Name: 2d and 3d chromosome painting in malaria mosquitoes
Uploaded: 2014-01-06T17:30:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about 2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par la subvention des National Institutes of Health 1R21AI094289 à Igor V. Sharakhov

1) Préparation de la lame du chromosome polytène pour la microdissection de capture laser
<ol><li>Disséquer les femelles anophèles semi-gravides à 25 heures après l’alimentation par le sang. Fixer les ovaires d’environ cinq femelles dans 500 μl de solution de Carnoy fraîchement modifiée (100% méthanol: acide acétique glacial, 3:1) à température ambiante pendant 24 heures. Transférer les ovaires à -20 °C pour un stockage à long terme.</li>
	<li>Préparez la solution de Carnoy (100% éthanol: acide acétique glacial, 3:1) et 50% d’acide propionique juste avant de faire des lames chromosomiques.</li>
	<li>Placez une paire d’ovaires dans une goutte de solution de Carnoy sur une lame de membrane PET Zeiss 1.0. Selon la taille, divisez les ovaires en environ 2-4 sections avec des aiguilles de dissection et placez-les dans une goutte d’acide propionique à 50% sur des lames propres sous un microscope de dissection.</li>
	<li>Séparer les follicules et enlever le tissu restant à l’aide d’une serviette en papier sous un stéréomicroscope de dissection. Ajouter une nouvelle goutte d’acide propionique à 50% aux follicules et leur laisser reposer pendant 3-5 min à température ambiante.</li>
	<li>Placez une lamelle de couverture siliconée sur le dessus de la gouttelette. Laissez reposer la glissière pendant environ 1 min.</li>
	<li>Couvrez la lame avec un matériau absorbant (le papier filtre est utilisé pour cette méthode), et tout en utilisant le côté gomme d’un crayon, appliquez une pression généreuse sur la lame de couverture en tapant dessus à plusieurs reprises avec la gomme.</li>
	<li>Chauffer la lame à 60 °C sur un système de dénéaturation/hybridation de la lame pendant 15 à 20 minutes pour aider à aplatir les chromosomes polytènes. Placez les lames dans une chambre humide à 4 °C pendant la nuit pour permettre à l’acide d’aplatir davantage les chromosomes.</li>
	<li>Placer les lames dans de l’éthanol froid à 50% pendant 10 min. Retirez délicatement la lamelle et remplacez froidement l’éthanol à 50% pendant 10 minutes de plus.</li>
	<li>Déshydrater les lames dans 70%, 90%, 100% éthanol pendant 5 min chacune. Toboggans secs à l’air.</li>
	<li>Préparer une solution de solution tampon GURR en ajoutant un seul comprimé tampon à 1 L d’eau distillée. autoclave.</li>
	<li>Préparez la solution de Giemsa en ajoutant 1 ml de solution de coloration de Giemsa à 50 ml de tampon GURR.</li>
	<li>Placez les lames séchées à l’air dans une solution Giemsa pendant 10 min et lavez trois fois dans un PBS 1X. Les lames sèches à l’air à nouveau dans un climat stérile contrôlé pour éviter la contamination.</li>
</ol>2) Microdissection de capture laser d’un seul bras chromosomique polytène
Cette section détaille l’utilisation du logiciel PALMRobo, fourni avec le système de microdissection palm microbeam laser. 
<ol><li>Nettoyez le microscope avec 100% d’éthanol. Stérilisez les gants et les tubes avec une lumière UV dans un réticulant UV.</li>
	<li>Mettez sous tension le microscope à microdissection palm microfumeau laser et allumez le laser. Ouvrez la suite de dissection laser, PALMRobo, et configurez les paramètres « Alimentation » et « Mise au point » si nécessaire.</li>
	<li>Recherchez le bras du chromosome polytène d’intérêt.</li>
	<li>À l’aide de l’outil « Crayon », décrivez la région sélectionnée.</li>
	<li>Ouvrez la « fenêtre Eléments » depuis la barre de menus.</li>
	<li>Sélectionnez l’élément « Dessiné », assurez-vous d’avoir sélectionné « Couper ».</li>
	<li>Installez le tube adhésif dans le support et placez-le au-dessus de la glissière, en laissant un petit espace de <1 mm, et démarrez la découpe laser.</li>
	<li>Placez la « sélection de catapulte » dans le site de coupe, en laissant de l’espace entre le bord et le chromosome.</li>
	<li>Sélectionnez « LPC » dans l’option déroulante et commencez à catapulter.</li>
	<li>Vérifiez que l’échantillon a été catapulté dans le capuchon en appuyant sur l’icône « Œil ».</li>
</ol>3) Purification de l’ADN à partir d’un seul bras chromosomique polytène microdisséqué
Suivez les instructions du QIAamp DNA Micro Kit pour libérer et purifier l’ADN collecté. L’étape 3.1 a été modifiée pour tenir compte du tube inversé. 
<ol><li>Ajouter 15 μl de tampon ATL et 10 μl de protéinase K au tube inversé (à l’intérieur du bouchon) et incuber à 56 °C pendant 3 h.</li>
	<li>Ajouter 25 μl de tampon ATL, 50 μl de tampon AL et 1 μl d’ARN porteur; mélanger. Ajouter 50 μl 100% EtOH; mélanger.</li>
	<li>Transférer le lysat dans la colonne QIAamp; centrifugeuse. Laver en ajoutant 500 μl de tampon AW1; centrifugeuse. Placer la colonne dans le nouveau tube de collecte, ajouter 500 μl de tampon AW2; centrifugeuse. Placez la colonne dans un nouveau tube; centrifugeuse pour éliminer l’excès de liquide.</li>
	<li>Placer la colonne dans un tube de microcentrifugation de 1,5 μl et ajouter 20 μl d’eau pour éluer; centrifugeuse.</li>
	<li>Évaporer l’ADN fraîchement élué jusqu’à un volume final de 9 μl à l’aide d’un vacuumfuge.</li>
</ol>4) Amplification de l’ADN à partir d’un seul bras chromosomique polytène microdissecté
Deux protocoles différents ont été utilisés pour le WGA d’un bras simple de chromosome. 
<ol><li>Amplification de l’ADN et préparation de sonde via GenomePlex WGA<ol>
<li>Suivez le protocole GenomePlex Single Cell WGA4 Kit pour produire le premier lot d’ADN amplifié :<ol>
<li>Ajouter la solution de protéinase K fraîchement préparée à l’échantillon de 9 μl; Mélanger. Incuber l’ADN à 50 °C pendant 1 heure, puis chauffer à 99 °C pendant 4 min. Restez sur la glace.</li>
