Name: 2d and 3d chromosome painting in malaria mosquitoes
Uploaded: 2014-01-06T17:30:00
Duration: 9 min 57 s
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이 작품은 이고르 V. 샤라호프에 국립 보건 원 1R21AI094289에서 보조금에 의해 지원되었다

1) 레이저 포획 미세 절에 대한 폴리텐 염색체 슬라이드 준비
<ol><li>25 시간 후 혈액 먹이에서 반 중력 Anopheles 여성을 해부. 난소를 약 5마리의 암컷에서 500μl으로 수정하여 24시간 동안 실온에서 신선한 변형 카노이용(100% 메탄올: 빙하 아세트산, 3:1)으로 수정합니다. 장기 저장을 위해 난소를 -20°C로 옮깁니다.</li>
	<li>염색체 슬라이드를 만들기 직전에 Carnoy의 용액 (100 % 에탄올 : 빙하 아세트산, 3 :1) 및 50 % 프로피오닉 산을 준비하십시오.</li>
	<li>자이스 1.0 PET 멤브레인 슬라이드에 카노이의 용액 한 방울에 난소 한 쌍을 놓습니다. 크기에 따라 난소를 해부 바늘로 약 2-4 부분으로 분할하고 해부 현미경의 밑에 깨끗한 슬라이드에 50% 프로피온산을 떨어뜨립니다.</li>
	<li>여포를 분리하고 해부 스테레오 현미경의 밑에 종이 타월을 사용하여 남은 조직을 제거하십시오. 여포에 50%의 프로피온산을 새로 넣고 실온에서 3-5분 동안 앉을 수 있도록 합니다.</li>
	<li>실리콘 커버슬립을 물방울 위에 놓습니다. 슬라이드를 약 1분 동안 방치하십시오.</li>
	<li>흡수성 재료로 슬라이드를 덮고(필터 용지는 이 방법에 사용됨) 연필의 지우개 면을 사용하는 동안 지우개로 반복적으로 눌러 커버슬립에 넉넉한 양의 압력을 가합니다.</li>
	<li>슬라이드 를 60°C로 가열하여 슬라이드 데노션/혼성화 시스템에서 15-20분 동안 가열하여 폴리텐 염색체를 평평하게 합니다. 산이 염색체를 더 평평하게 할 수 있도록 밤새 4 °C의 습한 챔버에 슬라이드를 놓습니다.</li>
	<li>슬라이드를 차가운 50% 에탄올에 10분 동안 놓습니다. 커버슬립을 부드럽게 제거하고, 차가운 50% 에탄올로 10분 이상 교체합니다.</li>
	<li>탈수 슬라이드는 각각 70%, 90%, 100% 에탄올을 5분 동안 미끄러. 공기 건조 슬라이드.</li>
	<li>단일 버퍼 태블릿을 증류수 1L에 추가하여 GURR 버퍼 솔루션 의 솔루션을 준비합니다. 오토 클레이 브.</li>
	<li>Giemsa 염색 용액 1ml를 GURR 버퍼 50ml에 추가하여 지임사 용액을 준비합니다.</li>
	<li>기임사 용액에 공기 건조 슬라이드를 10분 동안 놓고 1X PBS로 3회 세척합니다. 오염을 피하기 위해 제어된 멸균 기후에서 공기 건조가 다시 미끄러지게 됩니다.</li>
</ol>2) 레이저 캡처 단일 폴리텐 염색체 암의 미세 절
이 섹션에서는 PALM MicroBeam 레이저 미세 절제 시스템과 함께 제공되는 PALMRobo 소프트웨어의 사용을 자세히 설명합니다. 
<ol><li>100 % 에탄올로 현미경을 청소하십시오. UV 크로스링커에 자외선으로 장갑과 튜브를 살균합니다.</li>
	<li>PALM MicroBeam 레이저 미세 절 현미경을 전원을 공급하고 레이저를 켭니다. 레이저 해부 제품군인 PALMRobo를 열고 필요에 따라 "전원" 및 "포커스" 설정을 구성합니다.</li>
	<li>관심의 폴리텐 염색체 팔을 검색합니다.</li>
	<li>"연필" 도구를 사용하여 선택한 영역의 윤곽을 그립니다.</li>
	<li>메뉴 모음에서 "요소 창"을 엽니다.</li>
	<li>"그려진 요소"를 선택하여 "잘라내기"를 선택했습니까?</li>
	<li>접착제 캡 튜브를 홀더에 설치하고 슬라이드 위에 배치하여 작은 간격< 크기 < 레이저 컷을 시작합니다.</li>
	<li>잘라내기 부위 내에 "투석기 선택"을 배치하여 가장자리와 염색체 사이에 공간을 남깁니다.</li>
	<li>드롭다운 옵션에서 "LPC"를 선택하고 발사를 시작합니다.</li>
	<li>"눈" 아이콘을 눌러 샘플이 캡으로 발사되었는지 확인합니다.</li>
</ol>3) 단일 미세 한 제다색 염색체 팔에서 DNA의 정제
QIAamp DNA 마이크로 키트의 지시에 따라 수집된 DNA를 방출하고 정화합니다. 3.1 단계는 반전 된 튜브를 수용하기 위해 수정되었습니다. 
