Name: 2d and 3d chromosome painting in malaria mosquitoes
Uploaded: 2014-01-06T17:30:00
Duration: 9 min 57 s
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इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों से मिलने वाले अनुदान का समर्थन मिला 1R21AI094289 इगोर वी शाराखोव को

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

माइक्रोडिसेक्टेड पॉलीटीन गुणसूत्र नमूनों से डीएनए को सफलतापूर्वक बढ़ाने के लिए कई कदम महत्वपूर्ण हैं । प्रोटोकॉल एलसीएम के उपयोग को नियोजित करता है, एक विधि जो दोनों समग्र दक्षता बढ़ाती है और नमूने के साथ भौतिक उपकरणों की बातचीत को हटाकर विदेशी डीएनए के संपर्क को कम करती है। हालांकि, विदेशी डीएनए का प्रवर्धन अभी भी इस प्रयोग का सबसे बड़ा संभावित नुकसान है । इस प्रकार, पूरी प्रक्रिया के दौरान, नमूनों को संदूषण से संरक्षित रखना आवश्यक है। स्लाइड तैयारी और माइक्रोडिसेक्शन चरणों के दौरान, इथेनॉल धोने विच्छेदन सुई, स्लाइड, कवर स्लिप, साथ ही कार्यक्षेत्र के लिए आवश्यक है।  उपयोग से पहले सभी लागू उपकरणों (सुई, स्लाइड, कवरलिप) का इलाज करने की सलाह भी दी जाती है।
विच्छेदन स्लाइड पर झिल्ली गुणसूत्रों का प्रसार बहुत मुश्किल बना देती है।  इन स्लाइडों को बनाते समय अंडाशय (अंडाशय की एक पूरी जोड़ी के लिए आधा) का अधिक उपयोग करना महत्वपूर्ण है, ताकि एक अच्छी तरह से फैलने वाले नाभिक को खोजने का अधिक मौका मिल सके।  स्लाइड बनाते समय ताजा ऊतक का उपयोग करने की भी सिफारिश की जाती है, क्योंकि प्रवर्धन दर ऊतकों की उम्र 49 और गुणसूत्र फैलने के रूप में गिरने लगती है।  माइक्रोडिसेक्शन के लिए स्लाइड्स तैयार करना इस प्रोटोकॉल में सबसे ज्यादा समय लेने वाला कदम है।  अवांछित सामग्री के आकस्मिक अधिग्रहण से बचने के लिए गुणसूत्रों को अच्छी तरह से फैलाया जाना चाहिए।  गिम्सा धुंधला उपयोगकर्ता माइक्रोडिसेक्शन सिस्टम का उपयोग करने से पहले एक चरण विपरीत माइक्रोस्कोप के साथ प्रसार गुणवत्ता की जांच करने की अनुमति देता है।
माइक्रोडिसेक्शन और प्रवर्धन का संयोजन ब्याज के छोटे क्षेत्रों से लेकर अधिकांश हथियारों तक आकार में रंगीन टुकड़ों को निकालने और विश्लेषण करने का अवसर प्रदान करता है।  यह प्रोटोकॉल उपयोगकर्ता को अमोर्फोलॉजिकल रूप से अलग क्षेत्रों जैसे इनवर्स, विशिष्ट यूक्रोमैटिक बैंड और इंटरबैंड, टेलोमेरिक, सेंट्रोमेरिक और इंटरकैलेरी हेट्रोक्रोमेटिन से डीएनए प्राप्त करने की अनुमति देता है। उपयोगकर्ता उत्पन्न पेंटिंग जांच को विशेष लोकी पर अंतर-प्रजाति होमोलॉजी का अध्ययन करने, या एक अक्षुण्ण 3 डी नाभिक में गुणसूत्रों के स्थानिक संगठन की विशेषता के लिए उत्पन्न पेंटिंग जांच लागू कर सकता है। गुणसूत्र पेंट विकसित करने के लिए, हमने कई गुणसूत्र क्षेत्रों के साथ दोहराव वाले डीएनए के संकरण से बचने के लिए यूक्रोमैटिक सेगमेंट का चयन किया। नतीजतन, हमने कुल जीनोमिक डीएनए या सी0 टी-1डीएनए अंश की तरह एक प्रतियोगी का उपयोग किए बिना हाथ-विशिष्ट पेंटिंग प्राप्त की।
