Name: 2d and 3d chromosome painting in malaria mosquitoes
Uploaded: 2014-01-06T17:30:00
Duration: 9 min 57 s
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इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों से मिलने वाले अनुदान का समर्थन मिला 1R21AI094289 इगोर वी शाराखोव को

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

माइक्रोडिसेक्टेड पॉलीटीन गुणसूत्र नमूनों से डीएनए को सफलतापूर्वक बढ़ाने के लिए कई कदम महत्वपूर्ण हैं । प्रोटोकॉल एलसीएम के उपयोग को नियोजित करता है, एक विधि जो दोनों समग्र दक्षता बढ़ाती है और नमूने के साथ भौतिक उपकरणों की बातचीत को हटाकर विदेशी डीएनए के संपर्क को कम करती है। हालांकि, विदेशी डीएनए का प्रवर्धन अभी भी इस प्रयोग का सबसे बड़ा संभावित नुकसान है । इस प्रकार, पूरी प्रक्रिया के दौरान, नमूनों को संदूषण से संरक्षित रखना आवश्यक है। स्लाइड तैयारी और माइक्रोडिसेक्शन चरणों के दौरान, इथेनॉल धोने विच्छेदन सुई, स्लाइड, कवर स्लिप, साथ ही कार्यक्षेत्र के लिए आवश्यक है।  उपयोग से पहले सभी लागू उपकरणों (सुई, स्लाइड, कवरलिप) का इलाज करने की सलाह भी दी जाती है।
विच्छेदन स्लाइड पर झिल्ली गुणसूत्रों का प्रसार बहुत मुश्किल बना देती है।  इन स्लाइडों को बनाते समय अंडाशय (अंडाशय की एक पूरी जोड़ी के लिए आधा) का अधिक उपयोग करना महत्वपूर्ण है, ताकि एक अच्छी तरह से फैलने वाले नाभिक को खोजने का अधिक मौका मिल सके।  स्लाइड बनाते समय ताजा ऊतक का उपयोग करने की भी सिफारिश की जाती है, क्योंकि प्रवर्धन दर ऊतकों की उम्र 49 और गुणसूत्र फैलने के रूप में गिरने लगती है।  माइक्रोडिसेक्शन के लिए स्लाइड्स तैयार करना इस प्रोटोकॉल में सबसे ज्यादा समय लेने वाला कदम है।  अवांछित सामग्री के आकस्मिक अधिग्रहण से बचने के लिए गुणसूत्रों को अच्छी तरह से फैलाया जाना चाहिए।  गिम्सा धुंधला उपयोगकर्ता माइक्रोडिसेक्शन सिस्टम का उपयोग करने से पहले एक चरण विपरीत माइक्रोस्कोप के साथ प्रसार गुणवत्ता की जांच करने की अनुमति देता है।
माइक्रोडिसेक्शन और प्रवर्धन का संयोजन ब्याज के छोटे क्षेत्रों से लेकर अधिकांश हथियारों तक आकार में रंगीन टुकड़ों को निकालने और विश्लेषण करने का अवसर प्रदान करता है।  यह प्रोटोकॉल उपयोगकर्ता को अमोर्फोलॉजिकल रूप से अलग क्षेत्रों जैसे इनवर्स, विशिष्ट यूक्रोमैटिक बैंड और इंटरबैंड, टेलोमेरिक, सेंट्रोमेरिक और इंटरकैलेरी हेट्रोक्रोमेटिन से डीएनए प्राप्त करने की अनुमति देता है। उपयोगकर्ता उत्पन्न पेंटिंग जांच को विशेष लोकी पर अंतर-प्रजाति होमोलॉजी का अध्ययन करने, या एक अक्षुण्ण 3 डी नाभिक में गुणसूत्रों के स्थानिक संगठन की विशेषता के लिए उत्पन्न पेंटिंग जांच लागू कर सकता है। गुणसूत्र पेंट विकसित करने के लिए, हमने कई गुणसूत्र क्षेत्रों के साथ दोहराव वाले डीएनए के संकरण से बचने के लिए यूक्रोमैटिक सेगमेंट का चयन किया। नतीजतन, हमने कुल जीनोमिक डीएनए या सी0 टी-1डीएनए अंश की तरह एक प्रतियोगी का उपयोग किए बिना हाथ-विशिष्ट पेंटिंग प्राप्त की।
हमने समीक्षाओं के आधार पर जीनोमप्लेक्स डब्ल्यूजीए और रिपली-जी किट का उपयोग करने का फैसला किया जो कई प्रवर्धन किट 40,44की दक्षता और ड्रॉपआउट दर की तुलना में करता है।  दोनों किट दोनों ड्रॉप आउट दर में उपलब्ध तरीकों के बीच सबसे अच्छा प्रदर्शन किया (जीनोमप्लेक्स REPLI-जी के ३७.५%) और प्रवर्धित मार्कर का प्रतिशत (जीनोमप्लेक्स में 45.24% प्रवर्धन दर बनाम रिपली-जी की 30.0%) 40. जीनोमप्लेक्स किट ने डीएनए की अधिक मात्रा भी प्रदान की, और इस प्रकार इसे कई डाउनस्ट्रीम तकनीकों के लिए एक बेहतर उम्मीदवार बना दिया।  जीनोमप्लेक्स प्रणाली के लिए एक पुनः प्रवर्धन किट भी उपलब्ध है, जो डीएनए के आगे प्रवर्धन के लिए अनुमति देता है। हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि प्रवर्धन सही नहीं है।  