Name: 2d and 3d chromosome painting in malaria mosquitoes
Uploaded: 2014-01-06T17:30:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about 2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי המענק של המכונים הלאומיים לבריאות 1R21AI094289 לאיגור נ' שרקוב

1) הכנת מגלשת כרומוזום פוליטן ללכידת לייזר מיקרו-דיסקציה
<ol><li>לנתח נקבות Anopheles חצי gravid ב 25 שעות לאחר האכלת הדם. לתקן שחלות מכחמש נקבות לתוך 500 μl של פתרון קרנוי שונה טרי (100% מתנול: חומצה אצטית קרחונית, 3:1) בטמפרטורת החדר במשך 24 שעות. העבר שחלות ל-20 °C (69 °F) לאחסון לטווח ארוך.</li>
	<li>הכינו את הפתרון של Carnoy (100% אתנול: חומצה אצטית קרחונית, 3:1) וחומצה פרופיונית 50% ממש לפני הכנת שקופיות כרומוזום.</li>
	<li>מניחים זוג אחד של שחלות בטיפה אחת של הפתרון של קרנוי על שקופית קרום Zeiss 1.0 PET. בהתאם לגודל, לפצל את השחלות לתוך כ 2-4 חלקים עם מחטים לנתח ומניחים אותם לתוך טיפה של 50% חומצה propionic על שקופיות נקיות תחת מיקרוסקופ ניתוח.</li>
	<li>יש להפריד זקיקים ולהסיר את הרקמה הנותרת באמצעות מגבת נייר תחת סטריאומיקרוסקופ ניתוק. מוסיפים טיפה חדשה של 50% חומצה פרופיונית לזקיקים ומאפשרים להם לשבת במשך 3-5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>מניחים כיסוי סיליקון על גבי הטיפה. תן לשקופית לעמוד כדקה.</li>
	<li>מכסים את השקופית בחומר סופג (נייר סינון משמש לשיטה זו), ותוך שימוש בצד המחק של עיפרון, יש להפעיל כמות נדיבה של לחץ על העטיפה על ידי הקשה עליה שוב ושוב עם המחק.</li>
	<li>מחממים את השקופית ל 60 °C (60 °F) על מערכת denaturation / הכלאה שקופית במשך 15-20 דקות כדי לסייע בשיטוח כרומוזומי פוליטן. מניחים שקופיות לתוך תא לח ב 4 מעלות צלזיוס לילה כדי לאפשר לחומצה עוד יותר לשטח כרומוזומים.</li>
	<li>מניחים שקופיות קר 50% אתנול במשך 10 דקות. מוציאים בעדינות את הכיסוי, ומחליפים בקור 50% אתנול למשך 10 דקות נוספות.</li>
	<li>לייבש שקופיות ב 70%, 90%, 100% אתנול במשך 5 דקות כל אחד. מגלשות יבשות באוויר.</li>
	<li>הכן פתרון של פתרון מאגר GURR על-ידי הוספת טבליית חיץ אחת ל- 1 L של מים מזוקקים. מובלעת אוטומטית.</li>
	<li>הכינו את פתרון Giemsa על ידי הוספת 1 מ"ל של פתרון כתמי Giemsa ל 50 מ"ל של מאגר GURR.</li>
	<li>מניחים מגלשות מיובשות באוויר בתמיסת Giemsa למשך 10 דקות ושוטפים שלוש פעמים ב- PBS 1X. אוויר יבש מחליק שוב באקלים סטרילי מבוקר כדי למנוע זיהום.</li>
</ol>2) לייזר ללכוד מיקרו-דיסקציה של זרוע כרומוזום פוליטן יחיד
סעיף זה מפרט את השימוש בתוכנת PALMRobo, אשר מגיע עם מערכת מיקרודיסציה לייזר PALM MicroBeam. 
<ol><li>נקה את המיקרוסקופ עם 100% אתנול. לעקר כפפות וצינורות עם אור UV ב- UV-crosslinker.</li>
	<li>הפעל את מיקרוסקופ המיקרו-דיסקציה של PALM MicroBeam Laser בלייזר והפעל את הלייזר. פתח את חבילת ניתוח הלייזר PALMRobo וקבע את התצורה של הגדרות "צריכת חשמל" ו"מיקוד" לפי הצורך.</li>
	<li>חפש זרוע כרומוזום פוליטן של עניין.</li>
	<li>בעזרת הכלי עיפרון, חלוקה לרמות של האזור הנבחר.</li>
	<li>פתח את "חלון האלמנטים" מתוך שורת התפריטים.</li>
	<li>בחר את "הרכיב המצויר", ודא שבחרת באפשרות "גזור".</li>
	<li>התקן את צינור כובע דבק לתוך המחזיק ומניחים מעל המגלשה, משאיר רווח קטן <1 מ"מ בגודל, ולהתחיל לחתוך את הלייזר.</li>
	<li>הנח את "בחירת מעוט" בתוך האתר לחתוך, משאיר רווח בין הקצה הכרומוזום.</li>
	<li>בחר "LPC" מהאפשרות הנפתחת והתחל בליסטראות.</li>
	<li>בדוק כדי לוודא שהדגימה הוכנסה למכסה על-ידי לחיצה על סמל "עין".</li>
</ol>3) טיהור הדנ"א מזרוע כרומוזום פוליטנית מיקרו-דיסקית אחת
בצע את ההוראות של ערכת מיקרו DNA QIAamp לשחרר ולטהר את ה-DNA שנאסף. שלב 3.1 שונה כדי להתאים לצינור ההפוך. 
<ol><li>הוסף 15 μl מאגר ATL ו 10 μl proteinase K לצינור הפוך (בתוך הכובע) ואת הדגירה ב 56 °C (69 °F) במשך 3 שעות.</li>
	<li>הוסף 25 μl מאגר ATL, 50 μl מאגר AL, ו RNA נשא 1 μl; תערובת. להוסיף 50 μl 100% EtOH; לערבב.</li>
	<li>העבר lysate לעמודה QIAamp; צנטריפוגה, צנטריפוגה. לשטוף על ידי הוספת 500 μl מאגר AW1; צנטריפוגה, צנטריפוגה. מקם עמודה לתוך צינור אוסף חדש, להוסיף 500 μl מאגר AW2; צנטריפוגה, צנטריפוגה. מניחים את העמודה לתוך צינור חדש; צנטריפוגה להסרת נוזלים עודפים.</li>
	<li>מניחים את העמודה לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 μl ומוסיפים 20 μl של מים כדי elute; צנטריפוגה, צנטריפוגה.</li>
	<li>לאדות DNA מרומם טרי עד נפח סופי של 9 μl באמצעות ואקום.</li>
</ol>4) הגברה של דנ"א מזרוע כרומוזום פוליטנית מיקרו-דיסקית אחת
