom schilderen in Malaria Muggen

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

2d-and-3d-chromosome-painting-in-malaria-mosquitoes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

Een eenvoudige Chelex protocol voor DNA-extractie van<em&gt; Anopheles</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes. Investigation of transcripts and gene regulators that are expressed in tissues in which the mosquito host and pathogen interact, and in organs involved in reproduction are of great interest for strategies to reduce mosquito-borne disease transmission and disrupt egg development. A number of tools have been employed to study and validate the temporal and tissue-specific regulation of gene expression. Here, we describe protocols that have been developed to obtain spatial information, which enhances our understanding of where specific genes are expressed and their products accumulate. The protocol described has been used to validate expression and determine accumulation patterns of transcripts in tissues related to mosquito-borne pathogen transmission, such as female salivary glands, as well as subcellular compartments of ovaries and embryos, which relate to mosquito reproduction and development. 
 The following procedures represent an optimized methodology that improves the efficiency of various steps in the protocol without loss of target-specific hybridization signals. Guidelines for RNA probe preparation, dissection of soft tissues and the general procedure for fixation and hybridization are described in Part A, while steps specific for the collection, fixation, pre-hybridization and hybridization of mosquito embryos are detailed in Part B.

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Temporal and spatial gene expression analyses have a crucial role in functional genomics. Whole-mount hybridization in situ is useful for determining the localization of transcripts within tissues and subcellular compartments. Here we outline a hybridization in situ protocol with modifications for specific target tissues in mosquitoes.

Hybridisatie<em&gt; In situ</em&gt; Van de speekselklieren, eierstokken, en embryo&#39;s van Vector Muggen

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. One important application of this method is the development of high-quality physical maps useful for improving the genome assemblies for various organisms. The natural banding pattern of polytene and mitotic chromosomes provides guidance for the precise ordering and orientation of the genomic supercontigs. Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, a well-established chromosome-based mapping technique has been developed only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes 1. As a result of genome mapping efforts, 88% of the An. gambiae genome has been placed to precise chromosome positions 2,3 . Two other mosquito genera, Aedes and Culex, have poorly polytenized chromosomes because of significant overrepresentation of transposable elements in their genomes 4, 5, 6. Only 31 and 9% of the genomic supercontings have been assigned without order or orientation to chromosomes of Ae. aegypti 7 and Cx. quinquefasciatus 8, respectively. Mitotic chromosome preparation for these two species had previously been limited to brain ganglia and cell lines. However, chromosome slides prepared from the brain ganglia of mosquitoes usually contain low numbers of metaphase plates 9. Also, although a FISH technique has been developed for mitotic chromosomes from a cell line of Ae. aegypti 10, the accumulation of multiple chromosomal rearrangements in cell line chromosomes 11 makes them useless for genome mapping. Here we describe a simple, robust technique for obtaining high-quality mitotic chromosome preparations from imaginal discs (IDs) of 4th instar larvae which can be used for all three genera of mosquitoes. A standard FISH protocol 12 is optimized for using BAC clones of genomic DNA as a probe on mitotic chromosomes of Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus, and for utilizing an intergenic spacer (IGS) region of ribosomal DNA (rDNA) as a probe on An. gambiae chromosomes. In addition to physical mapping, the developed technique can be applied to population cytogenetics and chromosome taxonomy/systematics of mosquitoes and other insect groups.

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, physical genome mapping techniques were established only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes. For the genera of Aedes and Culex, however, cytogenetic mapping remains challenging because of the poor quality of polytene chromosomes. Here we present a universal protocol for obtaining high-quality preparations of mitotic chromosomes and an optimized FISH protocol for all three genera of mosquitoes.

Fluorescerende<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie op Mitotische Chromosomen van muggen

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency and type of chromosome aberrations in different cell types allows defects in DNA repair pathways to be elucidated. Understanding mammalian DNA repair biology has been greatly helped by the production of mice with knockouts in specific genes. The goal of this protocol is to quantify genomic instability in mouse B lymphocytes. Labeling of the telomeres using PNA-FISH probes (peptide nucleic acid - fluorescent in situ hybridization) facilitates the rapid analysis of genomic instability in metaphase chromosome spreads. B cells have specific advantages relative to fibroblasts, because they have normal ploidy and a higher mitotic index. Short-term culture of B cells therefore enables precise measurement of genomic instability in a primary cell population which is likely to have fewer secondary genetic mutations than what is typically found in transformed fibroblasts or patient cell lines.

DNA repair pathways are essential for maintenance of genomic integrity and preventing mutation and cancer. The goal of this protocol is to quantify genomic instability by direct observation of chromosome aberrations in metaphase spreads from mouse B cells using fluorescent in situ hybridization (FISH) for telomeric DNA repeats.