संभावना यह है कि सफल प्रवर्धन त्रुटियों को पेश कर सकता है या लक्ष्य डीएनए में विशिष्ट लोकी की ओर पूर्वाग्रह हो सकता है। उपलब्ध जीनोम प्रवर्धन विधियों के अंतिम टुकड़े आकार पर विचार करना महत्वपूर्ण है।  जीनोमप्लेक्स विखंडन 200-500 बीपी से लेकर टुकड़ों के साथ एक पुस्तकालय में परिणाम है, जबकि REPLI-जी किट आकार में लगभग 10-20 किलोलीटर टुकड़े पैदा करता है । इस प्रोटोकॉल का इरादा डाउनस्ट्रीम एप्लिकेशन मछली है, इस प्रकार जीनोमप्लेक्स किट को अधिक व्यवहार्य विकल्प बना रहा है, क्योंकि इसने वांछित टुकड़ा आकार और WGA के माध्यम से सीधे डीएनए टुकड़ों को लेबल करने की क्षमता प्रदान की है। REPLI-g प्रवर्धन द्वारा उत्पादित लंबे डीएनए अणुओं को डाउनस्ट्रीम निक-अनुवाद लेबलिंग प्रतिक्रिया में खंडित किया जाना चाहिए।
इस प्रोटोकॉल को एक पॉलीटीन गुणसूत्र बांह से डीएनए को सफलतापूर्वक बढ़ाने के लिए अनुकूलित किया गया है।  अन्य प्रोटोकॉल ों मेंनमूना 7, 11 ,28,40 को सफलतापूर्वक बढ़ाने के लिए कई (आमतौर पर10-30)गुणसूत्र के टुकड़ों की पूलिंग की आवश्यकता होती है।  यद्यपि हमारी विधि का उपयोग करके कई गुणसूत्रों का पूलिंग संभव है, लेकिन नमूना संदूषण की बढ़ी हुई संभावना संभव के रूप में कुछ गुणसूत्रों के साथ प्रयोग शुरू करने के महत्व पर जोर देती है। यदि पॉलीटेन गुणसूत्र उपलब्ध नहीं हैं, तो हमारे प्रोटोकॉल को माइटोटिक गुणसूत्रों में उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। हालांकि, सफल मछली11 के लिए प्रवर्धन से पहले 10-15 माइटोटिक गुणसूत्रों को पूल करना आवश्यक हो सकता है। शुरू टेम्पलेट डीएनए 50की उच्च मात्रा के साथ प्रवर्धन पूर्वाग्रह कम है। पॉलीटेन गुणसूत्र एक डीएनए अनुक्रम की लगभग 512 प्रतियां और दो समरूप डीएनए अनुक्रमों की 1024 प्रतियां प्रदान करते हैं।  इस प्रकार, माइटोटिक गुणसूत्रों को एकत्र करने से प्रवर्धन के बाद डीएनए उत्पाद की समग्र गुणवत्ता बढ़ाने में मदद मिलेगी।
इस प्रक्रिया में साइटोजेनेटिक और जीनोमिक अध्ययन में कई संभावित उपयोग होते हैं। यहां, हमने गुणसूत्र पेंट का उपयोग एक गाम्बियामें पॉलीटेन और मिटोटिक गुणसूत्र हथियारों के यूक्रोमैटिक खंडों के बीच पत्राचार स्थापित करने के लिए किया। एक ही पेंटिंग जांच को ए. गैम्बिया सेल लाइनों के साइटोजेनेटिक लक्षण वर्णन पर लागू किया जा सकता है। गुणसूत्र संख्या में व्यापक जीनोमिक पुनर्व्यवस्था और परिवर्तन कोशिका रेखाओं की सामान्य विशेषताएं हैं 51,52. विभिन्न मच्छर कोशिका लाइनों 53,54में एन्यूप्लाइडी, पॉलीप्लाइडी, और गुणसूत्र पुनर्व्यवस्था जैसे ट्रांसलोकेशन, इनर्स्पर्स, विलोपन, विलोपनऔररिंग गुणसूत्रों का पता लगाया गया है। शास्त्रीय साइटोजेनेटिक अवलोकन 55 और भौतिक मानचित्रण 56 ने मलेरिया मच्छरों के विकास में पूरे हाथ के गुणसूत्र ट्रांसलोकेशन की घटना का प्रदर्शन किया है। इसलिए, प्रजातियों के बीच गुणसूत्र क्षेत्रों की होमोलॉजी की तुलना करने के लिए मछली प्रयोगों के साथ सूक्ष्मडिस्दाित सामग्री का उपयोग किया जा सकता है। हमने पूरे माउंट ओवेरियन नर्स कोशिकाओं में पॉलीटीन गुणसूत्रों पर 2आर-पेंटिंग जांच के साथ 3डी फिश को सफलतापूर्वक अंजाम दिया। इस विधि से गुणसूत्र प्रक्षेप पथों का पता लगाने और एनोफेल्समें परमाणु वास्तुकला का अध्ययन करने में मदद मिलेगी । डीएनए जेनोटीपिंग 57,58,अगली पीढ़ी के जीनोम अनुक्रमण 26,27,भौतिक और लिंकेज मानचित्र विकास, और गुणसूत्र पेंटिंग 33,59 के लिए जांच की उत्पादन जैसी तकनीकें सभी हाथ और क्षेत्र-विशिष्ट माइक्रोडिसेक्शन से लाभान्वित हो सकती हैं। एलसीएम प्रौद्योगिकी के संयोजन और एकल सेल WGA को आगे बढ़ाने के द्वारा, हम एक पॉलीटीन गुणसूत्र हाथ से डीएनए की उचित मात्रा के उत्पादन के लिए एक कुशल, व्यावहारिक विधि प्रदर्शित करते हैं ।