<ol><li>15 μl 버퍼 ATL과 10 μl 단백질Ae K를 반전 된 튜브 (캡 내부)에 넣고 3 시간 동안 56 °C에서 배양하십시오.</li>
	<li>25 μl 버퍼 ATL, 50 μl 버퍼 AL 및 1 μl 캐리어 RNA를 추가; 혼합. 50 μl 100 % EtOH를 추가하십시오. 섞다.</li>
	<li>리세이트를 QIAamp 열로 전송; 원심 분리기. 500 μl 버퍼 AW1을 추가하여 세척; 원심 분리기. 열을 새 수집 튜브에 넣고 500 μl 버퍼 AW2를 추가합니다. 원심 분리기. 열을 새 튜브에 넣습니다. 원심 분리기는 과도한 액체를 제거합니다.</li>
	<li>컬럼을 1.5 μl 마이크로센심분리기 튜브에 넣고 20 μl의 물을 엘루트에 넣습니다. 원심 분리기.</li>
	<li>진공분리기를 사용하여 갓 발동된 DNA를 9 μl의 최종 부피로 증발시다.</li>
</ol>4) 단일 미세 한 다분색 염색체 팔에서 DNA의 증폭
단일 염색체 암의 WGA에 두 개의 서로 다른 프로토콜이 사용되었습니다. 
<ol><li>게놈플렉스 WGA를 통한 DNA 증폭 및 프로브 제제<ol>
<li>게놈플렉스 단일 세포 WGA4 키트 프로토콜을 따라 증폭된 DNA의 첫 번째 배치를 생성합니다.<ol>
<li>9 μl 샘플에 갓 준비된 Proteinase K 용액을 추가합니다. 혼합. 1 시간 동안 50 °C에서 DNA를 인큐베이션 한 다음 4 분 동안 99 °C로 가열합니다. 얼음을 유지합니다.</li>
			<li>2 μl 1X 단일 셀 라이브러리 준비 버퍼 및 라이브러리 안정화 솔루션의 1 μl을 추가; 혼합. 2 분 동안 95 °C로 샘플을 가열합니다. 얼음과 원심분리기를 식힙니다.</li>
			<li>도서관 준비 효소 의 1 μl을 추가; 혼합 및 원심 분리기. 다음과 같이 인큐베이터: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq1.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
			<li>7.5 μl 10X 증폭 마스터 믹스, 48.5 μl 물을 추가합니다. 5.0 μl WGA DNA 폴리머라제; 혼합 및 원심 분리기.</li>
			<li>다음과 같이 열주기: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq2.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
		</ol>
</li>
		<li>유전체 DNA 클린 및 농축기 키트를 사용하여 DNA를 정화합니다. 프로토콜은 다음과 같습니다.<ol>
<li>추가 5:1 DNA 바인딩 버퍼: DNA 샘플 (특히 2 kb 미만의 게놈 DNA용. 샘플 DNA가 2kb보다 큰 경우 2:1 비율을 사용하고 제공된 스핀 컬럼으로 옮김합니다. 원심 분리기.</li>
			<li>200 μl DNA 세척 버퍼와 원심분리기를 추가합니다. 반복 세척 단계. 그런 다음 50 μl의 물을 추가하고 DNA를 새로운 1.5 ml 튜브에 넣습니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>다음과 같이 GenomePlex WGA3 증폭 키트를 사용하여 샘플 DNA를 다시 증폭시하십시오.<ol>
<li>PCR 튜브에 10 μl DNA를 추가 (키트는 DNA의 10 ng 총을 권장) 49.5 μl 물, 7.5 μl 10x 증폭 마스터 믹스, 3.0 μl 10 mMM DNTP 믹스, 5.0 μl WGA DNA 폴리머 라제. 혼합 및 원심분리기.</li>
			<li>반응에 대해 다음 프로필을 사용합니다. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq3.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