שני פרוטוקולים שונים שימשו עבור WGA של זרוע כרומוזום אחת. 
<ol><li>הגברה של דנ"א והכנת בדיקה באמצעות גנוםפלקס WGA<ol>
<li>בצע את פרוטוקול ערכת WGA4 תא יחיד GenomePlex כדי לייצר את האצווה הראשונה של DNA מוגבר:<ol>
<li>הוסף פתרון חלבון K שהוכן טרי לדגימה של 9 μl; לערבב. דגירה DNA ב 50 מעלות צלזיוס במשך 1 שעה, ולאחר מכן לחמם ל 99 מעלות צלזיוס במשך 4 דקות. שמור על קרח.</li>
			<li>הוסף 2 μl 1X מאגר הכנה לספריית תא יחיד ו 1 מיקרומטר של פתרון ייצוב ספריה; מערבבים. מחממים דגימה ל-95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. מצננים על קרח וצנטריפוגה.</li>
			<li>הוסף 1 μl של אנזים הכנת ספרייה; לערבב וצנטריפוגה. דגירה כדלקמן: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq1.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
			<li>הוסף 7.5 μl 10X הגברה מאסטר לערבב, 48.5 μl מים. 5.0 μl WGA DNA פולימראז; לערבב וצנטריפוגה.</li>
			<li>תרמוציקל כדלקמן: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq2.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
		</ol>
</li>
		<li>לטהר DNA באמצעות DNA גנומי נקי &amp Concentrator קיט. הפרוטוקול הוא כדלקמן:<ol>
<li>הוסף 5:1 מאגר מחייב DNA:דגימת DNA (במיוחד עבור DNA גנומי של פחות מ 2 kb. אם הדנ"א לדוגמה גדול מ- 2 kb, השתמש ביחס של 2:1) והעבר לעמודת הסיבוב שסופקה. צנטריפוגה, צנטריפוגה.</li>
			<li>מוסיפים 200 מיקרוגרם DNA לשטוף מאגר צנטריפוגה. חזור על שלב הכביסה. לאחר מכן, מוסיפים 50 μl של מים ו elute ה-DNA לתוך צינור חדש 1.5 מ"ל.</li>
		</ol>
</li>
		<li>הגבר מחדש את הדנ"א לדוגמה באמצעות ערכת ההטמימות GenomePlex WGA3 באופן הבא:<ol>
<li>הוסף 10 μl DNA לצינור PCR (הערכה ממליצה 10 ng הכולל של DNA) עם 49.5 μl מים, 7.5 μl 10x הגברה מאסטר לערבב, 3.0 μl 10 מ"מ DNTP לערבב, ו 5.0 μl WGA DNA פולימראז. מערבבים וצנטריפוגה.</li>
			<li>השתמש בפרופיל הבא לתגובה: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq3.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
			<li>אחסן דנ"א ב-20°C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>סמן דנ"א עבור FISH באמצעות ערכת ההטמנה מחדש של GenomePlex WGA3 כדלקמן:<ol>
<li>צור תערובת הורים מערכת תב"ע של GenomePlex WGA3 על-ידי הוספת דנ"א של 10 מיקרומטר לצינור PCR עם מים של 49.5 מיקרול, 7.5 μl 10X הגברה מאסטר לערבב, 3.0 μl 1 מ"מ dNTP לערבב (1 מ"ל של dATP, dCTP, dGTP, 0.3 μl 1 mM dTTP - אם באמצעות dUTP שכותרתו), 1 מיקרומטר של 25 nM שכותרתו dUTPP ו-5.0 מיקרוגרם פולימראז דנ"א WGA.</li>
			<li>השתמש בפרופיל הבא לתגובה: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq3.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
			<li>אתנול לזרז את הבדיקה שכותרתו על ידי הוספת 1/10 נפח התגובה הסופי (7.5 μl עבור 75 μl תגובה) של 3 M נתרן אצט pH 5.2 ו 2-3 כמויות של 100% אתנול. דגימת דנ"א צוננת ב-80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות.</li>
			<li>מדגם צנטריפוגה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי ליצור גלולה שכותרתו ולהסיר גלולה supernatant ואוויר יבש.</li>
			<li>צור מאגר הכלאה באופן הבא: 0.2 גר' דקסטרן סולפט 1200 μl פורממיד דהוי 580 μl H2O 120 μl 20X SSC</li>
			<li>הוסף 40 μl של חיץ הכלאה לכדור מיובש באוויר.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>הגברה DNA והכנת בדיקה באמצעות REPLI-G תא יחיד WGA ואחריו ניק-תרגום<ol>
<li>פעל לפי פרוטוקול ערכת WGA של תא יחיד של REPLI-g כדי להפיק את ה- DNA המוגבר:<ol>
<li>הכן מאגר D2 (3 מיקרומטר של 1 M DTT + 33 μl מאגר DLB).</li>
			<li>יש לערבב 4 מיקרו-μl של חומר מטוהר עם 3 מיקרול Buffer D2. צינור פליק לערבב. דגירה במשך 10 דקות ב 65 מעלות צלזיוס. הוסף 3 μl של פתרון עצירה; לערבב.</li>
			<li>הוסף 9 μl H2O, 29 μl REPLI-g מאגר תגובה, ו 2 μl של פולימראז DNA REPLI-g לדגימה. דגירה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 8 שעות. להשבית פולימראז DNA על ידי חימום ל 65 °C (65 °F) במשך 3 דקות. אחסן דנ"א ב-20°C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>פעל בהתאם לפרוטוקול התרגום של nick כדי לתייג את ה- DNA המוגבר של REPLI-g:<ol>
<li>הכן את תערובת התיוג הבאה: 1 מיקרוגרם של DNA מוגבר מאגר פולימראז DNA 5 μl 10X 5 μl 10X dNTP 5 מיקרול 1X BSA 1 μl 1 מ"מ עם תווית dNTP 4 μl 1 U / μl DNase I 1 μl 10 U / μl DNA פולימראז אני H2O עד 50 μl</li>
			<li>דגירה ב 15 מעלות צלזיוס במשך 2 שעות. הוסף 2 μl של 0.5 M EDTA כדי לעצור את התגובה. בדוק את גודל שבר הדנ"א על ידי ריצה על ג'ל.</li>