गुणसूत्र चित्रकला 1-5 कायोटाइप के विकास का अध्ययन करने और फ्लोरोसेंटली लेबल वाले क्रोमोसोमल डीएनए 1, 6-8 के संकरण के माध्यम से साइटोजेनेटिक असामान्यताओं की कल्पना करने के लिए एक उपयोगी तकनीक है। यह विधि विकास 9 और पैथोलॉजी 10में गुणसूत्र क्षेत्रों की 3डी गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए भी लागू की जाती है । अलग-अलग माइटोटिक 11, 12,मेयोटिक13, 14,या इंटरफेज नॉन-पॉलीटेन 15,16और पॉलीटीन 9,11, 17 क्रोमोसोम के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए अलग-अलग लेबल वाले गुणक पेंट का उपयोग किया जाता है। गुणसूत्र पेंट प्राप्त करने के लिए एक सरल और मजबूत प्रोटोकॉल मच्छरों जैसे गैर-मॉडल जीवों के लिए इस तकनीक के विस्तार में बहुत उपयोगी होगा। एनोफेल्स गैम्बिया परिसर सात रूपात्मक रूप से अविवेच्य मच्छरों का एक समूह है जो मलेरिया संचारित करने की क्षमता सहित व्यवहार और अनुकूलन में भिन्न होते हैं।  ये मच्छर बारीकी से संबंधित प्रजातियों के विकास को बेहतर ढंग से समझने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल के रूप में काम करते हैं जो उनकी वेक्टरल क्षमता में बहुत भिन्न होते हैं।  मलेरिया मच्छरों में अधिकांश साइटोजेनेटिक अध्ययन अच्छी तरह से विकसित, अत्यधिक पॉलीटेनाइज्ड गुणसूत्रों (18, 19में समीक्षा) का उपयोग करके किए गए हैं। पॉलीटेन गुणसूत्रों के पठनीय बैंडिंग पैटर्न ने शोधकर्ताओं को एनोफेल्स गैम्बिया 20में बहुरूपिक उलटा और पारिस्थितिक अनुकूलन के बीच संबंध प्रदर्शित करने की अनुमति दी। इसके अलावा, ऊतक-विशिष्ट 21 और प्रजातियों-विशिष्ट 3 डी पॉलीटीन गुणसूत्र संगठन की विशिष्ट 22 विशेषताएं एएन मैकलिपेनिस परिसर में विशेषता रही हैं। हालांकि, माइटोटिक गुणसूत्रों का अध्ययन अतिरिक्त महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकता है। उदाहरण के लिए, माइटोटिक गुणसूत्रों में मनाए गए हेट्रोक्रोमोमाटिन बहुरूपता का उच्च स्तर ए. गाम्बियाई 23में कम संभोग गतिविधि और प्रजनन क्षमता के साथ सहसंबद्ध किया गया है। पॉलीटेन और माइटोटिक गुणसूत्र हथियारों के यूक्रोमैटिक खंडों के बीच पत्राचार केवल उनके सापेक्ष लंबाई की तुलना करके स्थापित करना मुश्किल हो सकता है। इसका कारण यह है कि हेट्रोक्रोमैटिन माइटोटिक गुणसूत्रों का एक महत्वपूर्ण हिस्सा बनाता है, लेकिन पॉलीटीन गुणसूत्रों 24में कम प्रतिनिधित्व किया जाता है। मलेरिया मच्छरों के लिए गुणसूत्र पेंट की उपलब्धता शोधकर्ताओं को अतिरिक्त प्रजातियों को शामिल करके साइटोजेनेटिक अध्ययनों का काफी विस्तार करने की अनुमति देगी, जबकि महामारी विज्ञान के इस समूह में कायोयत्पिक विकास और गुणसूत्रों की 3डी गतिशीलता के विश्लेषण में लागत और समय को काफी कम कर देगा।
गुणसूत्रों के बड़े हिस्सों को प्राप्त करने के लिए, माइक्रोडिसेक्शन गुणसूत्र पूरक के हित के विशिष्ट क्षेत्रों में हेरफेर और अलग-थलग करने के लिए एक अभिन्न तकनीक बन गया है।  जब पूरे जीनोम प्रवर्धन (डब्ल्यूजीए) के साथ मिलकर, माइक्रोडिसेक्शन के परिणामस्वरूप मछली 11,12 और अगली पीढ़ी के जीनोम अनुक्रमण 25-27सहित शक्तिशाली डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोग होते हैं। पहले, तकनीक के लिए विशेष माइक्रोडिसेक्शन सुइयों के उपयोग की आवश्यकता होती थी जिसे एक अनुभवी उपयोगकर्ता द्वारा मैन्युअल रूप से नियंत्रित किया जाना था 28।  लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन (एलसीएम) की उन्नति के परिणामस्वरूप एक सरलीकृत उपकरण बेहतर रूप से एकल कोशिकाओं 29,30 या व्यक्तिगत गुणसूत्रों को अलग करने के लिए उपयुक्त है 31-33 प्रदूषण के कम जोखिम के साथ। यह दृष्टिकोण उपयोगकर्ता को एक आम सहमति परिदृश्य के बजाय, एकल कोशिकाओं में होने वाली आनुवंशिक विषमताओं और गुणसूत्र असामान्यताओं का अध्ययन करने की अनुमति देता है, जिसके परिणामस्वरूप कई कोशिकाओं को एक साथ 34-36से पूलिंग किया जाता है। माइक्रोडिसेक्शन से उत्पादित डीएनए को बढ़ाने के लिए कई तरीकों का उपयोग किया गया है।  डीओपी-पीसीआर, अत्यधिक दोहराव वाले दृश्यों के प्रवर्धन के लिए उपयोगी तकनीक, टिड्डी 37,स्पाइनी ईल 38और नील तिलपिया 39सहित प्रजातियों से माइक्रोडिसेक्टेड गुणसूत्रों को बढ़ाने के लिए उपयोग किया गया है।  हाल ही में, पीसीआर आधारित जीनोमप्लेक्स WGA4 सिंगल सेल किट और मल्टीपल विस्थापन प्रवर्धन आधारित (एमडीए) रिपली-जी सिंगल सेल किट एकल मानव कोशिकाओं के आनुवंशिक विश्लेषण के साथ-साथगुणसूत्रों 40-42के आनुवंशिक विश्लेषण से जुड़े प्रयोगों के लिए मूल्यवान उपकरण बन गए हैं, जिसमें टिड्डी 37 और टिड्डी 43में बी क्रोमोसोम सिस्टम शामिल हैं। इन दो किट प्रत्येक लाभ और नुकसान है, लेकिन अन्य उपलब्ध प्रवर्धन प्रणाली के ऊपर उनकी स्पष्ट श्रेष्ठता 44का प्रदर्शन किया गया है.
डीएनए की मात्रा जो एक गुणसूत्र या गुणसूत्र खंड से प्राप्त की जा सकती है, एक पूरे नाभिक की तुलना में काफी कम है। इसलिए माइक्रोडिसेक्शन, प्रवर्धन और एक गुणसूत्र का बाद में विश्लेषण कहीं अधिक चुनौतीपूर्ण है, विशेष रूप से ड्रोसोफिला या एनोफेल्सजैसे छोटे जीनोम वाले जीवों में।  यद्यपि पेंट को मानव 33 और एक ततैया 45के एकल माइक्रोडिसेक्टेड गुणसूत्रों से विकसित किया गया है, लेकिन एक सफल मछली प्रयोग के लिए फल फ्लाई 11के कई (कम से कम 10-15) माइक्रोडिसेक्टेड माइटोटिक गुणसूत्रों की आवश्यकता होती है। हालांकि, एक गुणसूत्र को माइक्रोडिसेक्ट और बढ़ाना करने की क्षमता (i) के लिए महत्वपूर्ण होगी, जो एक अलग गुणसूत्र से सामग्री के साथ संदूषण की संभावना को कम करती है, (ii) माइक्रोडिसेक्शन के लिए आवश्यक गुणसूत्र तैयारियों की संख्या को कम करती है, (iii) मछली और अनुक्रमण दोनों में माइक्रोडिसेक्टेड नमूने के न्यूक्लियोटाइड और संरचनात्मक बहुरूपता को कम करना। कई डिप्टरन प्रजातियों में पाए जाने वाले पॉलीटेन गुणसूत्र डीएनए की बहुत अधिक शुरुआती मात्रा प्राप्त करने का एक अनूठा अवसर प्रदान करते हैं। वे एक उच्च संकल्प और गुणसूत्र संरचना भी प्रदान करते हैं जिसे माइटोटिक गुणसूत्रों के उपयोग के माध्यम से प्राप्त नहीं किया जा सकता है। यह जोड़ा गया संकल्प क्रोमोसोमल पुनर्व्यवस्थाओं, क्रोमेटिन संरचना और क्रोमोसोमल खंडों को माइक्रोडिसेक्टेड 28,46होने की कल्पना करने में महत्वपूर्ण हो सकता है।
यहां हम एक एकल पॉलीटीन गुणसूत्र हाथ से एक यूक्रोमेटिक सेगमेंट को कुशलतापूर्वक अलग करने, डीएनए को बढ़ाने और मलेरिया मच्छरों में डाउनस्ट्रीम फिश अनुप्रयोगों में इसका उपयोग करने के लिए एक प्रक्रिया प्रस्तुत करते हैं।  सबसे पहले, हम विशेष रूप से तैयार झिल्ली स्लाइड से एक गुणसूत्र हाथ को अलग करने और निकालने के लिए एलसीएम लागू करते हैं। दूसरा, WGA का उपयोग माइक्रोडिसेक्टेड सामग्री से डीएनए को बढ़ाना है। तीसरा, हम मछली प्रयोगों में परिलक्षित डीएनए को पॉलीटेन स्क्वैश तैयारी 47,मेटाफेज और इंटरफेज गुणसूत्र स्लाइड 48,साथ ही 3 डी ओवेरियन पूरे माउंट नमूनों को संकरित करते हैं। यह प्रक्रिया एक गाम्बियाके गुणसूत्र हथियारों में अधिकांश यूक्रोमेटिन को सफलतापूर्वक पेंट करने के लिए की गई है ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="562">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">A491-212</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Methanol</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:120px;">A412-4</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Propionic acid&#160;</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">402907</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Membrane slides 1.0 PET</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;">415190-9051-000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Buffer tablets &#8220;GURR&#8221;</td>