			<li>-20°C에 DNA를 저장합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>다음과 같이 게놈플렉스 WGA3 증폭 키트를 사용하여 물고기에 대한 라벨 DNA:<ol>
<li>49.5 μl 물로 PCR 튜브에 10 μl DNA를 추가하여 GenomePlex WGA3 리앰프 키트에서 마스터 믹스를 만들고, 7.5 μl 10X 증폭 마스터 믹스, 3.0 μl 1 mM dNTP 믹스 (1 mM dATP, dCTP, dGTP, 0.3 μl 1 mM dTTP - 라벨이 붙은 dUTP를 사용하는 경우), 25 nM 라벨 dUTP의 1 μl , 및 5.0 μl WGA DNA 폴리머라제.</li>
			<li>반응에 대해 다음 프로필을 사용합니다. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq3.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
			<li>에탄올은 3M 아세테이트 pH 5.2 및 100% 에탄올의 2-3부피의 최종 반응 부피(75 μl 반응에 대한 7.5 μl)를 1/10을 추가하여 표지된 프로브를 침전시한다. 적어도 30 분 동안 -80 °C에서 DNA 샘플을 냉각하십시오.</li>
			<li>4°C에서 10분 동안 원심분리기 샘플을 시료하여 라벨이 부착된 펠릿을 만들고 상설 및 공기 건조 펠릿을 제거합니다.</li>
			<li>다음과 같이 하이브리드화 버퍼 만들기: 0.2 g 도스네 황산염 1200 μl 디온화 폼아미드 580 μl H2O 120 μl 20X SSC</li>
			<li>40 μl의 혼성화 버퍼를 공기 건조 펠릿에 추가합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>REPLI-G 단일 세포 WGA를 통한 DNA 증폭 및 프로브 제제 및 닉 번역<ol>
<li>증폭된 DNA를 생성하기 위하여 REPLI-g 단하나 세포 WGA 키트 프로토콜을 따르십시오:<ol>
<li>버퍼 D2(1M DTT의 3μl + 33 μl 버퍼 DLB)를 준비합니다.</li>
			<li>정제된 미세 한 정제 물질의 4 μl을 3 μl 버퍼 D2와 혼합합니다. 혼합 플릭 튜브. 65 °C에서 10 분 동안 배양하십시오. 정지 용액의 3 μl을 추가합니다. 섞다.</li>
			<li>9 μl H2O, 29 μl REPLI-g 반응 버퍼, 및 2 μl의 REPLI-g DNA 폴리머라제를 샘플에 추가합니다. 30°C에서 8시간 동안 배양합니다. 3 분 동안 65 °C로 가열하여 DNA 폴리머라아제비활성화. -20°C에 DNA를 저장합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>REPLI-g 증폭 DNA를 레이블닉 번역 프로토콜을 따르십시오.<ol>
<li>다음 라벨링 믹스를 준비합니다. 증폭된 DNA 1μg 5 μl 10X DNA 폴리머라제 버퍼 5 μl 10X dNTP 5 μl 1X BSA 1 μl 1 mM 라벨 dNTP 4 μl 1 U/μl DNase I 1 μl 10 U/μl DNA 폴리머라제 I H2O ~ 50 μl</li>
			<li>2 시간 동안 15 °C에서 배양하십시오. 반응을 멈추려면 0.5 M EDTA의 2 μl을 추가합니다. 젤에서 실행하여 DNA 조각 크기를 확인합니다.</li>
			<li>4.1.4.3-4.1.4.6에서 단계 수행하여 펠릿을 침전시키고 용해합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>5) 폴리텐과 미토성 염색체 스쿼시 제제에 2D FISH
폴리텐 스쿼시 (47)와 미토성 염색체 슬라이드 (48)의준비에 FISH에 대한 자세한 프로토콜을 참조하십시오. 여기서 우리는 간단한 프로토콜을 제공합니다.