Snelle analyse van chromosoomafwijkingen in Muis B-lymfocyten door PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria

Despite decades of eradication efforts, malaria remains a global burden. Recent renewed interest in regional elimination and global eradication has been accompanied by increased genomic information about Plasmodium parasite species responsible for malaria, including characteristics of geographical populations as well as variations associated with reduced susceptibility to anti-malarial drugs.
One common genetic variation, single-nucleotide polymorphisms (SNPs), offers attractive targets for parasite genotyping. These markers are useful not only for tracking drug resistance markers but also for tracking parasite populations using markers not under drug or other selective pressures.
SNP genotyping methods offer the ability to track drug resistance as well as to fingerprint individual parasites for population surveillance, particularly in response to malaria control efforts in regions nearing elimination status.
While informative SNPs have been identified that are agnostic to specific genotyping technologies, high-resolution melting (HRM) analysis is particularly suited to field-based studies. Compared to standard fluorescent-probe based methods that require individual SNPs in a single labeled probe and offer at best 10% sensitivity to detect SNPs in samples that contain multiple genomes (polygenomic), HRM offers 2-5% sensitivity. Modifications to HRM, such as blocked probes and asymmetric primer concentrations as well as optimization of amplification annealing temperatures to bias PCR towards amplification of the minor allele, further increase the sensitivity of HRM. While the sensitivity improvement depends on the specific assay, we have increased detection sensitivities to less than 1% of the minor allele.
In regions approaching malaria eradication, early detection of emerging or imported drug resistance is essential for prompt response. Similarly, the ability to detect polygenomic infections and differentiate imported parasite types from cryptic local reservoirs can inform control programs.
This manuscript describes modifications to high resolution melting technology that further increase its sensitivity to identify polygenomic infections in patient samples.

While high resolution melting analysis offers the ability to differentiate between single nucleotide polymorphisms in a heterogeneous population, mutant allele amplification bias can increase its ability to detect alleles present at relatively low percentages within a sample. This protocol describes improvements that improve the sensitivity of high resolution melting analysis.

Methoden om de gevoeligheid van hoge resolutie Melting Single Nucleotide Polymorphism genotypering in Malaria Verhoog

Despite decades of eradication efforts, malaria remains a global burden. Recent renewed interest in regional elimination and global eradication has been ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Model voor het meten van immuunrespons op Malaria in de context van HIV Co-infectie

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible for most malaria-related deaths globally. Several factors including parasite sequestration in tissues, vascular dysfunction, and inflammatory responses influence the evolution of the disease in malaria-infected people. P. falciparum-infected red blood cells (iRBCs) release small extracellular vesicles (EVs) containing different kinds of cargo molecules that mediate pathogenesis and cellular communication between parasites and host. EVs are efficiently taken up by cells in which they modulate their function. Here we discuss strategies to address the role of EVs in parasite-host interactions. First, we describe a straightforward method for labeling and tracking EV internalization by endothelial cells, using a green cell linker dye. Second, we report a simple way to measure permeability across an endothelial cell monolayer by using a fluorescently labeled dextran. Finally, we show how to investigate the role of small non-coding RNA molecules in endothelial cell function.

In this work, we describe protocols to investigate the role of extracellular vesicles (EVs) released by Plasmodium falciparum infected erythrocytes. In particular, we focus on the interactions of EVs with endothelial cells.

Beoordeling van extracellulaire vesikel functie tijdens Malaria infectie

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines and/or antivirals have underscored the urgent need to develop ZIKV reverse genetic systems to facilitate the study of ZIKV biology and the development of therapeutic and/or prophylactic approaches. However, like with other flaviviruses, the generation of ZIKV full-length infectious cDNA clones has been hampered due to the toxicity of viral sequences during its amplification in bacteria. To overcome this problem, we have developed a nontraditional approach based on the use of bacterial artificial chromosomes (BACs). Using this approach, the full-length cDNA copy of the ZIKV strain Rio Grande do Norte Natal (ZIKV-RGN) is generated from four synthetic DNA fragments and assembled into the single-copy pBeloBAC11 plasmid under the control of the human cytomegalovirus (CMV) immediate-early promoter. The assembled BAC cDNA clone is stable during propagation in bacteria, and infectious recombinant (r)ZIKV is recovered in Vero cells after transfection of the BAC cDNA clone. The protocol described here provides a powerful technique for the generation of infectious clones of flaviviruses, including ZIKV, and other positive-strand RNA viruses, particularly those with large genomes that have stability problems during bacterial&#160;propagation.

The recent epidemic of Zika virus highlights the importance of establishing reverse genetic approaches to develop vaccines and/or therapeutic strategies. Here, we describe the protocol to rescue an infectious recombinant Zika virus from a full-length cDNA clone assembled in a bacterial artificial chromosome under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter.

Redding van recombinante Zika virus uit een bacteriële kunstmatige chromosoom cDNA kloon

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

Vectorcompetentieanalyses op Aedes aegypti-muggen met behulp van het Zika-virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of disease cases each year. E. aedis causes mortality and reduced reproductive fitness in the mosquito vector and has been explored for its potential as a biocontrol agent. The protocol we present for culturing E. aedis is based on its natural infection cycle, which involves both horizontal and vertical transmission at different life stages of the mosquito host. Ae. aegypti mosquitoes are exposed to spores in the larval stage. These infected larvae then mature into adults and transmit the parasite vertically to their offspring. Infected offspring are then used as a source of spores for future horizontal transmission. Culturing E. aedis can be challenging to the uninitiated given the complexities of the parasite&#8217;s life cycle, and this protocol provides detailed guidance and visual aids for clarification.

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

A protocol to culture the microsporidian parasite Edhazardia aedis. The parasite is passaged from one generation of Aedes aegypti mosquitoes to the next via horizontal transfer at the larval stage followed by vertical transmission at the adult stage. Live sporoplasms survive long-term in infected eggs.

Voortplanting van de Microsporidische Parasiet Edhazardia aedis in Aedes aegypti Muggen

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of ...