			<td style="width:112px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">10582-013</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">KaryoMAX Giemsa Stain</td>
			<td style="width:112px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">10092-013</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">ThermoBrite Slide Denaturation/Hybridization System</td>
			<td style="width:112px;">Abbott Molecular</td>
			<td style="width:120px;">30-144110</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Vacufuge vacuum concentrator</td>
			<td style="width:112px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:120px;">22820001</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">Spectroline Microprocessor-Controlled UV Crosslinker XL-1000</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">11-992-89</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:59px;width:191px;">Thermo Scientific NanoDrop</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">ND-2000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">REPLI-g Single Cell Kit</td>
			<td style="width:112px;">Qiagen</td>
			<td style="width:120px;">150343</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:191px;">GenomePlex Single Cell Kit (WGA4)</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">WGA4-10RXN</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">GenomePlex WGA Reamplification Kit (WGA3)</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">WGA3-50RXN</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:191px;">MZ6 Leica stereomicroscope</td>
			<td style="width:112px;">Leica</td>
			<td style="width:120px;">VA-OM-E194-354</td>
			<td style="width:139px;">A different stereomicroscope can be used</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">Olympus CX41 Phase Microscope</td>
			<td style="width:112px;">Olympus</td>
			<td style="width:120px;">CX41RF-5</td>
			<td style="width:139px;">A different phase microscope can be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">PALM MicroBeam Laser Microdissection Microscope</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Thermomixer</td>
			<td style="width:112px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:120px;">22670000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">10x PBS</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:120px;">P5493</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">50x Denhardt&#8217;s solution</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">D2532</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">99% Formamide</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP227500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Dextran sulfate sodium salt</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td style="width:120px;">D8906</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">20x SSC buffer</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:120px;">AM9765</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">ProLong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:120px;">P-36931</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">dATP, dCTP, dGTP, dTTP</td>
			<td style="width:112px;">Fermentas</td>
			<td style="width:120px;">R0141, R0151, R0161, R0171</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Cy3-dUTP, Cy5-dUTP</td>
			<td style="width:112px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:120px;">PA53022, PA55022</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">BSA</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">A3294</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">DNA polymerase I</td>
			<td style="width:112px;">Fermentas</td>
			<td style="width:120px;">EP0041</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">DNase I&#160;</td>
			<td style="width:112px;">Fermentas</td>
			<td style="width:120px;">EN0521</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Spermine</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">S3256-1G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Spermidine</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">S0266-1G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP366-500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP3581</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">EGTA</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">E0396-25G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">PIPES</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">P6757-25G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">EDTA</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">S311-500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Digitonin</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">D141-100MG</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Triton-X100</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP151-100</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">AdhesiveCap 500 clear</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;">415190-9211-000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">QIAamp DNA Micro Kit (50)</td>
			<td style="width:112px;">Qiagen</td>
			<td style="width:120px;">56304</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Genomic DNA Clean and Concentrator Kit</td>
			<td style="width:112px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:120px;">D4010</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">37% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">F79-500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