हमने समीक्षाओं के आधार पर जीनोमप्लेक्स डब्ल्यूजीए और रिपली-जी किट का उपयोग करने का फैसला किया जो कई प्रवर्धन किट 40,44की दक्षता और ड्रॉपआउट दर की तुलना में करता है।  दोनों किट दोनों ड्रॉप आउट दर में उपलब्ध तरीकों के बीच सबसे अच्छा प्रदर्शन किया (जीनोमप्लेक्स REPLI-जी के ३७.५%) और प्रवर्धित मार्कर का प्रतिशत (जीनोमप्लेक्स में 45.24% प्रवर्धन दर बनाम रिपली-जी की 30.0%) 40. जीनोमप्लेक्स किट ने डीएनए की अधिक मात्रा भी प्रदान की, और इस प्रकार इसे कई डाउनस्ट्रीम तकनीकों के लिए एक बेहतर उम्मीदवार बना दिया।  जीनोमप्लेक्स प्रणाली के लिए एक पुनः प्रवर्धन किट भी उपलब्ध है, जो डीएनए के आगे प्रवर्धन के लिए अनुमति देता है। हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि प्रवर्धन सही नहीं है।  संभावना यह है कि सफल प्रवर्धन त्रुटियों को पेश कर सकता है या लक्ष्य डीएनए में विशिष्ट लोकी की ओर पूर्वाग्रह हो सकता है। उपलब्ध जीनोम प्रवर्धन विधियों के अंतिम टुकड़े आकार पर विचार करना महत्वपूर्ण है।  जीनोमप्लेक्स विखंडन 200-500 बीपी से लेकर टुकड़ों के साथ एक पुस्तकालय में परिणाम है, जबकि REPLI-जी किट आकार में लगभग 10-20 किलोलीटर टुकड़े पैदा करता है । इस प्रोटोकॉल का इरादा डाउनस्ट्रीम एप्लिकेशन मछली है, इस प्रकार जीनोमप्लेक्स किट को अधिक व्यवहार्य विकल्प बना रहा है, क्योंकि इसने वांछित टुकड़ा आकार और WGA के माध्यम से सीधे डीएनए टुकड़ों को लेबल करने की क्षमता प्रदान की है। REPLI-g प्रवर्धन द्वारा उत्पादित लंबे डीएनए अणुओं को डाउनस्ट्रीम निक-अनुवाद लेबलिंग प्रतिक्रिया में खंडित किया जाना चाहिए।
इस प्रोटोकॉल को एक पॉलीटीन गुणसूत्र बांह से डीएनए को सफलतापूर्वक बढ़ाने के लिए अनुकूलित किया गया है।  अन्य प्रोटोकॉल ों मेंनमूना 7, 11 ,28,40 को सफलतापूर्वक बढ़ाने के लिए कई (आमतौर पर10-30)गुणसूत्र के टुकड़ों की पूलिंग की आवश्यकता होती है।  यद्यपि हमारी विधि का उपयोग करके कई गुणसूत्रों का पूलिंग संभव है, लेकिन नमूना संदूषण की बढ़ी हुई संभावना संभव के रूप में कुछ गुणसूत्रों के साथ प्रयोग शुरू करने के महत्व पर जोर देती है। यदि पॉलीटेन गुणसूत्र उपलब्ध नहीं हैं, तो हमारे प्रोटोकॉल को माइटोटिक गुणसूत्रों में उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। हालांकि, सफल मछली11 के लिए प्रवर्धन से पहले 10-15 माइटोटिक गुणसूत्रों को पूल करना आवश्यक हो सकता है। शुरू टेम्पलेट डीएनए 50की उच्च मात्रा के साथ प्रवर्धन पूर्वाग्रह कम है। पॉलीटेन गुणसूत्र एक डीएनए अनुक्रम की लगभग 512 प्रतियां और दो समरूप डीएनए अनुक्रमों की 1024 प्रतियां प्रदान करते हैं।  इस प्रकार, माइटोटिक गुणसूत्रों को एकत्र करने से प्रवर्धन के बाद डीएनए उत्पाद की समग्र गुणवत्ता बढ़ाने में मदद मिलेगी।