<ol><li>폴리텐 염색체 스쿼시 제제에 물고기<ol>
<li>1X PBS에서 20분 동안 1X PBS로 슬라이드를 1분 동안 1X PBS로 4% 파라포름알데히드로 슬라이드합니다.</li>
		<li>탈수 슬라이드는 에탄올 세초를 통해 슬라이드 : RT. 공기 건조 슬라이드에서 각각 50 %, 70 %, 90 %, 100 % 100 %</li>
		<li>37°C에서 혼성화 버퍼에서 프로브를 예열합니다. 10-20 μl의 프로브를 추가하여 슬라이드합니다. 커버 22 X 22 mm 커버 슬립. 파이펫 팁을 사용하여 기포를 누릅니다.</li>
		<li>10 분 동안 90 °C에서 염색체 및 프로브를 변성합니다. 고무 시멘트로 커버슬립의 가장자리를 밀봉합니다. 슬라이드를 습한 챔버로 옮기고 하룻밤 사이에 39°C에서 배양합니다.</li>
		<li>슬라이드를 39°C에서 1X SSC로 20분 동안 세척합니다. 20 분 동안 RT에서 1X SSC로 슬라이드를 씻으십시오. 1X PBS에서 슬라이드를 헹구고 DAPI로 페이드 방지 연장을 추가합니다. 커버슬립으로 덮고, 시각화 전에 적어도 한 시간 동안 4°C의 슬라이드 박스에 보관하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>미토성 염색체 스쿼시 제제에 대한 물고기<ol>
<li>안감비아의4번째 인스타 애벌레의 상상디스크로부터 미토성 염색체를 추출한다.</li>
		<li>FISH에 적합한 염색체 슬라이드를 준비합니다.</li>
		<li>라벨이 부착된 DNA 프로브의 2-3 μl을 튜브의 혼성화 버퍼에 넣고 파이펫팅하여 부드럽게 섞습니다.</li>
		<li>프로브 혼합물의 10 μl을 슬라이드에 바르고 22 X 22mm 커버슬립으로 덮습니다. 파이펫 팁을 사용하여 기포를 누릅니다.</li>
		<li>카운터스테인링 및 검출을 위해 DAPI를 사용하여 페이드 방지 연장을 준비에 적용하고 시각화하기 전에 적어도 한 시간 동안 어둡게 유지하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6) 전체 마운트 난소 조직에 3D 물고기
<ol><li>다음 버퍼 A 믹스를 준비합니다. 60mM KCl 15 mM NaCl 0.5 mM 스미디딘 0.15 mM 스퍼마인 2mM EDTA 0.5 mM EGTA 15m 파이프</li>
	<li>커버립의 크기에 맞게 정사각형 패턴에 매니큐어 레이어를 추가하여 핵 시각화슬라이드를 준비합니다. 이것은 미래에 커버 슬립에 배치 할 때 핵의 분쇄를 방지하기 위해 제기 표면을 만듭니다.</li>
	<li>크리스토퍼의 단계 3 여성에서 신선한 난소를 해부하고 0.5 %의 디지토닌150-250 μl 버퍼 A의 용액에 보관하십시오. 여포 보다 더 큰 해부 바늘을 실행 (0.5% digitonin와 버퍼 A튜브에서) 여포 막을 파괴하기 위해.</li>
	<li>5-10 분 동안 소용돌이가 여포를 더 방해합니다. 분당 ~500회전(RPM)의 가장 낮은 설정에서 30초 동안 큰 여포 조각과 원심분리기 튜브를 긁어냅니다. 새로운 2ml Eppendorf 튜브로 상체를 옮기고, 가시 조직이 작은 입자로 나눌 때까지 버퍼 A. 반복 단계 6.3의 100 μl을 5-7배 사이 추가합니다.</li>
	<li>2,000 RPM에서 두 튜브를 10분 동안 회전합니다. 두 튜브 모두에서 상수폐기. 참고: 두 튜브 모두 최종 핵 시각화 슬라이드를 만드는 데 사용됩니다. 수집된 상체관을 가진 관은 주로 추출한 핵을 포함해야 하며, 조직을 가진 원래 튜브는 간호사 세포에 내장된 조직과 핵의 혼합물을 포함할 것이다. 버퍼 A의 200 μl을 추가 – 0.1% 트리톤과 4 °C에서 하룻밤 배양. 원심분리기는 10,000 RPM(10,621 x G)에서 5분 동안 상주분리기를 제거합니다.</li>