2d and 3d chromosome painting in malaria mosquitoes

पूरे हाथ गुणसूत्र जांच के सीटू संकरण (मछली) में फ्लोरोसेंट ब्याज के जीनोमिक क्षेत्रों के मानचित्रण, गुणसूत्र पुनर्व्यवस्थाओं का पता लगाने, और कोशिका नाभिक में गुणसूत्रों के त्रि-आयामी (3 डी) संगठन का अध्ययन करने के लिए एक मजबूत तकनीक है। लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन (एलसीएम) और पूरे जीनोम प्रवर्धन (डब्ल्यूजीए) का आगमन एकल कोशिकाओं से बड़ी मात्रा में डीएनए प्राप्त करने की अनुमति देता है। WGA किट की बढ़ी हुई संवेदनशीलता ने हमें गुणसूत्र पेंट विकसित करने और गैर-मॉडल जीवों में गुणसूत्र संगठन और विकास की खोज के लिए उनका उपयोग करने के लिए प्रेरित किया। यहां, हम अफ्रीकी मलेरिया मच्छर एनोफेल्स गैम्बियाकी ओवेरियन नर्स कोशिकाओं से एकल पॉलीटीन गुणसूत्र हथियारों के यूक्रोमैटिक खंडों को अलग-थलग करने और बढ़ाने के लिए एक सरल विधि प्रस्तुत करते हैं। यह प्रक्रिया गुणसूत्र पेंट प्राप्त करने के लिए एक कुशल मंच प्रदान करती है, जबकि नमूने के लिए विदेशी डीएनए शुरू करने के समग्र जोखिम को कम करती है। WGA का उपयोग पुनः प्रवर्धन के कई दौर के लिए अनुमति देता है, जिसके परिणामस्वरूप डीएनए की उच्च मात्रा होती है जिसका उपयोग 2डी और 3डी मछली सहित कई प्रयोगों के लिए किया जा सकता है। हमने दिखा दिया कि विकसित गुणसूत्र पेंट का उपयोग एएन गाम्बियामें पॉलीटेन और मिटोटिक गुणसूत्र हथियारों के यूक्रोमैटिक भागों के बीच पत्राचार स्थापित करने के लिए सफलतापूर्वक किया जा सकता है । कुल मिलाकर, एलसीएम और एकल गुणसूत्र WGA का संघ भविष्य साइटोजेनेटिक और जीनोमिक अध्ययनों के लिए लक्ष्य डीएनए की महत्वपूर्ण मात्रा बनाने के लिए एक कुशल उपकरण प्रदान करता है।