इस प्रक्रिया में साइटोजेनेटिक और जीनोमिक अध्ययन में कई संभावित उपयोग होते हैं। यहां, हमने गुणसूत्र पेंट का उपयोग एक गाम्बियामें पॉलीटेन और मिटोटिक गुणसूत्र हथियारों के यूक्रोमैटिक खंडों के बीच पत्राचार स्थापित करने के लिए किया। एक ही पेंटिंग जांच को ए. गैम्बिया सेल लाइनों के साइटोजेनेटिक लक्षण वर्णन पर लागू किया जा सकता है। गुणसूत्र संख्या में व्यापक जीनोमिक पुनर्व्यवस्था और परिवर्तन कोशिका रेखाओं की सामान्य विशेषताएं हैं 51,52. विभिन्न मच्छर कोशिका लाइनों 53,54में एन्यूप्लाइडी, पॉलीप्लाइडी, और गुणसूत्र पुनर्व्यवस्था जैसे ट्रांसलोकेशन, इनर्स्पर्स, विलोपन, विलोपनऔररिंग गुणसूत्रों का पता लगाया गया है। शास्त्रीय साइटोजेनेटिक अवलोकन 55 और भौतिक मानचित्रण 56 ने मलेरिया मच्छरों के विकास में पूरे हाथ के गुणसूत्र ट्रांसलोकेशन की घटना का प्रदर्शन किया है। इसलिए, प्रजातियों के बीच गुणसूत्र क्षेत्रों की होमोलॉजी की तुलना करने के लिए मछली प्रयोगों के साथ सूक्ष्मडिस्दाित सामग्री का उपयोग किया जा सकता है। हमने पूरे माउंट ओवेरियन नर्स कोशिकाओं में पॉलीटीन गुणसूत्रों पर 2आर-पेंटिंग जांच के साथ 3डी फिश को सफलतापूर्वक अंजाम दिया। इस विधि से गुणसूत्र प्रक्षेप पथों का पता लगाने और एनोफेल्समें परमाणु वास्तुकला का अध्ययन करने में मदद मिलेगी । डीएनए जेनोटीपिंग 57,58,अगली पीढ़ी के जीनोम अनुक्रमण 26,27,भौतिक और लिंकेज मानचित्र विकास, और गुणसूत्र पेंटिंग 33,59 के लिए जांच की उत्पादन जैसी तकनीकें सभी हाथ और क्षेत्र-विशिष्ट माइक्रोडिसेक्शन से लाभान्वित हो सकती हैं। एलसीएम प्रौद्योगिकी के संयोजन और एकल सेल WGA को आगे बढ़ाने के द्वारा, हम एक पॉलीटीन गुणसूत्र हाथ से डीएनए की उचित मात्रा के उत्पादन के लिए एक कुशल, व्यावहारिक विधि प्रदर्शित करते हैं ।

गुणसूत्र चित्रकला 1-5 कायोटाइप के विकास का अध्ययन करने और फ्लोरोसेंटली लेबल वाले क्रोमोसोमल डीएनए 1, 6-8 के संकरण के माध्यम से साइटोजेनेटिक असामान्यताओं की कल्पना करने के लिए एक उपयोगी तकनीक है। यह विधि विकास 9 और पैथोलॉजी 10में गुणसूत्र क्षेत्रों की 3डी गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए भी लागू की जाती है । अलग-अलग माइटोटिक 11, 12,मेयोटिक13, 14,या इंटरफेज नॉन-पॉलीटेन 15,16और पॉलीटीन 9,11, 17 क्रोमोसोम के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए अलग-अलग लेबल वाले गुणक पेंट का उपयोग किया जाता है। गुणसूत्र पेंट प्राप्त करने के लिए एक सरल और मजबूत प्रोटोकॉल मच्छरों जैसे गैर-मॉडल जीवों के लिए इस तकनीक के विस्तार में बहुत उपयोगी होगा। एनोफेल्स गैम्बिया परिसर सात रूपात्मक रूप से अविवेच्य मच्छरों का एक समूह है जो मलेरिया संचारित करने की क्षमता सहित व्यवहार और अनुकूलन में भिन्न होते हैं।  ये मच्छर बारीकी से संबंधित प्रजातियों के विकास को बेहतर ढंग से समझने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल के रूप में काम करते हैं जो उनकी वेक्टरल क्षमता में बहुत भिन्न होते हैं।  मलेरिया मच्छरों में अधिकांश साइटोजेनेटिक अध्ययन अच्छी तरह से विकसित, अत्यधिक पॉलीटेनाइज्ड गुणसूत्रों (18, 19में समीक्षा) का उपयोग करके किए गए हैं। पॉलीटेन गुणसूत्रों के पठनीय बैंडिंग पैटर्न ने शोधकर्ताओं को एनोफेल्स गैम्बिया 20में बहुरूपिक उलटा और पारिस्थितिक अनुकूलन के बीच संबंध प्रदर्शित करने की अनुमति दी। इसके अलावा, ऊतक-विशिष्ट 21 और प्रजातियों-विशिष्ट 3 डी पॉलीटीन गुणसूत्र संगठन की विशिष्ट 22 