			<li>בצע את השלבים מ 4.1.4.3-4.1.4.6 כדי לזרז ולזלול גלולה.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>5) דגים דו-מימדיים על תכשירי דלעת פוליטנית וכרומוזום מיטוטי
אנא עיינו בפרוטוקולים מפורטים עבור FISH על הכנות של דלעת פוליטן 47 ומגלשות כרומוזום מיטוטי 48. כאן אנו מספקים פרוטוקולים קצרים.
<ol><li>דגים על תכשירי דלעת כרומוזום פוליטן<ol>
<li>לטבול שקופיות 1X PBS במשך 20 דקות ב RT. לתקן שקופיות ב 4% Paraformaldehyde ב 1X PBS במשך דקה אחת.</li>
		<li>התייבש שקופיות דרך שטיפות אתנול: 50%, 70%, 90%, 100% במשך 5 דקות כל אחד ב RT. שקופיות יבשות אוויר.</li>
		<li>מחממים את החללית במאגר הכלאה ב 37 °C (69 °F). הוסף 10-20 μl של בדיקה להחליק. מכסים בכיסויים של 22 X 22 מ"מ. לחץ החוצה כל בועות אוויר באמצעות קצה פיפטה.</li>
		<li>כרומוזומי דנאטורה ובדיקה ב 90 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. חותם קצוות של כיסוי עם מלט גומי. מעבירים את השקופית לתא לח ומדגדגים ב-39 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
		<li>לשטוף את השקופיות עם 1X SSC ב 39 °C (69 °F) במשך 20 דקות. לשטוף את השקופיות עם 1X SSC ב RT במשך 20 דקות. שטפו שקופיות ב- 1X PBS ולאחר מכן הוסיפו את האפשרות 'התארך נגד עמעום' באמצעות DAPI. מכסים עם כיסוי, ומאחסנים בתיבת שקופיות ב- 4 °C (60 °F) למשך שעה לפחות לפני הפריט החזותי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>FISH על הכנות דלעת כרומוזום מיטוטי<ol>
<li>לחלץ כרומוזומים מיטוטיים מדיסקים דמיוניים של זחל 4כוכבים של An. gambiae.</li>
		<li>הכינו מגלשות כרומוזום המתאימות ל-FISH.</li>
		<li>הוסף 2-3 μl של בדיקה DNA שכותרתו למאגר הכלאה בצינור ומערבבים בעדינות על ידי pipetting.</li>
		<li>החל 10 μl של תערובת בדיקה על השקופית לכסות עם כיסוי 22 X 22 מ"מ. לחץ החוצה כל בועות אוויר באמצעות קצה פיפטה.</li>
		<li>לשיוך וזיהוי נגדיים, יש למרוח את האנטי-עמעום עם DAPI על ההכנה ולשמור בחושך לפחות שעה לפני הפריט החזותי.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6) דגים תלת מימדיים על רקמת שחלות הר שלם
<ol><li>הכן את השילוב הבא של מאגר A: 60 מ"מ KCl 15 מ"מ NaCl 0.5 מ"מ זרע 0.15 מ"מ זרע 2 מ"מ אדטה 0.5 מ"מ אגטה 15 מ"מ צינורות</li>
	<li>הכן שקופיות להדמיה גרעינית על-ידי הוספת שכבה של nailpolish בתבנית מרובעת כדי להתאים לגודל של המכבסות. זה יוצר משטח מוגבה כדי למנוע מעוך של גרעינים בעת הנחת על כריכה בעתיד.</li>
	<li>לנתח שחלות טריות מן השלב של כריסטופר 3 נקבות ולשמור על פתרון של 150-250 μl Buffer A עם 0.5% דיגיטונין. הפעל מחט ניתוח גדולה יותר על זקיקים (בצינור עם חוצץ A עם 0.5% דיגיטונין) כדי להרוס קרום זקיקי.</li>
	<li>וורטקס במשך 5-10 דקות כדי להפריע עוד יותר זקיקים. לגרד את כל חתיכות זקיק גדול צינור צנטריפוגה במשך 30 שניות בהגדרה הנמוכה ביותר של ~ 500 מהפכות לדקה (סל"ד). להעביר supernatant לצינור חדש 2 מיליליטר Eppendorf, ולהוסיף 100 μl של חוצץ A. חזור על שלב 6.3 בין 5-7 פעמים, עד הרקמה הגלויה מחולק חלקיקים קטנים.</li>
	<li>לסובב את שני הצינורות במשך 10 דקות ב 2,000 סל"ד. השלך על טבעי בשני הצינורות. הערה: שני הצינורות ישמשו להכנת שקופיות הדמיה גרעינית סופית. הצינור עם supernatant שנאסף צריך להכיל בעיקר גרעינים שחולצו, בעוד הצינור המקורי עם רקמה יכיל תערובת של רקמה וגרעינים מוטבע בתאי האחות. הוסף 200 μl של חוצץ A – 0.1% טריטון דגירה לילה ב 4 °C (69 °F). צנטריפוגה 5 דקות ב 10,000 סל"ד (10,621 x G) ולהסיר supernatant.</li>
	<li>הוסף 200 μl 4% Paraformaldehyde ב- PBS. דגירה בתרמומקסר במשך 30 דקות, ערבוב ב 450 סל"ד. צנטריפוגה 5 דקות ב 5,000 סל"ד (2,655 x G) ולהסיר supernatant. לשטוף עם חוצץ A עם 0.1% טריטון במשך 5 דקות, ערבוב ב 450 סל"ד תרמומיקסר. צנטריפוגה 5 דקות ב 5,000 סל"ד (2,655 G) ולהסיר supernatant.</li>
	<li>הוסף מראש מחומם ב 37 מעלות צלזיוס שכותרתו בדיקה לצינור. דנאטורה ב 95 °C (60 °F) בתרמומיקסר, ערבוב ב 450 סל"ד, במשך 10 דקות. המשך denaturation ב 80 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות עם ערבוב מתמשך. דגירה ב 37 °C (69 °F) ב thermomixer, עם 450 סל"ד ערבוב לילה. צנטריפוגה 5 דקות ב 5,000 סל"ד (2,655 x G). הסר על-טבעי.</li>
	<li>לשטוף עם חוצץ A עם 0.1% טריטון במשך 5 דקות. צנטריפוגה 5 דקות ב 5,000 סל"ד (2,655 x G). חזור על הפעולה פעמיים. החל טיפה של התארכות נגד עמעום באמצעות DAPI.</li>
	<li>צנרת החוצה גרעיני / DAPI פתרון בזהירות (הימנעות בועות), להחיל על שקופית, לכסות עם coverlip.</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