			<li>Ajouter 2 μl 1X tampon de préparation de bibliothèque unicellulaire et 1 μl de solution de stabilisation de bibliothèque; Mélanger. Échantillon thermique à 95 °C pendant 2 min. Refroidir sur la glace et centrifuger.</li>
			<li>Ajouter 1 μl d’enzyme de préparation de bibliothèque; mélanger et centrifuger. Incuber comme suit : <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq1.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
			<li>Ajouter 7,5 μl 10X Amplification Master Mix, 48,5 μl d’eau. 5,0 μl d’ADN polymérase WGA; mélanger et centrifuger.</li>
			<li>Thermocycler comme suit: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq2.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Purifier l’ADN à l’aide du kit Genomic DNA Clean &Concentrator. Le protocole est le suivant :<ol>
<li>Ajouter 5:1 tampon de liaison à l’ADN: échantillon d’ADN (spécifiquement pour l’ADN génomique de moins de 2 kb. Si l’ADN de l’échantillon est supérieur à 2 kb, utilisez un rapport de 2:1) et transférez-le à la colonne de rotation fournie. centrifugeuse.</li>
			<li>Ajouter 200 μl de tampon de lavage de l’ADN et centrifugeuse. Répétez l’étape de lavage. Ensuite, ajoutez 50 μl d’eau et éluez l’ADN dans un nouveau tube de 1,5 ml.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ré-amplifier l’ADN de l’échantillon à l’aide du kit de réamplification GenomePlex WGA3 comme suit:<ol>
<li>Ajouter 10 μl d’ADN au tube PCR (le kit recommande 10 ng d’ADN total) avec 49,5 μl d’eau, 7,5 μl 10x Amplification Master Mix, 3,0 μl 10 mM de mélange de DNTP et 5,0 μl d’ADN polymérase WGA. Mélanger et centrifuger.</li>
			<li>Utilisez le profil suivant pour la réaction : <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq3.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
			<li>Conserver l’ADN à -20 °C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Étiquetez l’ADN du poisson à l’aide du kit de réamplification GenomePlex WGA3 comme suit:<ol>
<li>Créez un mélange maître à partir du kit de réamplification GenomePlex WGA3 en ajoutant 10 μl d’ADN au tube PCR avec 49,5 μl d’eau, 7,5 μl 10X Amplification Master Mix, 3,0 μl 1 mM de mélange dNTP (1 mM de dATP, dCTP, dGTP, 0,3 μl 1 mM dTTP - si vous utilisez du dUTP étiqueté), 1 μl de 25 nM de dUTP marqué et 5,0 μl d’ADN polymérase WGA.</li>
			<li>Utilisez le profil suivant pour la réaction : <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq3.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
			<li>L’éthanol précipite la sonde étiquetée en ajoutant 1/10 du volume de réaction final (7,5 μl pour une réaction de 75 μl) de l’acétate de sodium 3 M pH 5,2 et 2-3 volumes d’éthanol à 100 %. Refroidir l’échantillon d’ADN à -80 °C pendant au moins 30 min.</li>
			<li>Échantillon de centrifugeuse à 4 °C pendant 10 min pour créer des pastilles étiquetées et éliminer les pastilles surnageantes et sèches à l’air.</li>
			<li>Créez la mémoire tampon d’hybridation comme suit : 0,2 g de sulfate de dextrane Formamide désionisé de 1200 μl 580 μlH2O 120 μl 20X SSC</li>
			<li>Ajouter 40 μl de tampon d’hybridation aux granulés séchés à l’air.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Amplification de l’ADN et préparation de sonde par l’intermédiaire de REPLI-G Single Cell WGA suivie d’une traduction de nick<ol>
<li>Suivez le protocole REPLI-g Single Cell WGA Kit pour produire l’ADN amplifié :<ol>
<li>Préparer le tampon D2 (3 μl de 1 M de TNT + 33 μl de tampon DLB).</li>
			<li>Mélanger 4 μl de matériau microdissecté purifié avec 3 μl de tampon D2. Tube scintillant à mélanger. Incuber pendant 10 min à 65 °C. Ajouter 3 μl de solution Stop; mélanger.</li>
			<li>Ajouter 9 μlH2O,29 μl de tampon de réaction REPLI-g et 2 μl d’ADN polymérase REPLI-g à l’échantillon. Incuber à 30 °C pendant 8 h. Inactiver l’ADN polymérase en chauffant à 65 °C pendant 3 min. Conserver l’ADN à -20 °C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Suivez le protocole de traduction nick pour étiqueter l’ADN amplifié REPLI-g :<ol>
<li>Préparez le mélange d’étiquetage suivant : 1 μg d’ADN amplifié Tampon d’ADN polymérase 5 μl 10X 5 μl 10X dNTP 5 μl 1X BSA 1 μl 1 mM dNTP marqué 4 μl 1 U/μl DNase I 1 μl 10 U/μl ADN polymérase I H2O à 50 μl</li>
			<li>Incuber à 15 °C pendant 2 h. Ajouter 2 μl d’EDTA 0,5 M pour arrêter la réaction. Vérifiez la taille des fragments d’ADN en courant sur gel.</li>
			<li>Suivre les étapes du 4.1.4.3-4.1.4.6 pour précipiter et solubiliser les pastilles.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>5) POISSON 2D sur les préparations de courge de polytène et de chromosome mitotique
Veuillez vous référer aux protocoles détaillés pour FISH sur les préparations de courges polytènes 47 et de lames du chromosome mitotique 48. Ici, nous fournissons de brefs protocoles.
<ol><li>POISSON sur les préparations de courge du chromosome polytène<ol>
<li>Immerger les lames dans du PBS 1X pendant 20 min à RT. Fixer les lames dans du paraformaldéhyde à 4% dans du PBS 1X pendant 1 min.</li>
		<li>Déshydrater les lames à travers des lavages à l’éthanol: 50%, 70%, 90%, 100% pendant 5 min chacun à RT. Lames sèches à l’air.</li>
		<li>Préréguer la sonde dans le tampon d’hybridation à 37 °C. Ajouter 10-20 μl de sonde à faire glisser. Housse avec 22 X 22 mm coverlip. Appuyez sur les bulles d’air à l’aide d’une pointe de pipette.</li>
		<li>Dénaturer les chromosomes et sonder à 90 °C pendant 10 min. Sceller les bords de la lamelle avec du ciment en caoutchouc. Transférer la glissière dans une chambre humide et incuber à 39 °C pendant la nuit.</li>