विशेषताएं एएन मैकलिपेनिस परिसर में विशेषता रही हैं। हालांकि, माइटोटिक गुणसूत्रों का अध्ययन अतिरिक्त महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकता है। उदाहरण के लिए, माइटोटिक गुणसूत्रों में मनाए गए हेट्रोक्रोमोमाटिन बहुरूपता का उच्च स्तर ए. गाम्बियाई 23में कम संभोग गतिविधि और प्रजनन क्षमता के साथ सहसंबद्ध किया गया है। पॉलीटेन और माइटोटिक गुणसूत्र हथियारों के यूक्रोमैटिक खंडों के बीच पत्राचार केवल उनके सापेक्ष लंबाई की तुलना करके स्थापित करना मुश्किल हो सकता है। इसका कारण यह है कि हेट्रोक्रोमैटिन माइटोटिक गुणसूत्रों का एक महत्वपूर्ण हिस्सा बनाता है, लेकिन पॉलीटीन गुणसूत्रों 24में कम प्रतिनिधित्व किया जाता है। मलेरिया मच्छरों के लिए गुणसूत्र पेंट की उपलब्धता शोधकर्ताओं को अतिरिक्त प्रजातियों को शामिल करके साइटोजेनेटिक अध्ययनों का काफी विस्तार करने की अनुमति देगी, जबकि महामारी विज्ञान के इस समूह में कायोयत्पिक विकास और गुणसूत्रों की 3डी गतिशीलता के विश्लेषण में लागत और समय को काफी कम कर देगा।
गुणसूत्रों के बड़े हिस्सों को प्राप्त करने के लिए, माइक्रोडिसेक्शन गुणसूत्र पूरक के हित के विशिष्ट क्षेत्रों में हेरफेर और अलग-थलग करने के लिए एक अभिन्न तकनीक बन गया है।  जब पूरे जीनोम प्रवर्धन (डब्ल्यूजीए) के साथ मिलकर, माइक्रोडिसेक्शन के परिणामस्वरूप मछली 11,12 और अगली पीढ़ी के जीनोम अनुक्रमण 25-27सहित शक्तिशाली डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोग होते हैं। पहले, तकनीक के लिए विशेष माइक्रोडिसेक्शन सुइयों के उपयोग की आवश्यकता होती थी जिसे एक अनुभवी उपयोगकर्ता द्वारा मैन्युअल रूप से नियंत्रित किया जाना था 28।  लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन (एलसीएम) की उन्नति के परिणामस्वरूप एक सरलीकृत उपकरण बेहतर रूप से एकल कोशिकाओं 29,30 या व्यक्तिगत गुणसूत्रों को अलग करने के लिए उपयुक्त है 31-33 प्रदूषण के कम जोखिम के साथ। यह दृष्टिकोण उपयोगकर्ता को एक आम सहमति परिदृश्य के बजाय, एकल कोशिकाओं में होने वाली आनुवंशिक विषमताओं और गुणसूत्र असामान्यताओं का अध्ययन करने की अनुमति देता है, जिसके परिणामस्वरूप कई कोशिकाओं को एक साथ 34-36से पूलिंग किया जाता है। माइक्रोडिसेक्शन से उत्पादित डीएनए को बढ़ाने के लिए कई तरीकों का उपयोग किया गया है।  डीओपी-पीसीआर, अत्यधिक दोहराव वाले दृश्यों के प्रवर्धन के लिए उपयोगी तकनीक, टिड्डी 37,स्पाइनी ईल 38और नील तिलपिया 39सहित प्रजातियों से माइक्रोडिसेक्टेड गुणसूत्रों को बढ़ाने के लिए उपयोग किया गया है।  हाल ही में, पीसीआर आधारित जीनोमप्लेक्स WGA4 सिंगल सेल किट और मल्टीपल विस्थापन प्रवर्धन आधारित (एमडीए) रिपली-जी सिंगल सेल किट एकल मानव कोशिकाओं के आनुवंशिक विश्लेषण के साथ-साथगुणसूत्रों 40-42के आनुवंशिक विश्लेषण से जुड़े प्रयोगों के लिए मूल्यवान उपकरण बन गए हैं, जिसमें टिड्डी 37 और टिड्डी 43में बी क्रोमोसोम सिस्टम शामिल हैं। इन दो किट प्रत्येक लाभ और नुकसान है, लेकिन अन्य उपलब्ध प्रवर्धन प्रणाली के ऊपर उनकी स्पष्ट श्रेष्ठता 44का प्रदर्शन किया गया है.