चित्रा 1 इस लेख में वर्णित प्रोटोकॉल के समग्र प्रवाह-माध्यम का वर्णन करता है।  उपयोगकर्ता शुरू में झिल्ली स्लाइड से गुणसूत्र डीएनए नमूनों माइक्रोडिसेक्टिंग द्वारा शुरू होता है ।  माइक्रोडिसेक्टेड सामग्री निकाली जाती है और शुद्ध की जाती है। शुद्ध डीएनए तो परिलक्षित, फिर से परिलक्षित, लेबल, और फिर मछली के लिए इस्तेमाल किया गुणसूत्र फैलता लेबल है ।
एलसीएम प्रोटोकॉल को तीन समग्र चरणों में तोड़ा जा सकता है: 1) ब्याज के गुणसूत्रों को ढूंढना और इस क्षेत्र को काटने के लिए तैयार करना(चित्रा 2A),2) लेजर(चित्रा 2B) और 3)के माध्यम से ब्याज के गुणसूत्र क्षेत्र को काटने और गुलेल करना, और 3) यह निर्धारित करने के लिए जांच करना कि क्या नमूना वास्तव में चिपकने वाली टोपी(चित्रा 2C)में पहुंचाया गया है। 1 गैम्बिया सुआ स्ट्रेन पॉलीटीन क्रोमोसोम्स पर इस्तेमाल होने वाली एलसीएम की प्रक्रिया वीडियो 1 में दिखाई गई है। वीडियो प्रोग्राम स्टार्ट अप से पूरी प्रक्रिया का विवरण देता है, जिसमें महत्वपूर्ण सॉफ्टवेयर कार्य और सुझाव शामिल हैं।
इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले जीनोमप्लेक्स और रिपली-जी एकल सेल डब्ल्यूजीए किट उत्पाद आकार के साथ-साथ समग्र उपज में बहुत भिन्न होते हैं।  चित्रा 3 से पता चलता है कि जैल इलेक्ट्रोफोरेसिस के परिणाम जीनोमप्लेक्स और रिपली-जी किट के लिए भाग गए, साथ ही नैनोड्रॉप द्वारा नमूनों की मात्राकरण भी।
मछली जांच बनाने के लिए माइक्रोडिसेक्टेड सामग्री का उपयोग किया गया है जो गुणसूत्र के यू गुणसूत्र क्षेत्रों को लक्षित करता है।  चित्रा 4 एक गाम्बियाके पॉलीटीन गुणसूत्रों पर माइक्रोडिसेक्टेड सामग्री से उत्पन्न पांच जांचों की मछली को दर्शाता है ।  चार ऑटोसोमल हथियारों को WGA3 किट का उपयोग करके तीन फ्लोरोफोरस के साथ लेबल किया गया था: 3आर गुणसूत्र हरे रंग (फ्लोरोसीन) में लेबल किया गया है, 3L गुणसूत्र लाल (Cy-3) और पीले (Cy-5) के मिश्रण में है, 2R गुणसूत्र पीले (Cy-5) में है, और 2L गुणसूत्र लाल (Cy-3) में है। एक्स गुणसूत्र एक अलग प्रयोग में REPLI-जी सामग्री के निक अनुवाद का उपयोग कर नारंगी (Cy-3) में लेबल किया गया था । पॉलीटेन और माइटोटिक गुणसूत्र हथियारों के यूक्रोमैटिक भागों के बीच पत्राचार स्थापित करने के लिए, गुणसूत्र पेंट को इंटरफेज, प्रोफैसे, प्रोमेटाफेज और मेटाफेज क्रोमोसोम्स ऑफ ए गाम्बिया (चित्रा 5)के लिए संकरित किया गया है।  कोशिका नाभिक में एक पॉलीटीन गुणसूत्र हाथ के 3 डी संगठन की कल्पना करने के लिए, पूरे माउंट फिश को ए. गैम्बिया सुआ स्ट्रेन ओवेरियन नर्स कोशिकाओं (वीडियो 2) पर किया गया था।  अंतरप्राज(चित्रा 5D)और पॉलीटीन (वीडियो 2) गुणसूत्रों के साथ नाभिक में विशिष्ट गुणसूत्र हाथ क्षेत्रों को स्पष्ट रूप से देखा जाता है।
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig1.jpg"> चित्रा 1. गुणसूत्र पेंट की तैयारी की ओर प्रायोगिक प्रक्रियाओं का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig1highres.jpg" target="_blank">बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig2.jpg"> चित्रा 2। गुणसूत्र माइक्रोडिसेक्शन में प्रमुख कदम। ए) झिल्ली के माध्यम से ब्याज के गुणसूत्र क्षेत्र की लेजर सहायता प्राप्त काटने। ख) गुलेल के बाद एक छेद के साथ झिल्ली किया जाता है । ग) चिपकने वाली टोपी से जुड़े इसमें एक गुणसूत्र खंड के साथ झिल्ली के गुलेल टुकड़े का दृश्य । यह तीर एक्स क्रोमोसोम के हेट्रोक्रोमेटिन को इंगित करता है जो स्लाइड पर बना हुआ था। तारक एक और गुणसूत्र का एक टुकड़ा दिखाता है जो स्लाइड पर बना रहा । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig2highres.jpg" target="_blank">बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig3.jpg"> चित्र 3। Agarose जेल छवियों WGA के बाद डीएनए दिखा । ए) WGA4 और WGA3 जीनोमप्लेक्स किट का उपयोग करने के बाद हाथ 3R से कम आणविक वजन (200-500 बीपी) डीएनए । B) रिपली-जी प्रवर्धन के बाद आर्म 2L से उच्च आणविक वजन (10-20 केबी) डीएनए। 100 बीपी सीढ़ी बाईं गलियों में दिखाई गई है। जेल छवियों के नीचे टेबल नैनोड्रॉप द्वारा मापा डीएनए सांद्रता दिखाते हैं । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig3highres.jpg" target="_blank">बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig4.jpg"> चित्र 4. माइक्रोडिसेक्टेड सामग्री से उत्पन्न चार जांचों का उपयोग करके ए. गैम्बिया की ओवेरियन नर्स कोशिकाओं से पॉलीटीन गुणसूत्रों की चित्रकारी। एक्स गुणसूत्र को नारंगी (Cy-3) में REPLI-g सामग्री के निक-अनुवाद द्वारा लेबल किया गया है। 2आर आर्म पीले रंग (Cy-5) में लेबल किया गया है; 2L हाथ लाल (Cy-3) में है; 3R हाथ हरे रंग में लेबल है (फ्लोरोसेइन); 3L हाथ लाल (Cy-3) और पीले (Cy-5) के मिश्रण में लेबल है। ऑटोसोम्स को WGA3 प्रवर्धन किट के साथ लेबल किया गया है। क्रोमेटिन नीले रंग (DAPI) में दाग है। क्रोमोसोम नाम टेलोमेरिक क्षेत्रों के पास रखे जाते हैं। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig4highres.jpg" target="_blank">बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig5.jpg"> चित्रा 5। WGA3 द्वारा लेबल किए गए माइक्रोडिसेक्टेड सामग्री से उत्पन्न तीन जांचों का उपयोग करके ए. गाम्बिया मोप्ती तनाव के लार्वा कल्पित डिस्क से इंटरफेज (ए), प्रोफैसे (बी), प्रोमेटाफेज (सी) और मेटाफेज (डी) गुणसूत्रों की पेंटिंग। 2आर आर्म हरे रंग (फ्लोरोसीइन) में लेबल किया गया है; 2L हाथ अवेलेबल है; 3R हाथ गुलाबी रंग में है, लाल (Cy-3) और नारंगी (Cy-5) का मिश्रण; 3L हाथ नारंगी (Cy-5) में लेबल है। एक्स गुणसूत्र में 18S rDNA जांच के अनुरूप एक लाल लेबल है। क्रोमेटिन नीले रंग (DAPI) में दाग है। गुणसूत्रों के चमकीले दाग वाले क्षेत्र हेट्रोक्रोमोटिन के अनुरूप होते हैं। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig5highres.jpg" target="_blank">बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
वीडियो 1. एएन गाम्बिया पॉलीटीन गुणसूत्रों की एलसीएम की प्रक्रिया। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/Sharakhov_video1.mp4" target="_blank">वीडियो 1 देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
वीडियो 2. पूरे माउंट 3 डी मछली एक gambiae अंडाशय नर्स कोशिकाओं पर प्रदर्शन किया । जांच Cy-3 में लेबल है (नीले रंग में चित्रित) और एक माइक्रोडिसेक्टेड 2R गुणसूत्र हाथ से किया गया था ।  क्रोमेटिन को डीएपीआई से दाग दिया गया था और इसे सियान छद्म रंग (हल्के नीले) द्वारा चित्रित किया गया है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/Video2.avi" target="_blank">वीडियो 2 देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>