ישנם שלבים רבים קריטיים כדי להגביר בהצלחה את ה-DNA מדגימות כרומוזום פוליטן microdissected. הפרוטוקול משתמש בשימוש ב- LCM, שיטה הן מגבירה את היעילות הכוללת ומפחיתה את החשיפה לדנ"א זר על ידי הסרת האינטראקציה של כלים פיזיים עם הדגימה. עם זאת, הגברה של דנ"א זר היא עדיין המלכודת הפוטנציאלית הגדולה ביותר של ניסוי זה. לכן, במהלך כל התהליך, זה חיוני כדי לשמור על הדגימות מוגנות מפני זיהום. לאורך כל הכנת שקופית ושלבי microdissection, זה חיוני כדי לשטוף אתנול מחטי דיסקציה, שקופיות, לכסות מעידות, כמו גם את סביבת העבודה.  מומלץ גם UV לטפל בכל הציוד הישים (מחטים, שקופיות, coverslips) לפני השימוש.
הממברנה על שקופיות הניתוח מקשה מאוד על התפשטות הכרומוזומים.  חשוב להשתמש יותר של השחלה (חצי לזוג מלא של שחלות) בעת ביצוע שקופיות אלה, כדי לספק סיכוי גדול יותר למצוא גרעין התפשטות היטב.  מומלץ גם להשתמש ברקמה טרייה בעת ביצוע שקופיות, כמו שיעורי הגברה נראה לרדת כמו רקמות גיל 49 והתפשטות כרומוזום הופך להיות מאתגר יותר.  הכנת שקופיות עבור microdissection הוא הצעד זמן רב ביותר בפרוטוקול זה.  כרומוזומים חייבים להתפשט היטב כדי למנוע רכישה בשוגג של חומר לא רצוי.  כתמי Giemsa מאפשרים למשתמש לבדוק את איכות ההתפשטות באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה לפני השימוש במערכת המיקרו-דיסקציה.
השילוב של מיקרו-דיסקציה והגברה מספק את ההזדמנות לחלץ ולנתח שברים כרומוזומליים בגודלם מאזורים קטנים בעלי עניין לרוב הזרועות.  פרוטוקול זה מאפשר למשתמש להשיג דנ"א מאזורים שונים מבחינה מורפולוגית כגון היפוכים, רצועות אוכרומטיות ספציפיות וסרטים בין-דוריים, הטרוכרומטין טלומרי, סנטימטרי ובין-כוכבי. המשתמש יכול ליישם את בדיקות הציור שנוצרו כדי לבחון כרומוזומים חריגים, לחקור הומולוגיה בין מינים בלוקוסים מסוימים, או לאפיין ארגון מרחבי של כרומוזומים בגרעין תלת מימד שלם. לפיתוח צבעי כרומוזום, בחרנו מקטעים אוכרומטיים כדי למנוע הכלאה של דנ"א חוזר עם אזורים כרומוזומליים מרובים. כתוצאה מכך, השגנו ציור ספציפי לזרוע מבלי להשתמש במתחרה, כמו דנ"א גנומי כולל או שבר DNA C0t-1.
בחרנו להשתמש בערכות GenomePlex WGA ו- REPLI-G בהתבסס על ביקורות שהשוו את יעילות ושיעור הנשירה של ערכות הגברה מרובות 40,44.  שתי הערכות ביצעו את הטוב ביותר מבין השיטות הזמינות בשני שיעור הנושרים (GenomePlex היה שיעור של 12.5% לעומת 37.5% של REPLI-g%) ואחוז הסמנים המוגברים (ל-GenomePlex היה שיעור הגברה של 45.24% לעומת 30.0% של REPLI-g). 40. ערכת GenomePlex סיפקה גם כמות גבוהה יותר של DNA, ובכך הפכה אותה למועמדת טובה יותר לטכניקות מרובות במורד הזרם.  ערכת הגברה מחדש למערכת GenomePlex זמינה גם היא, ומאפשרת הגברה נוספת של הדנ"א. עם זאת, חשוב לציין כי הגברה אינה מושלמת.  האפשרות נשארת כי הגברה מוצלחת יכולה להציג שגיאות או יש הטיה כלפי loci ספציפי ב- DNA היעד. חשוב לקחת בחשבון את גודל הקטע הסופי של שיטות הגברה הגנום הזמינות.  פיצול GenomePlex גורם לספריה עם שברים הנעים בין 200-500 bp, בעוד שערכת REPLI-g מייצרת שברים בגודל של כ- 10-20 kb. היישום המיועד במורד הזרם של פרוטוקול זה הוא FISH, ובכך להפוך את ערכת GenomePlex אפשרות אפשרית יותר, כפי שהוא סיפק את גודל הקטע הרצוי ואת היכולת לתייג שברי DNA ישירות דרך WGA. מולקולות דנ"א ארוכות המיוצרות על ידי הגברה REPLI-g חייב להיות מקוטע בתגובת תיוג ניק-תרגום במורד הזרם.
פרוטוקול זה הותאם כדי להגביר בהצלחה את הדנ"א מזרוע כרומוזום פוליטן אחת.  פרוטוקולים אחרים דורשים איגום של שברי כרומוזום רבים (בדרך כלל 10-30) כדי להגביר בהצלחה את המדגם 7,11,28,40.  למרות איגום של כרומוזומים מרובים אפשרי בשיטה שלנו, הסבירות המוגברת של זיהום מדגם מדגיש את החשיבות של תחילת הניסוי עם כמה שפחות כרומוזומים. אם כרומוזומי פוליטן אינם זמינים, הפרוטוקול שלנו יכול להיות מותאם לשימוש בכרומוזומים מיטוטיים. עם זאת, ייתכן שיהיה צורך בריכה 10-15 כרומוזומים מיטוטיים לפני הגברה עבור דגים מוצלחים 11. הטיית הגברה נמוכה יותר עם כמויות גבוהות של DNA תבנית התחלתית 50. כרומוזומי פוליטן מספקים כ-512 עותקים של רצף דנ"א יחיד ו-1024 עותקים של שני רצפי דנ"א הומולוגיים.  לכן, איגום כרומוזומים מיטוטיים יעזור להגדיל את האיכות הכוללת של מוצר DNA לאחר הגברה.
הליך זה יש שימושים פוטנציאליים רבים במחקרים ציטוגנטיים וגנומיים. כאן, השתמשנו בצבעי כרומוזום כדי לבסס את ההתאמה בין קטעים אוכרומטיים של זרועות פוליטן וכרומוזום מיטוטי ב An. gambiae. ניתן להחיל את אותן בדיקות ציור על אפיון ציטוגנטי של קווי התא של א. גמביה. סידורים גנומיים נרחבים ושינויים במספרי הכרומוזום הם מאפיינים נפוצים של קווי תאים 51,52. סידורים מחדש של כלנית, פוליפלוידיה וכרומוזומליים כגון טרנסלוקציות, היפוכים, מחיקות וכרומוזומי טבעת זוהו בשורות שונות של תאי יתושים 53,54. תצפיות ציטוגנטיות קלאסיות 55 ומיפוי פיזי 56 הדגימו את התרחשותן של טרנסלוקציות כרומוזומליות בזרוע כולה באבולוציה של יתושים מלריה. לכן, חומר microdissected יכול לשמש בשילוב עם ניסויים FISH להשוות הומולוגיה של אזורים כרומוזומליים בין מינים. ביצענו בהצלחה דגים תלת מימדיים עם הגשושית 2R-painting על כרומוזומי פוליטן בתאי אחות בשחלות הר שלם. שיטה זו תקל על המעקב אחר מסלולי כרומוזום וללמוד את הארכיטקטורה הגרעינית ב Anopheles. טכניקות כמו genotyping DNA 57,58, הדור הבא של רצף הגנום 26,27, פיתוח מפת פיזית וחיבור, ודור של בדיקות לציור כרומוזום 33,59 כל יכול להפיק תועלת זרוע באזור ספציפי microdissection. על ידי שילוב טכנולוגיית LCM וקידום WGA חד-תאי, אנו מדגימים שיטה יעילה ומעשית לייצור כמויות סבירות של דנ"א מזרוע כרומוזום פוליטנית אחת.