डीएनए की मात्रा जो एक गुणसूत्र या गुणसूत्र खंड से प्राप्त की जा सकती है, एक पूरे नाभिक की तुलना में काफी कम है। इसलिए माइक्रोडिसेक्शन, प्रवर्धन और एक गुणसूत्र का बाद में विश्लेषण कहीं अधिक चुनौतीपूर्ण है, विशेष रूप से ड्रोसोफिला या एनोफेल्सजैसे छोटे जीनोम वाले जीवों में।  यद्यपि पेंट को मानव 33 और एक ततैया 45के एकल माइक्रोडिसेक्टेड गुणसूत्रों से विकसित किया गया है, लेकिन एक सफल मछली प्रयोग के लिए फल फ्लाई 11के कई (कम से कम 10-15) माइक्रोडिसेक्टेड माइटोटिक गुणसूत्रों की आवश्यकता होती है। हालांकि, एक गुणसूत्र को माइक्रोडिसेक्ट और बढ़ाना करने की क्षमता (i) के लिए महत्वपूर्ण होगी, जो एक अलग गुणसूत्र से सामग्री के साथ संदूषण की संभावना को कम करती है, (ii) माइक्रोडिसेक्शन के लिए आवश्यक गुणसूत्र तैयारियों की संख्या को कम करती है, (iii) मछली और अनुक्रमण दोनों में माइक्रोडिसेक्टेड नमूने के न्यूक्लियोटाइड और संरचनात्मक बहुरूपता को कम करना। कई डिप्टरन प्रजातियों में पाए जाने वाले पॉलीटेन गुणसूत्र डीएनए की बहुत अधिक शुरुआती मात्रा प्राप्त करने का एक अनूठा अवसर प्रदान करते हैं। वे एक उच्च संकल्प और गुणसूत्र संरचना भी प्रदान करते हैं जिसे माइटोटिक गुणसूत्रों के उपयोग के माध्यम से प्राप्त नहीं किया जा सकता है। यह जोड़ा गया संकल्प क्रोमोसोमल पुनर्व्यवस्थाओं, क्रोमेटिन संरचना और क्रोमोसोमल खंडों को माइक्रोडिसेक्टेड 28,46होने की कल्पना करने में महत्वपूर्ण हो सकता है।
यहां हम एक एकल पॉलीटीन गुणसूत्र हाथ से एक यूक्रोमेटिक सेगमेंट को कुशलतापूर्वक अलग करने, डीएनए को बढ़ाने और मलेरिया मच्छरों में डाउनस्ट्रीम फिश अनुप्रयोगों में इसका उपयोग करने के लिए एक प्रक्रिया प्रस्तुत करते हैं।  सबसे पहले, हम विशेष रूप से तैयार झिल्ली स्लाइड से एक गुणसूत्र हाथ को अलग करने और निकालने के लिए एलसीएम लागू करते हैं। दूसरा, WGA का उपयोग माइक्रोडिसेक्टेड सामग्री से डीएनए को बढ़ाना है। तीसरा, हम मछली प्रयोगों में परिलक्षित डीएनए को पॉलीटेन स्क्वैश तैयारी 47,मेटाफेज और इंटरफेज गुणसूत्र स्लाइड 48,साथ ही 3 डी ओवेरियन पूरे माउंट नमूनों को संकरित करते हैं। यह प्रक्रिया एक गाम्बियाके गुणसूत्र हथियारों में अधिकांश यूक्रोमेटिन को सफलतापूर्वक पेंट करने के लिए की गई है ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="562">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">A491-212</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Methanol</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:120px;">A412-4</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Propionic acid&#160;</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">402907</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Membrane slides 1.0 PET</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;">415190-9051-000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Buffer tablets &#8220;GURR&#8221;</td>
			<td style="width:112px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">10582-013</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">KaryoMAX Giemsa Stain</td>
			<td style="width:112px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">10092-013</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">ThermoBrite Slide Denaturation/Hybridization System</td>
			<td style="width:112px;">Abbott Molecular</td>
			<td style="width:120px;">30-144110</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Vacufuge vacuum concentrator</td>
			<td style="width:112px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:120px;">22820001</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">Spectroline Microprocessor-Controlled UV Crosslinker XL-1000</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">11-992-89</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:59px;width:191px;">Thermo Scientific NanoDrop</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">ND-2000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">REPLI-g Single Cell Kit</td>
			<td style="width:112px;">Qiagen</td>