		<li>Laver les lames avec 1X SSC à 39 °C pendant 20 min. Lavez les lames avec 1X SSC à RT pendant 20 min. Rincez les lames dans un PBS 1X, puis ajoutez Prolonger anti-fondu avec DAPI. Couvrir avec une lame de couverture et conserver dans une boîte à diapositives à 4 °C pendant au moins une heure avant la visualisation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>POISSON sur les préparations de courge du chromosome mitotique<ol>
<li>Extraire les chromosomes mitotiques des disques imaginaux de la larve du4 e stade d’An. gambiae.</li>
		<li>Préparer des lames chromosomiques adaptées aux poissons.</li>
		<li>Ajouter 2-3 μl de sonde à ADN marqué au tampon d’hybridation dans un tube et mélanger doucement par pipetage.</li>
		<li>Appliquer 10 μl du mélange de sondes sur la lame et couvrir avec une lame de 22 X 22 mm. Appuyez sur les bulles d’air à l’aide d’une pointe de pipette.</li>
		<li>Pour la contre-altération et la détection, appliquez Prolonger l’anti-fondu avec DAPI à la préparation et maintenez-la dans l’obscurité pendant au moins une heure avant la visualisation.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6) POISSON 3D sur le tissu ovarien à montage entier
<ol><li>Préparez le mélange A de tampon suivant : 60 mM KCl NaCl 15 mM 0,5 mM spermidine 0,15 mM Spermine EDTA 2 mM EGTA de 0,5 mM TUYAUX DE 15 mM</li>
	<li>Préparez des diapositives pour la visualisation nucléaire en ajoutant une couche de nailpolish dans un motif carré pour correspondre à la taille des lamouches. Cela crée une surface surélevée pour empêcher l’écrasement des noyaux lors de la mise sur la lamelle à l’avenir.</li>
	<li>Disséquer les ovaires frais des femelles de stade 3 de Christopher et les conserver dans une solution de tampon A de 150 à 250 μl avec 0,5 % de digitonine. Exécutez une aiguille de dissection plus grande sur les follicules (dans le tube avec le tampon A avec 0,5% de digitonine) pour détruire la membrane folliculaire.</li>
	<li>Vortex pendant 5-10 min pour perturber davantage les follicules. Grattez toutes les grandes pièces folliculaires et le tube de centrifugation pendant 30 secondes au réglage le plus bas d’environ 500 tours par minute (RPM). Transférer le surnageant dans un nouveau tube Eppendorf de 2 ml et ajouter 100 μl de tampon A. Répétez l’étape 6.3 entre 5 et 7 fois, jusqu’à ce que le tissu visible soit brisé en petites particules.</li>
	<li>Faites tourner les deux tubes pendant 10 min à 2 000 tr/min. Jeter le surnageant dans les deux tubes. Remarque : Les deux tubes seront utilisés pour réaliser les diapositives de visualisation nucléaire finales. Le tube contenant du surnageant recueilli doit contenir principalement des noyaux extraits, tandis que le tube d’origine avec du tissu contiendra un mélange de tissu et de noyaux incorporés dans des cellules nourricières. Ajouter 200 μl de tampon A – 0,1 % de triton et incuber pendant la nuit à 4 °C. Centrifuger 5 min à 10 000 tr/min (10 621 x G) et enlever le surnageant.</li>
	<li>Ajouter 200 μl de paraformaldéhyde à 4 % dans le PBS. Incuber dans un thermomixeur pendant 30 min, en mélangeant à 450 rpm. Centrifuger 5 min à 5 000 tr/min (2 655 x G) et enlever le surnageant. Laver avec le tampon A avec 0,1% de Triton pendant 5 min, en mélangeant à 450 rpm dans un thermomixeur. Centrifuger 5 min à 5 000 tr/min (2 655 G) et retirer le surnageant.</li>
	<li>Ajouter la sonde préchauffée à 37 °C dans le tube. Dénaturer à 95 °C dans un thermomixeur, mélanger à 450 tr/min, pendant 10 min. Poursuivre la daturation à 80 °C pendant 15 min en continuant le mélange. Incuber à 37 °C dans un thermomixeur, avec un mélangeur à 450 tr/min pendant la nuit. Centrifugeuse 5 min à 5 000 tr/min (2 655 x G). Enlever le surnageant.</li>
	<li>Laver avec le tampon A avec 0,1% de Triton pendant 5 min. Centrifugeuse 5 min à 5 000 tr/min (2 655 x G). Répétez 2 fois. Appliquez la goutte de Prolong Anti-fade avec DAPI.</li>
	<li>Pipetez soigneusement les noyaux / solution DAPI (en évitant les bulles), appliquez sur la glissière et couvrez avec une lame de couverture.</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Il existe plusieurs étapes essentielles pour amplifier avec succès l’ADN à partir d’échantillons de chromosomes polytènes microdissectés. Le protocole utilise l’utilisation du LCM, une méthode qui augmente l’efficacité globale et réduit l’exposition à l’ADN étranger en éliminant l’interaction des outils physiques avec l’échantillon. Cependant, l’amplification de l’ADN étranger reste le plus grand écueil potentiel de cette expérience. Ainsi, tout au long du processus, il est essentiel de protéger les échantillons de la contamination. Tout au long des phases de préparation des lames et de microdissection, il est essentiel de laver à l’éthanol les aiguilles de dissection, les lames, les bordereaux de couverture, ainsi que l’espace de travail.  Il est également conseillé de traiter aux UV tout l’équipement applicable (aiguilles, lames, lamaux de couverture) avant utilisation.
La membrane sur les lames de dissection rend la propagation des chromosomes très difficile.  Il est important d’utiliser plus de l’ovaire (la moitié à une paire complète d’ovaires) lors de la fabrication de ces lames, pour fournir une plus grande chance de trouver un noyau bien répandu.  Il est également recommandé d’utiliser des tissus frais lors de la fabrication de lames, car les taux d’amplification semblent baisser à mesure que les tissus vieillissent de 49 ans et que la propagation des chromosomes devient plus difficile.  La préparation des lames pour la microdissection est l’étape la plus longue de ce protocole.  Les chromosomes doivent être bien répartis pour éviter l’acquisition accidentelle de matériel indésirable.  La coloration Giemsa permet à l’utilisateur de vérifier la qualité de propagation avec un microscope à contraste de phase avant d’utiliser le système de microdissection.