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2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

गुणसूत्र चित्रकला कोशिका नाभिक और karyotype के विकास के संगठन का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी विधि है। यहां, हम एकल पॉलीटीन गुणसूत्रों से ब्याज के विशिष्ट क्षेत्रों को अलग और बढ़ाने के लिए एक दृष्टिकोण प्रदर्शित करते हैं जो बाद में सीटू संकरण (मछली) में दो और त्रि-आयामी फ्लोरोसेंट के लिए उपयोग किए जाते हैं।

मलेरिया मच्छरों में 2डी और 3डी गुणसूत्र पेंटिंग

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

डीएनए निष्कर्षण के लिए एक सरल Chelex से प्रोटोकॉल<em&gt; एनोफ़ेलीज़</em&gt; एसपीपी.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes. Investigation of transcripts and gene regulators that are expressed in tissues in which the mosquito host and pathogen interact, and in organs involved in reproduction are of great interest for strategies to reduce mosquito-borne disease transmission and disrupt egg development. A number of tools have been employed to study and validate the temporal and tissue-specific regulation of gene expression. Here, we describe protocols that have been developed to obtain spatial information, which enhances our understanding of where specific genes are expressed and their products accumulate. The protocol described has been used to validate expression and determine accumulation patterns of transcripts in tissues related to mosquito-borne pathogen transmission, such as female salivary glands, as well as subcellular compartments of ovaries and embryos, which relate to mosquito reproduction and development. 
 The following procedures represent an optimized methodology that improves the efficiency of various steps in the protocol without loss of target-specific hybridization signals. Guidelines for RNA probe preparation, dissection of soft tissues and the general procedure for fixation and hybridization are described in Part A, while steps specific for the collection, fixation, pre-hybridization and hybridization of mosquito embryos are detailed in Part B.

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Temporal and spatial gene expression analyses have a crucial role in functional genomics. Whole-mount hybridization in situ is useful for determining the localization of transcripts within tissues and subcellular compartments. Here we outline a hybridization in situ protocol with modifications for specific target tissues in mosquitoes.

संकरण<em&gt; बगल में</em&gt; लार ग्रंथियों, अंडाशय, और वेक्टर मच्छरों की भ्रूण की

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. One important application of this method is the development of high-quality physical maps useful for improving the genome assemblies for various organisms. The natural banding pattern of polytene and mitotic chromosomes provides guidance for the precise ordering and orientation of the genomic supercontigs. Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, a well-established chromosome-based mapping technique has been developed only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes 1. As a result of genome mapping efforts, 88% of the An. gambiae genome has been placed to precise chromosome positions 2,3 . Two other mosquito genera, Aedes and Culex, have poorly polytenized chromosomes because of significant overrepresentation of transposable elements in their genomes 4, 5, 6. Only 31 and 9% of the genomic supercontings have been assigned without order or orientation to chromosomes of Ae. aegypti 7 and Cx. quinquefasciatus 8, respectively. Mitotic chromosome preparation for these two species had previously been limited to brain ganglia and cell lines. However, chromosome slides prepared from the brain ganglia of mosquitoes usually contain low numbers of metaphase plates 9. Also, although a FISH technique has been developed for mitotic chromosomes from a cell line of Ae. aegypti 10, the accumulation of multiple chromosomal rearrangements in cell line chromosomes 11 makes them useless for genome mapping. Here we describe a simple, robust technique for obtaining high-quality mitotic chromosome preparations from imaginal discs (IDs) of 4th instar larvae which can be used for all three genera of mosquitoes. A standard FISH protocol 12 is optimized for using BAC clones of genomic DNA as a probe on mitotic chromosomes of Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus, and for utilizing an intergenic spacer (IGS) region of ribosomal DNA (rDNA) as a probe on An. gambiae chromosomes. In addition to physical mapping, the developed technique can be applied to population cytogenetics and chromosome taxonomy/systematics of mosquitoes and other insect groups.

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, physical genome mapping techniques were established only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes. For the genera of Aedes and Culex, however, cytogenetic mapping remains challenging because of the poor quality of polytene chromosomes. Here we present a universal protocol for obtaining high-quality preparations of mitotic chromosomes and an optimized FISH protocol for all three genera of mosquitoes.

प्रतिदीप्ति<em&gt; स्वस्थानी में</emमच्छरों की mitotic गुणसूत्रों पर संकरण

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency and type of chromosome aberrations in different cell types allows defects in DNA repair pathways to be elucidated. Understanding mammalian DNA repair biology has been greatly helped by the production of mice with knockouts in specific genes. The goal of this protocol is to quantify genomic instability in mouse B lymphocytes. Labeling of the telomeres using PNA-FISH probes (peptide nucleic acid - fluorescent in situ hybridization) facilitates the rapid analysis of genomic instability in metaphase chromosome spreads. B cells have specific advantages relative to fibroblasts, because they have normal ploidy and a higher mitotic index. Short-term culture of B cells therefore enables precise measurement of genomic instability in a primary cell population which is likely to have fewer secondary genetic mutations than what is typically found in transformed fibroblasts or patient cell lines.

DNA repair pathways are essential for maintenance of genomic integrity and preventing mutation and cancer. The goal of this protocol is to quantify genomic instability by direct observation of chromosome aberrations in metaphase spreads from mouse B cells using fluorescent in situ hybridization (FISH) for telomeric DNA repeats.