			<td style="width:120px;">150343</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:191px;">GenomePlex Single Cell Kit (WGA4)</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">WGA4-10RXN</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">GenomePlex WGA Reamplification Kit (WGA3)</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">WGA3-50RXN</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:191px;">MZ6 Leica stereomicroscope</td>
			<td style="width:112px;">Leica</td>
			<td style="width:120px;">VA-OM-E194-354</td>
			<td style="width:139px;">A different stereomicroscope can be used</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">Olympus CX41 Phase Microscope</td>
			<td style="width:112px;">Olympus</td>
			<td style="width:120px;">CX41RF-5</td>
			<td style="width:139px;">A different phase microscope can be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">PALM MicroBeam Laser Microdissection Microscope</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Thermomixer</td>
			<td style="width:112px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:120px;">22670000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">10x PBS</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:120px;">P5493</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">50x Denhardt&#8217;s solution</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">D2532</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">99% Formamide</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP227500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Dextran sulfate sodium salt</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td style="width:120px;">D8906</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">20x SSC buffer</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:120px;">AM9765</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">ProLong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:120px;">P-36931</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">dATP, dCTP, dGTP, dTTP</td>
			<td style="width:112px;">Fermentas</td>
			<td style="width:120px;">R0141, R0151, R0161, R0171</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Cy3-dUTP, Cy5-dUTP</td>
			<td style="width:112px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:120px;">PA53022, PA55022</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">BSA</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">A3294</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">DNA polymerase I</td>
			<td style="width:112px;">Fermentas</td>
			<td style="width:120px;">EP0041</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">DNase I&#160;</td>
			<td style="width:112px;">Fermentas</td>
			<td style="width:120px;">EN0521</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Spermine</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">S3256-1G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Spermidine</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">S0266-1G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP366-500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP3581</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">EGTA</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">E0396-25G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">PIPES</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">P6757-25G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">EDTA</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">S311-500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Digitonin</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">D141-100MG</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Triton-X100</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP151-100</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">AdhesiveCap 500 clear</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;">415190-9211-000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">QIAamp DNA Micro Kit (50)</td>
			<td style="width:112px;">Qiagen</td>