La combinaison de la microdissection et de l’amplification offre la possibilité d’extraire et d’analyser des fragments chromosomiques allant de petites régions d’intérêt à une majorité des bras.  Ce protocole permet à l’utilisateur d’obtenir de l’ADN à partir de régions morphologiquement distinctes telles que les inversions, les bandes euchromatiques spécifiques et les bandes interbandes, l’hétérochromatine télomérique, centromère et intercalaire. L’utilisateur peut appliquer les sondes de peinture générées à l’examen des chromosomes aberrants, à l’étude de l’homologie inter-espèces à des loci particuliers ou à la caractérisation de l’organisation spatiale des chromosomes dans un noyau 3D intact. Pour développer des peintures chromosomiques, nous avons sélectionné des segments euchromatiques afin d’éviter l’hybridation de l’ADN répétitif avec de multiples régions chromosomiques. En conséquence, nous avons obtenu une peinture spécifique au bras sans utiliser de concurrent, comme l’ADN génomique total ou la fraction d’ADN C0t-1.
Nous avons choisi d’utiliser les kits GenomePlex WGA et REPLI-G sur la base d’examens qui comparaient l’efficacité et le taux d’abandon de plusieurs kits d’amplification 40,44.  Les deux kits ont obtenu les meilleurs résultats parmi les méthodes disponibles en termes de taux d’abandon (GenomePlex avait un taux de 12,5% par rapport à 37,5% pour REPLI-g). et le pourcentage de marqueurs amplifiés (GenomePlex avait un taux d’amplification de 45,24 % contre 30,0 % pour REPLI-g) 40. Le kit GenomePlex a également fourni une plus grande quantité d’ADN, ce qui en a fait un meilleur candidat pour de multiples techniques en aval.  Un kit de ré-amplification pour le système GenomePlex est également disponible, permettant une amplification supplémentaire de l’ADN. Cependant, il est important de noter que l’amplification n’est pas parfaite.  La possibilité reste qu’une amplification réussie puisse introduire des erreurs ou avoir un biais vers des loci spécifiques dans l’ADN cible. Il est important de tenir compte de la taille finale des fragments des méthodes d’amplification du génome disponibles.  La fragmentation de GenomePlex donne une bibliothèque avec des fragments allant de 200 à 500 pb, tandis que le kit REPLI-g produit des fragments d’une taille d’environ 10 à 20 kb. L’application en aval prévue de ce protocole est FISH, ce qui rend le kit GenomePlex une option plus réalisable, car il a fourni la taille de fragment souhaitée et la capacité d’étiqueter les fragments d’ADN directement via WGA. Les molécules d’ADN longues produites par l’amplification DE REPLI-g doivent être fragmentées dans la réaction de étiquetage de nick-translation en aval.
Ce protocole a été adapté pour amplifier avec succès l’ADN d’un seul bras chromosomique polytène.  D’autres protocoles nécessitent la mise en commun de nombreux fragments chromosomiques (typiquement 10-30) afin d’amplifier avec succès l’échantillon 7,11,28,40.  Bien que la mise en commun de plusieurs chromosomes soit possible à l’aide de notre méthode, la probabilité accrue de contamination de l’échantillon souligne l’importance de commencer l’expérience avec le moins de chromosomes possible. Si les chromosomes polytènes ne sont pas disponibles, notre protocole pourrait être adapté pour une utilisation dans les chromosomes mitotiques. Il peut être nécessaire, cependant, de mettre en commun 10-15 chromosomes mitotiques avant l’amplification pour le poisson réussi 11. Le biais d’amplification est plus faible avec des quantités élevées d’ADN de modèle de départ 50. Les chromosomes polytènes fournissent environ 512 copies d’une seule séquence d’ADN et 1024 copies de deux séquences d’ADN homologues.  Ainsi, la mise en commun des chromosomes mitotiques aidera à augmenter la qualité globale du produit de l’ADN après amplification.
Cette procédure a beaucoup d’utilisations potentielles dans des études cytogénétiques et genomic. Ici, nous avons utilisé des peintures chromosomiques pour établir la correspondance entre les segments euchromatiques de polytène et les bras chromosomiques mitotiques chez An. gambiae. Les mêmes sondes de peinture peuvent être appliquées à la caractérisation cytogénétique des variétés de cellule d’An. gambiae. Les réarrangements génomiques étendus et les changements dans le nombre de chromosomes sont des caractéristiques communes des lignées cellulaires 51,52. L’aneuploïdie, la polyploïdie et les réarrangements chromosomiques tels que les translocations, les inversions, les délétions et les chromosomes de l’anneau ont été détectés dans différentes lignées cellulaires de moustiques 53,54. Les observations cytogénétiques classiques 55 et la cartographie physique 56 ont démontré la survenue de translocations chromosomiques à bras entier dans l’évolution des moustiques du paludisme. Par conséquent, le matériel microdisséqué peut être utilisé en conjonction avec des expériences FISH pour comparer l’homologie des régions chromosomiques entre les espèces. Nous avons avec succès exécuté le poisson 3D avec la sonde de 2R-peinture sur des chromosomes de polytène en cellules ovariennes entières d’infirmière de montage. Cette méthode facilitera le traçage des trajectoires chromosomiques et l’étude de l’architecture nucléaire dans les Anophèles. Des techniques telles que le génotypage de l’ADN 57,58,le séquençage du génome de nouvelle génération 26,27,le développement de cartes physiques et de liaison et la génération de sondes pour la peinture chromosomique 33,59 peuvent toutes bénéficier d’une microdissection spécifique au bras et à la région. En combinant la technologie LCM et en faisant progresser le WGA unicellulaire, nous démontrons une méthode efficace et pratique pour produire des quantités raisonnables d’ADN à partir d’un seul bras chromosomique polytène.