ציור כרומוזום היא טכניקה שימושית לחקר האבולוציה של קריוטיפים 1-5 ולהמחיש מומים ציטוגנטיים באמצעות הכלאה של DNA כרומוזומלי שכותרתו פלואורסצנטית 1,6-8. שיטה זו מיושמת גם על לימוד הדינמיקה התלת מימדית של שטחי כרומוזום בפיתוח 9 ופתולוגיה 10. צבעי כרומוזום המסומנים באופן דיפרנציאלי משמשים להדמיה של מיטוטי יחיד 11,12, מיוטי 13,14, או שאינם פוליטנים בין-פאזיים 15,16 ופוליטן 9,11,17 כרומוזומים. פרוטוקול פשוט וחזק להשגת צבעי כרומוזום יהיה שימושי מאוד בהרחבת טכניקה זו לאורגניזמים שאינם מודל, כגון יתושים. מתחם Anopheles gambiae הוא קבוצה של שבעה יתושים בלתי ניתנים להבחנה מורפולוגית המשתנים בהתנהגות ובהסתגלות, כולל היכולת להעביר מלריה.  יתושים אלה משמשים מודל מצוין כדי להבין טוב יותר את האבולוציה של מינים קרובים כי שונים מאוד ביכולת הווקטורית שלהם.  רוב המחקרים הציטוגנטיים יתושים מלריה נעשו באמצעות מפותחים, כרומוזומים פוליטניים מאוד (נבדק ב 18,19). דפוסי הפסים הקריאים של כרומוזומי פוליטן אפשרו לחוקרים להדגים את הקשר בין היפוכים פולימורפיים לבין התאמות אקולוגיות ב Anopheles gambiae 20. כמו כן, תכונות ספציפיות לרקמות של 21 ומינים של כרומוזום פוליטן תלת-ממדי התאפיינו במתחם An. macullipennis. עם זאת, לימוד כרומוזומים מיטוטיים יכול לספק מידע חשוב נוסף. לדוגמה, רמה גבוהה יותר של פולימורפיזם הטרוכרומטין שנצפה בכרומוזומים מיטוטיים כבר בקורלציה עם פעילות הזדווגות מופחתת ופוריות ב An. gambiae 23. קשה לבסס את ההתאמה בין מקטעים אוכרומטיים של זרועות פוליטן וכרומוזום מיטוטי רק על ידי השוואת אורכיהם היחסיים. הסיבה לכך היא שהטרוכרומטין מהווה חלק משמעותי בכרומוזומים מיטוטיים, אך אינו מיוצג בכרומוזומים פוליטנים 24. הזמינות של צבעי כרומוזום ליתושים מלריה תאפשר לחוקרים להרחיב באופן משמעותי מחקרים ציטוגנטיים על ידי הכללת מינים נוספים, תוך צמצום משמעותי של העלות והזמן בניתוחים של האבולוציה הקריוטיפית והדינמיקה התלת מימדית של כרומוזומים בקבוצה זו של חרקים חשובים מבחינה אפידמיולוגית.
על מנת להשיג קטעים גדולים של כרומוזומים, microdissection הפך טכניקה אינטגרלית כדי לתפעל ולבודד אזורים ספציפיים של עניין של המשלים כרומוזומלי.  בשילוב עם הגברה גנומית שלמה (WGA), מיקרו-דיסקציה גורמת ליישומים רבי עוצמה במורד הזרם כולל FISH 11,12 ו רצף הגנום של הדור הבא 25-27. בעבר, הטכניקה דרשה שימוש במחטי microdissection מיוחדים שהיו צריכים להיות נשלטים באופן ידני על ידי משתמש מנוסה 28.  ההתקדמות של microdissection לכידת לייזר (LCM) הביא כלי פשוט מתאים יותר עבור בידוד תאים בודדים 29,30 או כרומוזומים בודדים 31-33 עם סיכון פחת של זיהום. גישה זו מאפשרת למשתמש לחקור את ההטרוגניות הגנטית ואת מומים כרומוזומליים המתרחשים בתאים בודדים, במקום נוף קונצנזוס הנובע מאיגום תאים מרובים יחד 34-36. נעשה שימוש בשיטות מרובות כדי להגביר את הדנ"א המופק ממיקרו-דיסקציה.  DOP-PCR, טכניקה שימושית להגברת רצפים שחוזרים על עצמו מאוד, שימשה להגברת כרומוזומים microdissected ממינים כולל חגב 37, צלופחים קוצניים 38, ואת אמנון הנילוס 39.  לאחרונה, ערכת תא יחיד GenomePlex WGA4 מבוסס PCR והגברת תזוזה מרובה מבוסס (MDA) Repli-G תא יחיד ערכה הפכו כלים יקרי ערך לניסויים מעורבים ניתוח גנטי של תאים אנושיים בודדים, כמו גם כרומוזומים40-42, כולל מערכות כרומוזום B בחגבים 37 ו ארבה 43. שתי ערכות אלה כל אחד יש יתרונות וחסרונות, אבל העליונות לכאורה שלהם מעל מערכות הגברה זמינות אחרות הוכח 44.
כמות הדנ"א שניתן להשיג מכרומוזום יחיד או מקטע כרומוזום נמוכה משמעותית מזו של גרעין שלם. לכן מיקרו-דיסקציה, הגברה וניתוח עוקב של כרומוזום יחיד הם הרבה יותר מאתגרים, במיוחד באורגניזמים עם גנומים קטנים כמו בדרוסופילה או אנופלס.  למרות צבעים פותחו כרומוזומים microdissected יחיד של אדם 33 ו צריעה 45, ניסוי FISH מוצלח נדרש מרובים (לפחות 10-15) כרומוזומים מיטוטיים microdissected של זבוב פירות 11. עם זאת, היכולת microdissect ולהגבר כרומוזום יחיד יהיה חשוב עבור (i) הפחתת הסיכוי לזיהום עם חומר כרומוזום שונה, (ii) צמצום מספר ההכנות כרומוזומליות הדרושות microdissection, (iii) הפחתת נוקלאוטידים ופולימורפיזם מבני של המדגם microdissected הן FISH ו רצף במורד הזרם יישומים. כרומוזומי פוליטן המצויים במינים דיפטרניים רבים מציעים הזדמנות ייחודית לרכוש כמות התחלתית גבוהה בהרבה של דנ"א. הם גם מספקים רזולוציה גבוהה יותר ומבנה כרומוזום שלא ניתן להשיג באמצעות כרומוזומים מיטוטיים. רזולוציה נוספת זו יכולה להיות קריטית בהדמיית סידורים מחדש כרומוזומליים, מבנה כרומטין ומקטעים כרומוזומליים להיות microdissected 28,46.
כאן אנו מציגים הליך לבודד ביעילות קטע אוכרומטי מזרוע כרומוזום פוליטן יחיד, להגביר את ה- DNA, ולהשתמש בו ביישומי FISH במורד הזרם יתושים מלריה.  ראשית, אנו מיישמים LCM כדי לבודד ולחלץ זרוע כרומוזום אחת ממגלשות קרום שהוכנו במיוחד. שנית, WGA משמש כדי להגביר את ה-DNA מהחומר microdissected. שלישית, אנו הכלאה DNA מוגברת בניסויים FISH כדי polytene הכנות סקווש 47, metaphase ו שקופיות כרומוזום interphase 48, כמו גם דגימות הר שלמות השחלות 3D. הליך זה נעשה כדי לצייר בהצלחה את רוב האוכרומטין בזרועות כרומוזומליות של An. gambiae.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="562">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">A491-212</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Methanol</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:120px;">A412-4</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Propionic acid&#160;</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">402907</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Membrane slides 1.0 PET</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;">415190-9051-000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Buffer tablets &#8220;GURR&#8221;</td>
			<td style="width:112px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">10582-013</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">KaryoMAX Giemsa Stain</td>
			<td style="width:112px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">10092-013</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">ThermoBrite Slide Denaturation/Hybridization System</td>
			<td style="width:112px;">Abbott Molecular</td>
			<td style="width:120px;">30-144110</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Vacufuge vacuum concentrator</td>
			<td style="width:112px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:120px;">22820001</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">Spectroline Microprocessor-Controlled UV Crosslinker XL-1000</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">11-992-89</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:59px;width:191px;">Thermo Scientific NanoDrop</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">ND-2000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">REPLI-g Single Cell Kit</td>
			<td style="width:112px;">Qiagen</td>
			<td style="width:120px;">150343</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:191px;">GenomePlex Single Cell Kit (WGA4)</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">WGA4-10RXN</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">GenomePlex WGA Reamplification Kit (WGA3)</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">WGA3-50RXN</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:191px;">MZ6 Leica stereomicroscope</td>
			<td style="width:112px;">Leica</td>
			<td style="width:120px;">VA-OM-E194-354</td>
			<td style="width:139px;">A different stereomicroscope can be used</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">Olympus CX41 Phase Microscope</td>
			<td style="width:112px;">Olympus</td>
			<td style="width:120px;">CX41RF-5</td>
			<td style="width:139px;">A different phase microscope can be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">PALM MicroBeam Laser Microdissection Microscope</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Thermomixer</td>
			<td style="width:112px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:120px;">22670000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">10x PBS</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:120px;">P5493</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">50x Denhardt&#8217;s solution</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">D2532</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">99% Formamide</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP227500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Dextran sulfate sodium salt</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td style="width:120px;">D8906</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">20x SSC buffer</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:120px;">AM9765</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">ProLong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:120px;">P-36931</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">dATP, dCTP, dGTP, dTTP</td>
			<td style="width:112px;">Fermentas</td>
			<td style="width:120px;">R0141, R0151, R0161, R0171</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Cy3-dUTP, Cy5-dUTP</td>
			<td style="width:112px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:120px;">PA53022, PA55022</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">BSA</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">A3294</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">DNA polymerase I</td>
			<td style="width:112px;">Fermentas</td>
			<td style="width:120px;">EP0041</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">DNase I&#160;</td>
			<td style="width:112px;">Fermentas</td>
			<td style="width:120px;">EN0521</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Spermine</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">S3256-1G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Spermidine</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">S0266-1G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP366-500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP3581</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">EGTA</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">E0396-25G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">PIPES</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">P6757-25G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">EDTA</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">S311-500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Digitonin</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">D141-100MG</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Triton-X100</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP151-100</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">AdhesiveCap 500 clear</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;">415190-9211-000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">QIAamp DNA Micro Kit (50)</td>
			<td style="width:112px;">Qiagen</td>
			<td style="width:120px;">56304</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Genomic DNA Clean and Concentrator Kit</td>
			<td style="width:112px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:120px;">D4010</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">37% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">F79-500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