			<td style="width:120px;">56304</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Genomic DNA Clean and Concentrator Kit</td>
			<td style="width:112px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:120px;">D4010</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">37% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">F79-500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

2d and 3d chromosome painting in malaria mosquitoes

पूरे हाथ गुणसूत्र जांच के सीटू संकरण (मछली) में फ्लोरोसेंट ब्याज के जीनोमिक क्षेत्रों के मानचित्रण, गुणसूत्र पुनर्व्यवस्थाओं का पता लगाने, और कोशिका नाभिक में गुणसूत्रों के त्रि-आयामी (3 डी) संगठन का अध्ययन करने के लिए एक मजबूत तकनीक है। लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन (एलसीएम) और पूरे जीनोम प्रवर्धन (डब्ल्यूजीए) का आगमन एकल कोशिकाओं से बड़ी मात्रा में डीएनए प्राप्त करने की अनुमति देता है। WGA किट की बढ़ी हुई संवेदनशीलता ने हमें गुणसूत्र पेंट विकसित करने और गैर-मॉडल जीवों में गुणसूत्र संगठन और विकास की खोज के लिए उनका उपयोग करने के लिए प्रेरित किया। यहां, हम अफ्रीकी मलेरिया मच्छर एनोफेल्स गैम्बियाकी ओवेरियन नर्स कोशिकाओं से एकल पॉलीटीन गुणसूत्र हथियारों के यूक्रोमैटिक खंडों को अलग-थलग करने और बढ़ाने के लिए एक सरल विधि प्रस्तुत करते हैं। यह प्रक्रिया गुणसूत्र पेंट प्राप्त करने के लिए एक कुशल मंच प्रदान करती है, जबकि नमूने के लिए विदेशी डीएनए शुरू करने के समग्र जोखिम को कम करती है। WGA का उपयोग पुनः प्रवर्धन के कई दौर के लिए अनुमति देता है, जिसके परिणामस्वरूप डीएनए की उच्च मात्रा होती है जिसका उपयोग 2डी और 3डी मछली सहित कई प्रयोगों के लिए किया जा सकता है। हमने दिखा दिया कि विकसित गुणसूत्र पेंट का उपयोग एएन गाम्बियामें पॉलीटेन और मिटोटिक गुणसूत्र हथियारों के यूक्रोमैटिक भागों के बीच पत्राचार स्थापित करने के लिए सफलतापूर्वक किया जा सकता है । कुल मिलाकर, एलसीएम और एकल गुणसूत्र WGA का संघ भविष्य साइटोजेनेटिक और जीनोमिक अध्ययनों के लिए लक्ष्य डीएनए की महत्वपूर्ण मात्रा बनाने के लिए एक कुशल उपकरण प्रदान करता है।

चित्रा 1 इस लेख में वर्णित प्रोटोकॉल के समग्र प्रवाह-माध्यम का वर्णन करता है।  उपयोगकर्ता शुरू में झिल्ली स्लाइड से गुणसूत्र डीएनए नमूनों माइक्रोडिसेक्टिंग द्वारा शुरू होता है ।  माइक्रोडिसेक्टेड सामग्री निकाली जाती है और शुद्ध की जाती है। शुद्ध डीएनए तो परिलक्षित, फिर से परिलक्षित, लेबल, और फिर मछली के लिए इस्तेमाल किया गुणसूत्र फैलता लेबल है ।
एलसीएम प्रोटोकॉल को तीन समग्र चरणों में तोड़ा जा सकता है: 1) ब्याज के गुणसूत्रों को ढूंढना और इस क्षेत्र को काटने के लिए तैयार करना(चित्रा 2A),2) लेजर(चित्रा 2B) और 3)के माध्यम से ब्याज के गुणसूत्र क्षेत्र को काटने और गुलेल करना, और 3) यह निर्धारित करने के लिए जांच करना कि क्या नमूना वास्तव में चिपकने वाली टोपी(चित्रा 2C)में पहुंचाया गया है। 1 गैम्बिया सुआ स्ट्रेन पॉलीटीन क्रोमोसोम्स पर इस्तेमाल होने वाली एलसीएम की प्रक्रिया वीडियो 1 में दिखाई गई है। वीडियो प्रोग्राम स्टार्ट अप से पूरी प्रक्रिया का विवरण देता है, जिसमें महत्वपूर्ण सॉफ्टवेयर कार्य और सुझाव शामिल हैं।
इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले जीनोमप्लेक्स और रिपली-जी एकल सेल डब्ल्यूजीए किट उत्पाद आकार के साथ-साथ समग्र उपज में बहुत भिन्न होते हैं।  चित्रा 3 से पता चलता है कि जैल इलेक्ट्रोफोरेसिस के परिणाम जीनोमप्लेक्स और रिपली-जी किट के लिए भाग गए, साथ ही नैनोड्रॉप द्वारा नमूनों की मात्राकरण भी।
मछली जांच बनाने के लिए माइक्रोडिसेक्टेड सामग्री का उपयोग किया गया है जो गुणसूत्र के यू गुणसूत्र क्षेत्रों को लक्षित करता है।  चित्रा 4 एक गाम्बियाके पॉलीटीन गुणसूत्रों पर माइक्रोडिसेक्टेड सामग्री से उत्पन्न पांच जांचों की मछली को दर्शाता है ।  चार ऑटोसोमल हथियारों को WGA3 किट का उपयोग करके तीन फ्लोरोफोरस के साथ लेबल किया गया था: 3आर गुणसूत्र हरे रंग (फ्लोरोसीन) में लेबल किया गया है, 3L गुणसूत्र लाल (Cy-3) और पीले (Cy-5) के मिश्रण में है, 2R गुणसूत्र पीले (Cy-5) में है, और 2L गुणसूत्र लाल (Cy-3) में है। एक्स गुणसूत्र एक अलग प्रयोग में REPLI-जी सामग्री के निक अनुवाद का उपयोग कर नारंगी (Cy-3) में लेबल किया गया था । पॉलीटेन और माइटोटिक गुणसूत्र हथियारों के यूक्रोमैटिक भागों के बीच पत्राचार स्थापित करने के लिए, गुणसूत्र पेंट को इंटरफेज, प्रोफैसे, प्रोमेटाफेज और मेटाफेज क्रोमोसोम्स ऑफ ए गाम्बिया (चित्रा 5)के लिए संकरित किया गया है।  कोशिका नाभिक में एक पॉलीटीन गुणसूत्र हाथ के 3 डी संगठन की कल्पना करने के लिए, पूरे माउंट फिश को ए. गैम्बिया सुआ स्ट्रेन ओवेरियन नर्स कोशिकाओं (वीडियो 2) पर किया गया था।  अंतरप्राज(चित्रा 5D)और पॉलीटीन (वीडियो 2) गुणसूत्रों के साथ नाभिक में विशिष्ट गुणसूत्र हाथ क्षेत्रों को स्पष्ट रूप से देखा जाता है।