La peinture chromosomique est une technique utile pour étudier l’évolution des caryotypes 1-5 et pour visualiser les anomalies cytogénétiques via l’hybridation de l’ADN chromosomique marqué par fluorescence 1,6-8. Cette méthode est également appliquée à l’étude de la dynamique 3D des territoires chromosomiques dans le développement 9 et la pathologie 10. Les peintures chromosomiques marqués différentiellement sont utilisées pour la visualisation des chromosomes mitotiques 11,12,méiotiques 13,14ou interphase non polytènes 15,16 et polytène 9,11,17. Un protocole simple et robuste pour obtenir des peintures chromosomiques serait très utile pour étendre cette technique aux organismes non modèles, tels que les moustiques. Le complexe Anopheles gambiae est un groupe de sept moustiques morphologiquement indiscernables dont le comportement et l’adaptation varient, y compris la capacité de transmettre le paludisme.  Ces moustiques constituent un excellent modèle pour mieux comprendre l’évolution d’espèces étroitement apparentées qui diffèrent grandement par leur capacité vectorielle.  La plupart des études cytogénétiques chez les moustiques du paludisme ont été réalisées à l’aide de chromosomes bien développés et hautement polyténétiques (examinés en 18,19). Les modèles de bandes lisibles des chromosomes polytènes ont permis aux chercheurs de démontrer l’association entre les inversions polymorphes et les adaptations écologiques chez Anopheles gambiae 20. En outre, 21 tissu-spécifique et 22 caractéristiques espèces-spécifiques de l’organisation 3D de chromosome de polytène ont été caractérisées dans le complexe d’An. macullipennis. Cependant, l’étude des chromosomes mitotiques pourrait fournir des informations importantes supplémentaires. Par exemple, un niveau plus élevé de polymorphisme de l’hétérochromatine observé dans les chromosomes mitotiques a été corrélé avec une activité d’accouplement et une fertilité réduites chez An. gambiae 23. La correspondance entre les segments euchromatiques du polytène et des bras mitotic de chromosome pourrait être difficile à établir seulement en comparant leurs longueurs relatives. En effet, l’hétérochromatine constitue une partie importante des chromosomes mitotiques, mais est sous-représentée dans les chromosomes polytènes 24. La disponibilité de peintures chromosomiques pour les moustiques du paludisme permettrait aux chercheurs d’élargir considérablement les études cytogénétiques en incluant d’autres espèces, tout en réduisant considérablement le coût et le temps dans les analyses de l’évolution caryotypique et de la dynamique 3D des chromosomes de ce groupe d’insectes d’importance épidémiologique.
Afin d’obtenir de grandes étendues de chromosomes, la microdissection est devenue une technique intégrale pour manipuler et isoler des régions spécifiques d’intérêt du complément chromosomique.  Lorsqu’elle est associée à l’amplification du génome entier (WGA), la microdissection donne de puissantes applications enaval,notamment FISH 11,12 et le séquençage du génome de nouvelle génération 25-27. Auparavant, la technique nécessitait l’utilisation d’aiguilles de microdissection spécialisées qui devaient être commandées manuellement par un utilisateur expérimenté 28.  L’avancement de la microdissection de capture laser (LCM) a abouti à un outil simplifié mieux adapté pour isoler les cellules simples 29,30 ou les chromosomes individuels 31-33 avec un risque réduit de contamination. Cette approche permet à l’utilisateur d’étudier les hétérogénéités génétiques et les anomalies chromosomiques qui se produisent dans les cellules individuelles, au lieu d’un paysage de consensus qui résulte de la mise en commun de plusieurs cellules ensemble 34-36. Plusieurs méthodes ont été employées pour amplifier l’ADN produit par la microdissection.  La DOP-PCR, technique utile à l’amplification de séquences hautement répétitives, a été utilisée pour amplifier les chromosomes microdissectés d’espèces dont la sauterelle 37,l’anguille épineuse 38et le tilapia du Nil 39.  Plus récemment, le kit monocellulaire GenomePlex WGA4 basé sur pcr et le kit monocellulaire Repli-G à amplification à déplacement multiple (MDA) sont devenus des outils précieux pour les expériences impliquant l’analyse génétique de cellules humaines uniques ainsi que des chromosomes40-42,y compris les systèmes du chromosome B chez les sauterelles 37 et les criquets 43. Ces deux kits présentent chacun des avantages et des inconvénients, mais leur supériorité apparente par rapport aux autres systèmes d’amplification disponibles a été démontrée 44.
La quantité d’ADN qui peut être obtenue à partir d’un seul chromosome ou d’un segment chromosomique est significativement inférieure à celle d’un noyau entier. Par conséquent, la microdissection, l’amplification et l’analyse ultérieure d’un seul chromosome sont beaucoup plus difficiles, en particulier chez les organismes avec de petits génomes comme chez la drosophile ou l’anophèle.  Bien que des peintures aient été développées à partir de chromosomes microdissectés simples d’un humain 33 et d’une guêpe 45,une expérience fish réussie a nécessité plusieurs (au moins 10-15) chromosomes mitotiques microdissectés d’une mouche des fruits 11. Cependant, la capacité de microdissécter et d’amplifier un seul chromosome serait importante pour (i) réduire le risque de contamination par du matériel provenant d’un chromosome différent, (ii) minimiser le nombre de préparations chromosomiques nécessaires à la microdissection, (iii) réduire le nucléotide et le polymorphisme structurel de l’échantillon microdisséqué dans les applications fish et séquençant en aval. Les chromosomes polytènes trouvés chez de nombreuses espèces de diptères offrent une occasion unique d’acquérir une quantité initiale d’ADN beaucoup plus élevée. Ils fournissent également une résolution et une structure chromosomique plus élevées qui ne peuvent pas être obtenues par l’utilisation de chromosomes mitotiques. Cette résolution supplémentaire peut être critique dans la visualisation des réarrangements chromosomiques, de la structure de la chromatine et des segments chromosomiques à microdissécer 28,46.
Ici, nous présentons une procédure pour isoler efficacement un segment euchromatique d’un seul bras de chromosome polytène, amplifier l’ADN et l’utiliser dans des applications FISH en aval chez les moustiques du paludisme.  Tout d’abord, nous appliquons LCM pour isoler et extraire un seul bras chromosomique à partir de lames membranaires spécialement préparées. Deuxièmement, WGA est utilisé pour amplifier l’ADN du matériau microdisséqué. Troisièmement, nous hybridons l’ADN amplifié dans les expériences FISH aux préparations de courge polytène 47,aux lames chromosomiques métaphases et interphases 48,ainsi qu’aux échantillons de montage ovarien entier 3D. Cette procédure a été faite pour peindre avec succès une majorité de l’euchromatine dans les bras chromosomiques d’An. gambiae.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="562">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">A491-212</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Methanol</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:120px;">A412-4</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Propionic acid&#160;</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">402907</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Membrane slides 1.0 PET</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;">415190-9051-000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Buffer tablets &#8220;GURR&#8221;</td>
			<td style="width:112px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">10582-013</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">KaryoMAX Giemsa Stain</td>
			<td style="width:112px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">10092-013</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">ThermoBrite Slide Denaturation/Hybridization System</td>
			<td style="width:112px;">Abbott Molecular</td>
			<td style="width:120px;">30-144110</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Vacufuge vacuum concentrator</td>
			<td style="width:112px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:120px;">22820001</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">Spectroline Microprocessor-Controlled UV Crosslinker XL-1000</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">11-992-89</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:59px;width:191px;">Thermo Scientific NanoDrop</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">ND-2000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">REPLI-g Single Cell Kit</td>
			<td style="width:112px;">Qiagen</td>
			<td style="width:120px;">150343</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:191px;">GenomePlex Single Cell Kit (WGA4)</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">WGA4-10RXN</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">GenomePlex WGA Reamplification Kit (WGA3)</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">WGA3-50RXN</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:191px;">MZ6 Leica stereomicroscope</td>
			<td style="width:112px;">Leica</td>
			<td style="width:120px;">VA-OM-E194-354</td>
			<td style="width:139px;">A different stereomicroscope can be used</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">Olympus CX41 Phase Microscope</td>
			<td style="width:112px;">Olympus</td>
			<td style="width:120px;">CX41RF-5</td>
			<td style="width:139px;">A different phase microscope can be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">PALM MicroBeam Laser Microdissection Microscope</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Thermomixer</td>
			<td style="width:112px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:120px;">22670000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">10x PBS</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:120px;">P5493</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">50x Denhardt&#8217;s solution</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">D2532</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">99% Formamide</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP227500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Dextran sulfate sodium salt</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td style="width:120px;">D8906</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">20x SSC buffer</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:120px;">AM9765</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">ProLong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:120px;">P-36931</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">dATP, dCTP, dGTP, dTTP</td>
			<td style="width:112px;">Fermentas</td>
			<td style="width:120px;">R0141, R0151, R0161, R0171</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Cy3-dUTP, Cy5-dUTP</td>
			<td style="width:112px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:120px;">PA53022, PA55022</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">BSA</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">A3294</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">DNA polymerase I</td>
			<td style="width:112px;">Fermentas</td>
			<td style="width:120px;">EP0041</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">DNase I&#160;</td>
			<td style="width:112px;">Fermentas</td>
			<td style="width:120px;">EN0521</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Spermine</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">S3256-1G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Spermidine</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">S0266-1G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP366-500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP3581</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">EGTA</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">E0396-25G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">PIPES</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">P6757-25G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">EDTA</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">S311-500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Digitonin</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">D141-100MG</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Triton-X100</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP151-100</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">AdhesiveCap 500 clear</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;">415190-9211-000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">QIAamp DNA Micro Kit (50)</td>
			<td style="width:112px;">Qiagen</td>
			<td style="width:120px;">56304</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Genomic DNA Clean and Concentrator Kit</td>
			<td style="width:112px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:120px;">D4010</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">37% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">F79-500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