2d and 3d chromosome painting in malaria mosquitoes

פלואורסצנט בהכלאה במקום (FISH) של בדיקות כרומוזום זרוע שלמות היא טכניקה איתנה למיפוי אזורים גנומיים מעניינים, גילוי סידורים מחדש כרומוזומליים וחקר ארגון כרומוזומים תלת מימדי (3D) בגרעין התא. הופעתו של microdissection לכידת לייזר (LCM) והגברת הגנום כולו (WGA) מאפשר קבלת כמויות גדולות של DNA מתאים בודדים. הרגישות המוגברת של ערכות WGA גרמה לנו לפתח צבעי כרומוזום ולהשתמש בהם לחקר ארגון כרומוזום ואבולוציה באורגניזמים שאינם מודלים. כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה לבודד ולהגברת מקטעי האוכרומטיות של זרועות כרומוזום פוליטן יחיד מתאי אחות השחלות של יתוש המלריה האפריקאי אנופלס גמביה. הליך זה מספק פלטפורמה יעילה להשגת צבעי כרומוזום, תוך הפחתת הסיכון הכולל להחדרת דנ"א זר לדגימה. השימוש ב- WGA מאפשר מספר סבבים של הגברה מחדש, וכתוצאה מכך כמויות גבוהות של DNA שניתן להשתמש בהם לניסויים מרובים, כולל דגים דו-ממדיים ותלת-ממדיים. הוכחנו כי צבעי הכרומוזום המפותחים יכולים לשמש בהצלחה כדי לבסס את ההתאמה בין חלקים אוכרומטיים של זרועות פוליטן וכרומוזום מיטוטי ב An. gambiae. בסך הכל, האיחוד של LCM ו- WGA של כרומוזום יחיד מספק כלי יעיל ליצירת כמויות משמעותיות של דנ"א יעד למחקרים ציטוגנטיים וגנומיים עתידיים.

איור 1 מתאר את הזרימה הכוללת של הפרוטוקול המתואר במאמר זה.  המשתמש מתחיל בתחילה על ידי דגימות DNA כרומוזום microdissecting משקופיות קרום.  חומר מיקרו-מוזה מופק ומטוהר. לאחר מכן הדנ"א המטוהר מוגבר, מוגבר מחדש, מסומן מחדש ולאחר מכן משמש את FISH לתיוג ממרחי כרומוזום.
ניתן לחלק את פרוטוקול LCM לשלושה שלבים כוללים: 1) מציאת כרומוזומים מעניינים והכנת האזור לחיתוך(איור 2A),2) חיתוך וחיתוך אזור הכרומוזום המעניין באמצעות לייזר(איור 2B) בדיקהכדי לקבוע אם הדגימה אכן מוחלקת לכובעדבק (איור 2C). התהליך של LCM בשימוש על כרומוזומי פוליטן זן An. gambiae סואה מוצג וידאו 1. הסרטון מפרט את התהליך כולו מהפעלת התוכנית, כולל פונקציות תוכנה חשובות וטיפים.
ערכות WGA של תא יחיד GenomePlex ו- REPLI-g המשמשות בפרוטוקול זה שונות מאוד בגודל המוצר וכתוצאה מכך בתפוקה הכוללת.  איור 3 מראה את התוצאות של אלקטרופורזה ג'ל רץ עבור GenomePlex ו REPLI-g ערכות, כמו גם כימות של הדגימות על ידי Nanodrop.
חומר Microdissected שימש ליצירת בדיקות FISH כי היעד אזורים אוכרומטיים של כרומוזום.  איור 4 מדגים דגים של חמש גשושיות שנוצרו מחומר מיקרו-סודי על כרומוזומי פוליטן של א. גמביה.  ארבע זרועות אוטוזומליות סומנו עם שלושה פלואורופורים באמצעות ערכת WGA3: כרומוזום 3R מסומן בירוק (פלואורסצנט), כרומוזום 3L הוא בתערובת של אדום (Cy-3) וצהוב (Cy-5), כרומוזום 2R הוא בצהוב (Cy-5), ואת כרומוזום 2L הוא באדום (Cy-3). כרומוזום X תויג בכתום (Cy-3) באמצעות ניק-תרגום של חומר REPLI-g בניסוי נפרד. כדי לבסס את ההתכתבות בין חלקים אוכרומטיים של זרועות פוליטן וכרומוזום מיטוטי, צבעי כרומוזום הוכלאו לכרומוזומים בין-פאזיים, פרופאז, פרומטאפאז ומטאפאאז של א. גמביה (איור 5).  כדי לדמיין את הארגון 3D של זרוע אחת כרומוזום פוליטן בגרעין התא, דגים הר שלם בוצע על An. gambiae Sua זן תאים אחות השחלות (וידאו 2).  שטחי זרוע כרומוזום מובחנים נראים בבירור בגרעין עם כרומוזומי אינטרפאז(איור 5D)ופוליטן (וידאו 2).
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig1.jpg"> איור 1. ייצוג סכמטי של ההליכים הניסיוניים לקראת הכנת צבעי כרומוזום. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig2.jpg"> איור 2. השלבים העיקריים במיקרו-דיסקציה כרומוזום. A) חיתוך בסיוע לייזר של האזור הכרומוזומלי של עניין דרך הממברנה. ב) הממברנה עם חור לאחר הבליסטראות מבוצעת. ג) הנוף של החתיכה המפוספסת של הממברנה עם קטע כרומוזומלי בתוכה מחובר לכובע הדבק. החץ מציין את ההטרוכרומטין של כרומוזום X שנשאר בשקופית. כוכבית מראה חתיכה של כרומוזום אחר שנשאר על המגלשה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig3.jpg"> איור 3. תמונות ג'ל אגרוז מראה DNA אחרי WGA. A) משקל מולקולרי נמוך (200-500 bp) DNA מזרוע 3R לאחר שימוש בערכות WGA4 ו- WGA3 GenomePlex. B) משקל מולקולרי גבוה (10-20 kb) DNA מזרוע 2L לאחר הגברה REPLI-g. סולם 100 bp מוצג בנתיבים השמאליים. הטבלאות מתחת לתמונות ג'ל מראות ריכוזי דנ"א הנמדדים על ידי Nanodrop. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig3highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.</a>
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig4.jpg"> איור 4. ציור של כרומוזומי פוליטן מתאי אחות השחלות של א. גמביה באמצעות ארבע בדיקות שנוצרו מחומר מיקרו-דיסקטי. כרומוזום X מסומן בכתום (Cy-3) על ידי תרגום ניק של חומר REPLI-g. זרוע 2R מסומנת בצהוב (Cy-5); זרוע 2L היא באדום (Cy-3); זרוע 3R מסומנת בירוק (פלואורסצנטין); זרוע 3L מסומנת בתערובת של אדום (Cy-3) וצהוב (Cy-5). אוטומטיים מסומנים בערכת ההגברה WGA3. כרומטין מוכתם בכחול (DAPI). שמות כרומוזומים ממוקמים ליד אזורים טלומריים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig4highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.</a>
<img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig5.jpg"> איור 5. ציור של כרומוזומים בין-פאזיים (A), פרופאז (B), פרומטאפאז (C) וכרומוזומים של מטפאאז (D) מדיסקים דמיוניים זחלים של זן א. גמביה מופטי באמצעות שלוש בדיקות שנוצרו מחומר מיקרו-סודי המסומן על ידי WGA3. זרוע 2R מסומנת בירוק (פלואורסצנטין); זרוע 2L היא ללא תווית; זרוע 3R היא בוורוד, תערובת של אדום (Cy-3) וכתום (Cy-5); זרוע 3L מסומנת בכתום (Cy-5). לכרומוזום X יש תווית אדומה המתאימה לבדיקת 18S rDNA. כרומטין מוכתם בכחול (DAPI). אזורים מוכתמים בבהירות של כרומוזומים תואמים את ההטרוכרומטין. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig5highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.</a>
וידאו 1. התהליך של LCM של כרומוזומי פוליטן An. gambiae. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/Sharakhov_video1.mp4" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בסרטון 1.</a>
וידאו 2. כל הר 3D FISH שבוצע על An. גמביה תאים אחות השחלות. הגשושית מסומנת ב-Cy-3 (מתוארת בכחול) והתבצעה מזרוע כרומוזום 2R מיקרו-דיסקית.  כרומטין היה מוכתם ב- DAPI ומתואר על ידי ציאן פסאודו-צביעה (כחול בהיר). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/Video2.avi" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בסרטון 2.</a>