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig1.jpg"> चित्रा 1. गुणसूत्र पेंट की तैयारी की ओर प्रायोगिक प्रक्रियाओं का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig1highres.jpg" target="_blank">बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig2.jpg"> चित्रा 2। गुणसूत्र माइक्रोडिसेक्शन में प्रमुख कदम। ए) झिल्ली के माध्यम से ब्याज के गुणसूत्र क्षेत्र की लेजर सहायता प्राप्त काटने। ख) गुलेल के बाद एक छेद के साथ झिल्ली किया जाता है । ग) चिपकने वाली टोपी से जुड़े इसमें एक गुणसूत्र खंड के साथ झिल्ली के गुलेल टुकड़े का दृश्य । यह तीर एक्स क्रोमोसोम के हेट्रोक्रोमेटिन को इंगित करता है जो स्लाइड पर बना हुआ था। तारक एक और गुणसूत्र का एक टुकड़ा दिखाता है जो स्लाइड पर बना रहा । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig2highres.jpg" target="_blank">बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig3.jpg"> चित्र 3। Agarose जेल छवियों WGA के बाद डीएनए दिखा । ए) WGA4 और WGA3 जीनोमप्लेक्स किट का उपयोग करने के बाद हाथ 3R से कम आणविक वजन (200-500 बीपी) डीएनए । B) रिपली-जी प्रवर्धन के बाद आर्म 2L से उच्च आणविक वजन (10-20 केबी) डीएनए। 100 बीपी सीढ़ी बाईं गलियों में दिखाई गई है। जेल छवियों के नीचे टेबल नैनोड्रॉप द्वारा मापा डीएनए सांद्रता दिखाते हैं । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig3highres.jpg" target="_blank">बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig4.jpg"> चित्र 4. माइक्रोडिसेक्टेड सामग्री से उत्पन्न चार जांचों का उपयोग करके ए. गैम्बिया की ओवेरियन नर्स कोशिकाओं से पॉलीटीन गुणसूत्रों की चित्रकारी। एक्स गुणसूत्र को नारंगी (Cy-3) में REPLI-g सामग्री के निक-अनुवाद द्वारा लेबल किया गया है। 2आर आर्म पीले रंग (Cy-5) में लेबल किया गया है; 2L हाथ लाल (Cy-3) में है; 3R हाथ हरे रंग में लेबल है (फ्लोरोसेइन); 3L हाथ लाल (Cy-3) और पीले (Cy-5) के मिश्रण में लेबल है। ऑटोसोम्स को WGA3 प्रवर्धन किट के साथ लेबल किया गया है। क्रोमेटिन नीले रंग (DAPI) में दाग है। क्रोमोसोम नाम टेलोमेरिक क्षेत्रों के पास रखे जाते हैं। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig4highres.jpg" target="_blank">बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig5.jpg"> चित्रा 5। WGA3 द्वारा लेबल किए गए माइक्रोडिसेक्टेड सामग्री से उत्पन्न तीन जांचों का उपयोग करके ए. गाम्बिया मोप्ती तनाव के लार्वा कल्पित डिस्क से इंटरफेज (ए), प्रोफैसे (बी), प्रोमेटाफेज (सी) और मेटाफेज (डी) गुणसूत्रों की पेंटिंग। 2आर आर्म हरे रंग (फ्लोरोसीइन) में लेबल किया गया है; 2L हाथ अवेलेबल है; 3R हाथ गुलाबी रंग में है, लाल (Cy-3) और नारंगी (Cy-5) का मिश्रण; 3L हाथ नारंगी (Cy-5) में लेबल है। एक्स गुणसूत्र में 18S rDNA जांच के अनुरूप एक लाल लेबल है। क्रोमेटिन नीले रंग (DAPI) में दाग है। गुणसूत्रों के चमकीले दाग वाले क्षेत्र हेट्रोक्रोमोटिन के अनुरूप होते हैं। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig5highres.jpg" target="_blank">बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
वीडियो 1. एएन गाम्बिया पॉलीटीन गुणसूत्रों की एलसीएम की प्रक्रिया। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/Sharakhov_video1.mp4" target="_blank">वीडियो 1 देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
वीडियो 2. पूरे माउंट 3 डी मछली एक gambiae अंडाशय नर्स कोशिकाओं पर प्रदर्शन किया । जांच Cy-3 में लेबल है (नीले रंग में चित्रित) और एक माइक्रोडिसेक्टेड 2R गुणसूत्र हाथ से किया गया था ।  क्रोमेटिन को डीएपीआई से दाग दिया गया था और इसे सियान छद्म रंग (हल्के नीले) द्वारा चित्रित किया गया है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/Video2.avi" target="_blank">वीडियो 2 देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>

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2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

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