2d and 3d chromosome painting in malaria mosquitoes

L’hybridation in situ fluorescente (FISH) des sondes chromosomiques du bras entier est une technique robuste pour cartographier les régions génomiques d’intérêt, détecter les réarrangements chromosomiques et étudier l’organisation tridimensionnelle (3D) des chromosomes dans le noyau cellulaire. L’avènement de la microdissection par capture laser (LCM) et de l’amplification du génome entier (WGA) permet d’obtenir de grandes quantités d’ADN à partir de cellules individuelles. La sensibilité accrue des kits WGA nous a incités à développer des peintures chromosomiques et à les utiliser pour explorer l’organisation et l’évolution des chromosomes dans des organismes non modèles. Ici, nous présentons une méthode simple pour isoler et amplifier les segments euchromatiques des bras chromosomiques polytènes simples des cellules infirmières ovariennes du moustique africain du paludisme Anopheles gambiae. Cette procédure fournit une plate-forme efficace pour obtenir des peintures chromosomiques, tout en réduisant le risque global d’introduction d’ADN étranger dans l’échantillon. L’utilisation de WGA permet plusieurs cycles de ré-amplification, résultant en de grandes quantités d’ADN qui peuvent être utilisées pour de multiples expériences, y compris 2D et 3D FISH. Nous avons démontré que les peintures chromosomiques développées peuvent être utilisées avec succès pour établir la correspondance entre les parties euchromatiques des bras de polytène et de chromosome mitotique dans An. gambiae. Dans l’ensemble, l’union du LCM et du WGA à chromosome unique fournit un outil efficace pour créer des quantités significatives d’ADN cible pour de futures études cytogénétiques et génomiques.

La figure 1 décrit le flux global du protocole décrit dans cet article.  L’utilisateur commence d’abord par microdissécuter des échantillons d’ADN chromosomique à partir de lames membranaires.  Le matériau microdissecté est extrait et purifié. L’ADN purifié est ensuite amplifié, ré-amplifié, marqué, puis utilisé pour fish pour étiqueter les propagations chromosomiques.
Le protocole LCM peut être décomposé en trois étapes globales: 1) Trouver les chromosomes d’intérêt et préparer la région pour la coupe(Figure 2A),2) Couper et catapulter la région chromosomique d’intérêt par laser(Figure 2B), et 3)Vérifier pour déterminer si l’échantillon est réellement catapulté dans le capuchon adhésif(Figure 2C). Le processus de LCM utilisé sur les chromosomes polytènes de la souche An. gambiae Sua est montré dans la vidéo 1. La vidéo détaille l’ensemble du processus depuis le démarrage du programme, y compris les fonctions et les conseils logiciels importants.
Les kits WGA unicellulaires GenomePlex et REPLI-g utilisés dans ce protocole diffèrent grandement par la taille du produit ainsi que par le rendement global.  La figure 3 montre les résultats de l’électrophorèse sur gel effectuée pour les kits GenomePlex et REPLI-g, ainsi que la quantification des échantillons par Nanodrop.
Le matériel microdissecté a été employé pour créer des sondes FISH qui ciblent les régions euchromatiques d’un chromosome.  La figure 4 montre fish de cinq sondes générées à partir de matériaux microdissectés sur des chromosomes polytènes d’An. gambiae.  Quatre bras autosomiques ont été marqués avec trois fluorophores utilisant le kit WGA3 : le chromosome 3R est marqué en vert (fluorescéine), le chromosome 3L est dans un mélange de rouge (Cy-3) et de jaune (Cy-5), le chromosome 2R est en jaune (Cy-5), et le chromosome 2L est en rouge (Cy-3). Le chromosome de X a été marqué en orange (Cy-3) utilisant la nick-traduction du matériel de REPLI-g dans une expérience séparée. Pour établir la correspondance entre les parties euchromatiques des bras chromatiques polytènes et mitotiques, des peintures chromosomiques ont été hybridées aux chromosomes interphase, prophase, prophasée et métaphase d’An. gambiae (Figure 5).  Pour visualiser l’organisation 3D d’un seul bras chromosomique polytène dans le noyau cellulaire, le support fish entier a été réalisé sur des cellules nourricières ovariennes de souche An. gambiae Sua (vidéo 2).  Des territoires distincts du bras chromosomique sont clairement visibles dans les noyaux avec des chromosomes interphasés (Figure 5D) et polytènes (Vidéo 2).
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig1.jpg"> Figure 1. Représentation schématique des procédures expérimentales vers la préparation des peintures chromosomiques. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig2.jpg"> Figure 2. Les principales étapes de la microdissection chromosomique. A) Découpe assistée par laser de la région chromosomique d’intérêt à travers la membrane. B) La membrane avec un trou après la catapulte est effectuée. C) La vue de la pièce catapultée de la membrane avec un segment chromosomique attaché au capuchon adhésif. La flèche indique l’hétérochromatine du chromosome X qui est resté sur la lame. L’astérisque montre un morceau d’un autre chromosome qui est resté sur la lame. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig3.jpg"> Figure 3. Images de gel d’agarose montrant l’ADN après WGA. A) ADN de faible poids moléculaire (200-500 pb) du bras 3R après utilisation des kits WGA4 et WGA3 GenomePlex. B) Adn de poids moléculaire élevé (10-20 kb) du bras 2L après amplification de REPLI-g. L’échelle de 100 pb est indiquée dans les voies de gauche. Les tableaux ci-dessous montrent les concentrations d’ADN mesurées par Nanodrop. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig3highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image.</a>
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig4.jpg"> Figure 4. Peinture des chromosomes de polytène des cellules ovariennes d’infirmière d’An. gambiae utilisant quatre sondes générées à partir du matériel microdissected. Le chromosome X est marqué en orange (Cy-3) par surtraite du matériau REPLI-g. Le bras 2R est étiqueté en jaune (Cy-5); le bras de 2L est en rouge (Cy-3); le bras 3R est étiqueté en vert (fluorescéine); le bras 3L est marqué dans un mélange de rouge (Cy-3) et de jaune (Cy-5). Les autosomes sont étiquetés avec le kit d’amplification WGA3. La chromatine est colorée en bleu (DAPI). Les noms de chromosomes sont placés près des régions télomériques. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig4highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image.</a>
<img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig5.jpg"> Figure 5. Peinture des chromosomes interphase (A), prophase (B), prometaphase (C) et métaphase (D) des disques imaginaux larvaires de la souche d’An. gambiae Mopti utilisant trois sondes générées à partir du matériel microdissected étiqueté par WGA3. Le bras 2R est étiqueté en vert (fluorescéine); le bras de 2L n’est pas étiqueté; le bras 3R est en rose, un mélange de rouge (Cy-3) et d’orange (Cy-5); le bras 3L est étiqueté en orange (Cy-5). Le chromosome X a une étiquette rouge correspondant à la sonde de l’ADNr 18S. La chromatine est colorée en bleu (DAPI). Les régions des chromosomes brillamment colorées correspondent à l’hétérochromatine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig5highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image.</a>
Vidéo 1. Le processus de LCM des chromosomes de polytène d’An. gambiae. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/Sharakhov_video1.mp4" target="_blank">Cliquez ici pour visionner la vidéo 1.</a>
Vidéo 2. Fish 3D de montage entier réalisé sur des cellules nourricières ovariennes d’An. gambiae. La sonde est étiquetée en Cy-3 (représenté en bleu) et a été fabriquée à partir d’un bras chromosomique 2R microdissecté.  La chromatine a été colorée avec du DAPI et est représentée par une pseudo-coloration cyan (bleu clair). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/Video2.avi" target="_blank">Cliquez ici pour visionner la vidéo 2.</a>