Watch this Scientific Journal Video about 2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes at JoVE.com

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

ציור כרומוזום הוא שיטה שימושית לחקר ארגון גרעין התא והתפתחות הקריוטיפ. כאן, אנו מדגימים גישה לבודד ולהגביר אזורים ספציפיים של עניין מכרומוזומי פוליטן יחיד המשמשים לאחר מכן עבור פלואורסצנט דו מימדי בהכלאה situ (FISH).

ציור כרומוזום דו מימדי ותלות מימדי אצל יתושים מלריה

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

2d-and-3d-chromosome-painting-in-malaria-mosquitoes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

פשוט פרוטוקול Chelex למיצוי DNA מ<em&gt; אנופלס</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes. Investigation of transcripts and gene regulators that are expressed in tissues in which the mosquito host and pathogen interact, and in organs involved in reproduction are of great interest for strategies to reduce mosquito-borne disease transmission and disrupt egg development. A number of tools have been employed to study and validate the temporal and tissue-specific regulation of gene expression. Here, we describe protocols that have been developed to obtain spatial information, which enhances our understanding of where specific genes are expressed and their products accumulate. The protocol described has been used to validate expression and determine accumulation patterns of transcripts in tissues related to mosquito-borne pathogen transmission, such as female salivary glands, as well as subcellular compartments of ovaries and embryos, which relate to mosquito reproduction and development. 
 The following procedures represent an optimized methodology that improves the efficiency of various steps in the protocol without loss of target-specific hybridization signals. Guidelines for RNA probe preparation, dissection of soft tissues and the general procedure for fixation and hybridization are described in Part A, while steps specific for the collection, fixation, pre-hybridization and hybridization of mosquito embryos are detailed in Part B.

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Temporal and spatial gene expression analyses have a crucial role in functional genomics. Whole-mount hybridization in situ is useful for determining the localization of transcripts within tissues and subcellular compartments. Here we outline a hybridization in situ protocol with modifications for specific target tissues in mosquitoes.

הכלאה<em&gt; באתרו</em&gt; של בלוטות הרוק, השחלות, ועוברים של וקטור יתושים

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. One important application of this method is the development of high-quality physical maps useful for improving the genome assemblies for various organisms. The natural banding pattern of polytene and mitotic chromosomes provides guidance for the precise ordering and orientation of the genomic supercontigs. Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, a well-established chromosome-based mapping technique has been developed only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes 1. As a result of genome mapping efforts, 88% of the An. gambiae genome has been placed to precise chromosome positions 2,3 . Two other mosquito genera, Aedes and Culex, have poorly polytenized chromosomes because of significant overrepresentation of transposable elements in their genomes 4, 5, 6. Only 31 and 9% of the genomic supercontings have been assigned without order or orientation to chromosomes of Ae. aegypti 7 and Cx. quinquefasciatus 8, respectively. Mitotic chromosome preparation for these two species had previously been limited to brain ganglia and cell lines. However, chromosome slides prepared from the brain ganglia of mosquitoes usually contain low numbers of metaphase plates 9. Also, although a FISH technique has been developed for mitotic chromosomes from a cell line of Ae. aegypti 10, the accumulation of multiple chromosomal rearrangements in cell line chromosomes 11 makes them useless for genome mapping. Here we describe a simple, robust technique for obtaining high-quality mitotic chromosome preparations from imaginal discs (IDs) of 4th instar larvae which can be used for all three genera of mosquitoes. A standard FISH protocol 12 is optimized for using BAC clones of genomic DNA as a probe on mitotic chromosomes of Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus, and for utilizing an intergenic spacer (IGS) region of ribosomal DNA (rDNA) as a probe on An. gambiae chromosomes. In addition to physical mapping, the developed technique can be applied to population cytogenetics and chromosome taxonomy/systematics of mosquitoes and other insect groups.

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, physical genome mapping techniques were established only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes. For the genera of Aedes and Culex, however, cytogenetic mapping remains challenging because of the poor quality of polytene chromosomes. Here we present a universal protocol for obtaining high-quality preparations of mitotic chromosomes and an optimized FISH protocol for all three genera of mosquitoes.