PNA मछली द्वारा माउस बी लिम्फोसाइटों में क्रोमोजोम aberrations के तेजी से विश्लेषण

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria

Despite decades of eradication efforts, malaria remains a global burden. Recent renewed interest in regional elimination and global eradication has been accompanied by increased genomic information about Plasmodium parasite species responsible for malaria, including characteristics of geographical populations as well as variations associated with reduced susceptibility to anti-malarial drugs.
One common genetic variation, single-nucleotide polymorphisms (SNPs), offers attractive targets for parasite genotyping. These markers are useful not only for tracking drug resistance markers but also for tracking parasite populations using markers not under drug or other selective pressures.
SNP genotyping methods offer the ability to track drug resistance as well as to fingerprint individual parasites for population surveillance, particularly in response to malaria control efforts in regions nearing elimination status.
While informative SNPs have been identified that are agnostic to specific genotyping technologies, high-resolution melting (HRM) analysis is particularly suited to field-based studies. Compared to standard fluorescent-probe based methods that require individual SNPs in a single labeled probe and offer at best 10% sensitivity to detect SNPs in samples that contain multiple genomes (polygenomic), HRM offers 2-5% sensitivity. Modifications to HRM, such as blocked probes and asymmetric primer concentrations as well as optimization of amplification annealing temperatures to bias PCR towards amplification of the minor allele, further increase the sensitivity of HRM. While the sensitivity improvement depends on the specific assay, we have increased detection sensitivities to less than 1% of the minor allele.
In regions approaching malaria eradication, early detection of emerging or imported drug resistance is essential for prompt response. Similarly, the ability to detect polygenomic infections and differentiate imported parasite types from cryptic local reservoirs can inform control programs.
This manuscript describes modifications to high resolution melting technology that further increase its sensitivity to identify polygenomic infections in patient samples.

While high resolution melting analysis offers the ability to differentiate between single nucleotide polymorphisms in a heterogeneous population, mutant allele amplification bias can increase its ability to detect alleles present at relatively low percentages within a sample. This protocol describes improvements that improve the sensitivity of high resolution melting analysis.

तरीके मलेरिया में एकल nucleotide बहुरूपता जीनोटाइपिंग पिघलती उच्च संकल्प की संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए

Despite decades of eradication efforts, malaria remains a global burden. Recent renewed interest in regional elimination and global eradication has been ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

एक<em&gt; इन विट्रो</em&gt; एचआईवी सह-संक्रमण के संदर्भ में मलेरिया के लिए इम्यून प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए मॉडल

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible for most malaria-related deaths globally. Several factors including parasite sequestration in tissues, vascular dysfunction, and inflammatory responses influence the evolution of the disease in malaria-infected people. P. falciparum-infected red blood cells (iRBCs) release small extracellular vesicles (EVs) containing different kinds of cargo molecules that mediate pathogenesis and cellular communication between parasites and host. EVs are efficiently taken up by cells in which they modulate their function. Here we discuss strategies to address the role of EVs in parasite-host interactions. First, we describe a straightforward method for labeling and tracking EV internalization by endothelial cells, using a green cell linker dye. Second, we report a simple way to measure permeability across an endothelial cell monolayer by using a fluorescently labeled dextran. Finally, we show how to investigate the role of small non-coding RNA molecules in endothelial cell function.

In this work, we describe protocols to investigate the role of extracellular vesicles (EVs) released by Plasmodium falciparum infected erythrocytes. In particular, we focus on the interactions of EVs with endothelial cells.

मलेरिया संक्रमण के दौरान Extracellular पुटिका समारोह का मूल्यांकन

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines and/or antivirals have underscored the urgent need to develop ZIKV reverse genetic systems to facilitate the study of ZIKV biology and the development of therapeutic and/or prophylactic approaches. However, like with other flaviviruses, the generation of ZIKV full-length infectious cDNA clones has been hampered due to the toxicity of viral sequences during its amplification in bacteria. To overcome this problem, we have developed a nontraditional approach based on the use of bacterial artificial chromosomes (BACs). Using this approach, the full-length cDNA copy of the ZIKV strain Rio Grande do Norte Natal (ZIKV-RGN) is generated from four synthetic DNA fragments and assembled into the single-copy pBeloBAC11 plasmid under the control of the human cytomegalovirus (CMV) immediate-early promoter. The assembled BAC cDNA clone is stable during propagation in bacteria, and infectious recombinant (r)ZIKV is recovered in Vero cells after transfection of the BAC cDNA clone. The protocol described here provides a powerful technique for the generation of infectious clones of flaviviruses, including ZIKV, and other positive-strand RNA viruses, particularly those with large genomes that have stability problems during bacterial&#160;propagation.

The recent epidemic of Zika virus highlights the importance of establishing reverse genetic approaches to develop vaccines and/or therapeutic strategies. Here, we describe the protocol to rescue an infectious recombinant Zika virus from a full-length cDNA clone assembled in a bacterial artificial chromosome under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter.

एक जीवाणु कृत्रिम क्रोमोसोम CDNA क्लोन से रिकॉमबिनेंट जिका वायरस का बचाव

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

वेक्टर क्षमता जीका वायरस का उपयोग कर एडीज एजिप्टी मच्छरों पर विश्लेषण

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of disease cases each year. E. aedis causes mortality and reduced reproductive fitness in the mosquito vector and has been explored for its potential as a biocontrol agent. The protocol we present for culturing E. aedis is based on its natural infection cycle, which involves both horizontal and vertical transmission at different life stages of the mosquito host. Ae. aegypti mosquitoes are exposed to spores in the larval stage. These infected larvae then mature into adults and transmit the parasite vertically to their offspring. Infected offspring are then used as a source of spores for future horizontal transmission. Culturing E. aedis can be challenging to the uninitiated given the complexities of the parasite&#8217;s life cycle, and this protocol provides detailed guidance and visual aids for clarification.

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

A protocol to culture the microsporidian parasite Edhazardia aedis. The parasite is passaged from one generation of Aedes aegypti mosquitoes to the next via horizontal transfer at the larval stage followed by vertical transmission at the adult stage. Live sporoplasms survive long-term in infected eggs.

एडीज एजिप्टी मच्छरों में माइक्रोस्पोरिडियन परजीवी एडहजारडिया एडीआईएस का प्रचार

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of ...