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2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

La peinture chromosomique est une méthode utile pour étudier l’organisation du noyau cellulaire et l’évolution du caryotype. Ici, nous démontrons une approche pour isoler et amplifier des régions spécifiques d’intérêt des chromosomes simples de polytène qui sont ensuite utilisés pour l’hybridation in situ fluorescente bidimensionnelle et tridimensionnelle (FISH).

Peinture chromosomique 2D et 3D chez les moustiques du paludisme

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

2d-and-3d-chromosome-painting-in-malaria-mosquitoes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

Un protocole Chelex simple pour l&#39;extraction d&#39;ADN à partir de<em&gt; Anopheles</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Recherche

Immunologie et infection

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes. Investigation of transcripts and gene regulators that are expressed in tissues in which the mosquito host and pathogen interact, and in organs involved in reproduction are of great interest for strategies to reduce mosquito-borne disease transmission and disrupt egg development. A number of tools have been employed to study and validate the temporal and tissue-specific regulation of gene expression. Here, we describe protocols that have been developed to obtain spatial information, which enhances our understanding of where specific genes are expressed and their products accumulate. The protocol described has been used to validate expression and determine accumulation patterns of transcripts in tissues related to mosquito-borne pathogen transmission, such as female salivary glands, as well as subcellular compartments of ovaries and embryos, which relate to mosquito reproduction and development. 
 The following procedures represent an optimized methodology that improves the efficiency of various steps in the protocol without loss of target-specific hybridization signals. Guidelines for RNA probe preparation, dissection of soft tissues and the general procedure for fixation and hybridization are described in Part A, while steps specific for the collection, fixation, pre-hybridization and hybridization of mosquito embryos are detailed in Part B.

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Temporal and spatial gene expression analyses have a crucial role in functional genomics. Whole-mount hybridization in situ is useful for determining the localization of transcripts within tissues and subcellular compartments. Here we outline a hybridization in situ protocol with modifications for specific target tissues in mosquitoes.

Hybridation<em&gt; In situ</em&gt; Des glandes salivaires, des ovaires et des embryons de moustiques vecteurs

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. One important application of this method is the development of high-quality physical maps useful for improving the genome assemblies for various organisms. The natural banding pattern of polytene and mitotic chromosomes provides guidance for the precise ordering and orientation of the genomic supercontigs. Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, a well-established chromosome-based mapping technique has been developed only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes 1. As a result of genome mapping efforts, 88% of the An. gambiae genome has been placed to precise chromosome positions 2,3 . Two other mosquito genera, Aedes and Culex, have poorly polytenized chromosomes because of significant overrepresentation of transposable elements in their genomes 4, 5, 6. Only 31 and 9% of the genomic supercontings have been assigned without order or orientation to chromosomes of Ae. aegypti 7 and Cx. quinquefasciatus 8, respectively. Mitotic chromosome preparation for these two species had previously been limited to brain ganglia and cell lines. However, chromosome slides prepared from the brain ganglia of mosquitoes usually contain low numbers of metaphase plates 9. Also, although a FISH technique has been developed for mitotic chromosomes from a cell line of Ae. aegypti 10, the accumulation of multiple chromosomal rearrangements in cell line chromosomes 11 makes them useless for genome mapping. Here we describe a simple, robust technique for obtaining high-quality mitotic chromosome preparations from imaginal discs (IDs) of 4th instar larvae which can be used for all three genera of mosquitoes. A standard FISH protocol 12 is optimized for using BAC clones of genomic DNA as a probe on mitotic chromosomes of Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus, and for utilizing an intergenic spacer (IGS) region of ribosomal DNA (rDNA) as a probe on An. gambiae chromosomes. In addition to physical mapping, the developed technique can be applied to population cytogenetics and chromosome taxonomy/systematics of mosquitoes and other insect groups.

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, physical genome mapping techniques were established only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes. For the genera of Aedes and Culex, however, cytogenetic mapping remains challenging because of the poor quality of polytene chromosomes. Here we present a universal protocol for obtaining high-quality preparations of mitotic chromosomes and an optimized FISH protocol for all three genera of mosquitoes.