פלואורני<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה על כרומוזומים mitotic של יתושים

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency and type of chromosome aberrations in different cell types allows defects in DNA repair pathways to be elucidated. Understanding mammalian DNA repair biology has been greatly helped by the production of mice with knockouts in specific genes. The goal of this protocol is to quantify genomic instability in mouse B lymphocytes. Labeling of the telomeres using PNA-FISH probes (peptide nucleic acid - fluorescent in situ hybridization) facilitates the rapid analysis of genomic instability in metaphase chromosome spreads. B cells have specific advantages relative to fibroblasts, because they have normal ploidy and a higher mitotic index. Short-term culture of B cells therefore enables precise measurement of genomic instability in a primary cell population which is likely to have fewer secondary genetic mutations than what is typically found in transformed fibroblasts or patient cell lines.

DNA repair pathways are essential for maintenance of genomic integrity and preventing mutation and cancer. The goal of this protocol is to quantify genomic instability by direct observation of chromosome aberrations in metaphase spreads from mouse B cells using fluorescent in situ hybridization (FISH) for telomeric DNA repeats.

ניתוח מהיר של סטיות כרומוזום בעכבר לימפוציטים מסוג B על ידי הרשות הפלסטינית-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria

Despite decades of eradication efforts, malaria remains a global burden. Recent renewed interest in regional elimination and global eradication has been accompanied by increased genomic information about Plasmodium parasite species responsible for malaria, including characteristics of geographical populations as well as variations associated with reduced susceptibility to anti-malarial drugs.
One common genetic variation, single-nucleotide polymorphisms (SNPs), offers attractive targets for parasite genotyping. These markers are useful not only for tracking drug resistance markers but also for tracking parasite populations using markers not under drug or other selective pressures.
SNP genotyping methods offer the ability to track drug resistance as well as to fingerprint individual parasites for population surveillance, particularly in response to malaria control efforts in regions nearing elimination status.
While informative SNPs have been identified that are agnostic to specific genotyping technologies, high-resolution melting (HRM) analysis is particularly suited to field-based studies. Compared to standard fluorescent-probe based methods that require individual SNPs in a single labeled probe and offer at best 10% sensitivity to detect SNPs in samples that contain multiple genomes (polygenomic), HRM offers 2-5% sensitivity. Modifications to HRM, such as blocked probes and asymmetric primer concentrations as well as optimization of amplification annealing temperatures to bias PCR towards amplification of the minor allele, further increase the sensitivity of HRM. While the sensitivity improvement depends on the specific assay, we have increased detection sensitivities to less than 1% of the minor allele.
In regions approaching malaria eradication, early detection of emerging or imported drug resistance is essential for prompt response. Similarly, the ability to detect polygenomic infections and differentiate imported parasite types from cryptic local reservoirs can inform control programs.
This manuscript describes modifications to high resolution melting technology that further increase its sensitivity to identify polygenomic infections in patient samples.

While high resolution melting analysis offers the ability to differentiate between single nucleotide polymorphisms in a heterogeneous population, mutant allele amplification bias can increase its ability to detect alleles present at relatively low percentages within a sample. This protocol describes improvements that improve the sensitivity of high resolution melting analysis.

שיטות כדי להגדיל את הרגישות של רזולוציה גבוהה התכה יחידה נוקלאוטיד פולימורפיזם Genotyping במלריה

Despite decades of eradication efforts, malaria remains a global burden. Recent renewed interest in regional elimination and global eradication has been ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

<em&gt; במבחנה</em&gt; מודל למדידה של מערכת חיסונית למלריה בהקשר של HIV Co-זיהום

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible for most malaria-related deaths globally. Several factors including parasite sequestration in tissues, vascular dysfunction, and inflammatory responses influence the evolution of the disease in malaria-infected people. P. falciparum-infected red blood cells (iRBCs) release small extracellular vesicles (EVs) containing different kinds of cargo molecules that mediate pathogenesis and cellular communication between parasites and host. EVs are efficiently taken up by cells in which they modulate their function. Here we discuss strategies to address the role of EVs in parasite-host interactions. First, we describe a straightforward method for labeling and tracking EV internalization by endothelial cells, using a green cell linker dye. Second, we report a simple way to measure permeability across an endothelial cell monolayer by using a fluorescently labeled dextran. Finally, we show how to investigate the role of small non-coding RNA molecules in endothelial cell function.

In this work, we describe protocols to investigate the role of extracellular vesicles (EVs) released by Plasmodium falciparum infected erythrocytes. In particular, we focus on the interactions of EVs with endothelial cells.

הערכה של תפקוד שלפוחית חוץ-תאית במהלך מלריה זיהום

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines and/or antivirals have underscored the urgent need to develop ZIKV reverse genetic systems to facilitate the study of ZIKV biology and the development of therapeutic and/or prophylactic approaches. However, like with other flaviviruses, the generation of ZIKV full-length infectious cDNA clones has been hampered due to the toxicity of viral sequences during its amplification in bacteria. To overcome this problem, we have developed a nontraditional approach based on the use of bacterial artificial chromosomes (BACs). Using this approach, the full-length cDNA copy of the ZIKV strain Rio Grande do Norte Natal (ZIKV-RGN) is generated from four synthetic DNA fragments and assembled into the single-copy pBeloBAC11 plasmid under the control of the human cytomegalovirus (CMV) immediate-early promoter. The assembled BAC cDNA clone is stable during propagation in bacteria, and infectious recombinant (r)ZIKV is recovered in Vero cells after transfection of the BAC cDNA clone. The protocol described here provides a powerful technique for the generation of infectious clones of flaviviruses, including ZIKV, and other positive-strand RNA viruses, particularly those with large genomes that have stability problems during bacterial&#160;propagation.

The recent epidemic of Zika virus highlights the importance of establishing reverse genetic approaches to develop vaccines and/or therapeutic strategies. Here, we describe the protocol to rescue an infectious recombinant Zika virus from a full-length cDNA clone assembled in a bacterial artificial chromosome under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter.

הצלה של וירוס רקומביננטי Zika מתוך כרומוזום מלאכותי בקטריאלי cDNA שיבוט

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

וקטור יכולת ניתוחים על יתושים Aedes aegypti באמצעות וירוס זיקה

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of disease cases each year. E. aedis causes mortality and reduced reproductive fitness in the mosquito vector and has been explored for its potential as a biocontrol agent. The protocol we present for culturing E. aedis is based on its natural infection cycle, which involves both horizontal and vertical transmission at different life stages of the mosquito host. Ae. aegypti mosquitoes are exposed to spores in the larval stage. These infected larvae then mature into adults and transmit the parasite vertically to their offspring. Infected offspring are then used as a source of spores for future horizontal transmission. Culturing E. aedis can be challenging to the uninitiated given the complexities of the parasite&#8217;s life cycle, and this protocol provides detailed guidance and visual aids for clarification.

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

A protocol to culture the microsporidian parasite Edhazardia aedis. The parasite is passaged from one generation of Aedes aegypti mosquitoes to the next via horizontal transfer at the larval stage followed by vertical transmission at the adult stage. Live sporoplasms survive long-term in infected eggs.

התפשטות הטפיל המיקרו-ספורידיאן אדהאזרדיה אדיס ב-Aedes aegypti יתושים

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of ...