Fluorescent<em&gt; In situ</emHybridation&gt; sur les chromosomes mitotiques de moustiques

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency and type of chromosome aberrations in different cell types allows defects in DNA repair pathways to be elucidated. Understanding mammalian DNA repair biology has been greatly helped by the production of mice with knockouts in specific genes. The goal of this protocol is to quantify genomic instability in mouse B lymphocytes. Labeling of the telomeres using PNA-FISH probes (peptide nucleic acid - fluorescent in situ hybridization) facilitates the rapid analysis of genomic instability in metaphase chromosome spreads. B cells have specific advantages relative to fibroblasts, because they have normal ploidy and a higher mitotic index. Short-term culture of B cells therefore enables precise measurement of genomic instability in a primary cell population which is likely to have fewer secondary genetic mutations than what is typically found in transformed fibroblasts or patient cell lines.

DNA repair pathways are essential for maintenance of genomic integrity and preventing mutation and cancer. The goal of this protocol is to quantify genomic instability by direct observation of chromosome aberrations in metaphase spreads from mouse B cells using fluorescent in situ hybridization (FISH) for telomeric DNA repeats.

Analyse rapide des aberrations chromosomiques dans les lymphocytes B de souris par PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria

Despite decades of eradication efforts, malaria remains a global burden. Recent renewed interest in regional elimination and global eradication has been accompanied by increased genomic information about Plasmodium parasite species responsible for malaria, including characteristics of geographical populations as well as variations associated with reduced susceptibility to anti-malarial drugs.
One common genetic variation, single-nucleotide polymorphisms (SNPs), offers attractive targets for parasite genotyping. These markers are useful not only for tracking drug resistance markers but also for tracking parasite populations using markers not under drug or other selective pressures.
SNP genotyping methods offer the ability to track drug resistance as well as to fingerprint individual parasites for population surveillance, particularly in response to malaria control efforts in regions nearing elimination status.
While informative SNPs have been identified that are agnostic to specific genotyping technologies, high-resolution melting (HRM) analysis is particularly suited to field-based studies. Compared to standard fluorescent-probe based methods that require individual SNPs in a single labeled probe and offer at best 10% sensitivity to detect SNPs in samples that contain multiple genomes (polygenomic), HRM offers 2-5% sensitivity. Modifications to HRM, such as blocked probes and asymmetric primer concentrations as well as optimization of amplification annealing temperatures to bias PCR towards amplification of the minor allele, further increase the sensitivity of HRM. While the sensitivity improvement depends on the specific assay, we have increased detection sensitivities to less than 1% of the minor allele.
In regions approaching malaria eradication, early detection of emerging or imported drug resistance is essential for prompt response. Similarly, the ability to detect polygenomic infections and differentiate imported parasite types from cryptic local reservoirs can inform control programs.
This manuscript describes modifications to high resolution melting technology that further increase its sensitivity to identify polygenomic infections in patient samples.

While high resolution melting analysis offers the ability to differentiate between single nucleotide polymorphisms in a heterogeneous population, mutant allele amplification bias can increase its ability to detect alleles present at relatively low percentages within a sample. This protocol describes improvements that improve the sensitivity of high resolution melting analysis.

Méthodes pour augmenter la sensibilité de la haute résolution de fusion Single Nucleotide Polymorphism génotypage dans le paludisme

Despite decades of eradication efforts, malaria remains a global burden. Recent renewed interest in regional elimination and global eradication has been ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modèle de mesure de réponses immunitaires contre le paludisme dans le contexte du VIH co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible for most malaria-related deaths globally. Several factors including parasite sequestration in tissues, vascular dysfunction, and inflammatory responses influence the evolution of the disease in malaria-infected people. P. falciparum-infected red blood cells (iRBCs) release small extracellular vesicles (EVs) containing different kinds of cargo molecules that mediate pathogenesis and cellular communication between parasites and host. EVs are efficiently taken up by cells in which they modulate their function. Here we discuss strategies to address the role of EVs in parasite-host interactions. First, we describe a straightforward method for labeling and tracking EV internalization by endothelial cells, using a green cell linker dye. Second, we report a simple way to measure permeability across an endothelial cell monolayer by using a fluorescently labeled dextran. Finally, we show how to investigate the role of small non-coding RNA molecules in endothelial cell function.

In this work, we describe protocols to investigate the role of extracellular vesicles (EVs) released by Plasmodium falciparum infected erythrocytes. In particular, we focus on the interactions of EVs with endothelial cells.

Évaluation de la fonction vésiculaire extracellulaire au cours de l’Infection palustre

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines and/or antivirals have underscored the urgent need to develop ZIKV reverse genetic systems to facilitate the study of ZIKV biology and the development of therapeutic and/or prophylactic approaches. However, like with other flaviviruses, the generation of ZIKV full-length infectious cDNA clones has been hampered due to the toxicity of viral sequences during its amplification in bacteria. To overcome this problem, we have developed a nontraditional approach based on the use of bacterial artificial chromosomes (BACs). Using this approach, the full-length cDNA copy of the ZIKV strain Rio Grande do Norte Natal (ZIKV-RGN) is generated from four synthetic DNA fragments and assembled into the single-copy pBeloBAC11 plasmid under the control of the human cytomegalovirus (CMV) immediate-early promoter. The assembled BAC cDNA clone is stable during propagation in bacteria, and infectious recombinant (r)ZIKV is recovered in Vero cells after transfection of the BAC cDNA clone. The protocol described here provides a powerful technique for the generation of infectious clones of flaviviruses, including ZIKV, and other positive-strand RNA viruses, particularly those with large genomes that have stability problems during bacterial&#160;propagation.

The recent epidemic of Zika virus highlights the importance of establishing reverse genetic approaches to develop vaccines and/or therapeutic strategies. Here, we describe the protocol to rescue an infectious recombinant Zika virus from a full-length cDNA clone assembled in a bacterial artificial chromosome under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter.

Sauvetage du virus Zika recombinant d'un clone d'ADNc chromosomique artificiel bactérien

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

Analyses de compétence vectorielle sur les moustiques Aedes aegypti utilisant le virus Zika

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of disease cases each year. E. aedis causes mortality and reduced reproductive fitness in the mosquito vector and has been explored for its potential as a biocontrol agent. The protocol we present for culturing E. aedis is based on its natural infection cycle, which involves both horizontal and vertical transmission at different life stages of the mosquito host. Ae. aegypti mosquitoes are exposed to spores in the larval stage. These infected larvae then mature into adults and transmit the parasite vertically to their offspring. Infected offspring are then used as a source of spores for future horizontal transmission. Culturing E. aedis can be challenging to the uninitiated given the complexities of the parasite&#8217;s life cycle, and this protocol provides detailed guidance and visual aids for clarification.

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

A protocol to culture the microsporidian parasite Edhazardia aedis. The parasite is passaged from one generation of Aedes aegypti mosquitoes to the next via horizontal transfer at the larval stage followed by vertical transmission at the adult stage. Live sporoplasms survive long-term in infected eggs.

Propagation du parasite microsporidien Edhazardia aedis chez les moustiques Aedes aegypti

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of ...