	<li>PBS에 200 μl 4% 파라포름알데히드를 추가합니다. 450 RPM에서 혼합, 30 분 동안 열믹서에서 인큐베이션. 원심분리기는 5,000RPM(2,655 x G)에서 5분 동안 상설을 제거하고 상류부를 제거합니다. 버퍼 A로 0.1% 트리톤으로 5분 동안 세척하고, 써모믹서의 450 RPM에서 혼합합니다. 원심분리기는 5,000RPM(2,655G)에서 5분 동안 상복부를 제거합니다.</li>
	<li>튜브에 37°C 표지 프로브에서 미리 따뜻하게 추가합니다. 열믹서에서 95°C에서 450 RPM에서 10분 동안 혼합합니다. 계속 혼합으로 15 분 동안 80 °C에서 계속 데칭하십시오. 써모믹서에서 37°C에서 배양하고 하룻밤 사이에 450 RPM이 혼합됩니다. 원심분리기 5분 5분 5분 5,000 RPM(2,655 x G). 상부체를 제거합니다.</li>
	<li>버퍼 A로 5분 동안 0.1% 트리톤으로 세척합니다. 원심분리기 5분 5분 5분 5,000 RPM(2,655 x G). 2번 반복합니다. DAPI로 장간 페이드 방지 한 방울을 적용합니다.</li>
	<li>핵/DAPI 용액을 조심스럽게 피펫(거품 을 피하고), 슬라이드에 바르고 커버슬립으로 덮습니다.</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

미세 한 차분 폴리텐 염색체 샘플에서 DNA를 성공적으로 증폭하는 데 중요한 여러 단계가 있습니다. 이 프로토콜은 전체 적인 효율성을 높이고 시료와의 물리적 도구의 상호 작용을 제거하여 외국 DNA에 대한 노출을 줄이는 방법인 LCM의 사용을 사용합니다. 그러나, 외국 DNA의 증폭은 아직도 이 실험의 가장 중대한 잠재적인 함정입니다. 따라서 전체 공정 중에 오염으로부터 샘플을 보호하는 것이 필수적입니다. 슬라이드 준비 및 미세 절단계 전반에 걸쳐, 에탄올 세척 해부 바늘, 슬라이드, 커버 슬립뿐만 아니라 작업 공간에 필수적이다.  또한 사용하기 전에 모든 해당 장비 (바늘, 슬라이드, 커버립)를 UV 치료하는 것이 좋습니다.
해부 슬라이드의 멤브레인은 염색체의 확산을 매우 어렵게 만듭니다.  이 슬라이드를 만들 때 난소 (난소의 전체 쌍에 반)를 더 많이 사용하는 것이 중요합니다, 잘 확산 핵을 찾는 더 큰 기회를 제공하기 위해.  또한 슬라이드를 만들 때 신선한 조직을 사용하는 것이 좋습니다, 증폭 속도 는 조직 나이로 떨어지는 것으로 나타납니다 49 염색체 확산더 도전이된다.  마이크로 절에 대한 슬라이드의 준비는이 프로토콜에서 가장 시간이 많이 걸리는 단계입니다.  염색체는 원치 않는 물질의 우발적 인 취득을 피하기 위해 잘 확산해야합니다.  Giemsa 염색을 통해 사용자는 미세 절제를 사용하기 전에 위상 대비 현미경으로 확산 품질을 확인할 수 있습니다.
미세 절과 증폭의 조합은 작은 관심 영역에서 대부분의 무기에 이르기까지 크기의 염색체 조각을 추출하고 분석 할 수있는 기회를 제공합니다.  이 프로토콜은 사용자가 반전, 특정 우통 밴드 및 인터밴드, 텔로머릭, 센트로메릭 및 간 이종과 같은 형태학적으로 구별되는 영역에서 DNA를 얻을 수 있게 합니다. 사용자는 생성된 페인팅 프로브를 비정상적인 염색체를 검사하거나, 특정 loci에서 종 간 상동성을 연구하거나, 그대로 3D 핵에서 염색체의 공간 조직을 특성화하는 데 적용할 수 있다. 염색체 페인트를 개발하기 위해 여러 염색체 영역을 가진 반복성 DNA의 혼성화를 피하기 위해 유색성 세그먼트를 선택했습니다. 그 결과, 총 게놈 DNA 또는 C0t-1 DNA 분획과 같은 경쟁사를 사용하지 않고 팔 별 그림을 얻었습니다.
우리는 다중 증폭 키트의 효율성과 중퇴 율을 비교 리뷰를 기반으로 게놈 플렉스 WGA 및 REPLI-G 키트를 사용하기로 결정했다 40,44.  두 키트 모두 탈락률 모두에서 사용 가능한 방법 중 에서 가장 좋은 성과를 보였습니다(GenomePlex는 REPLI-g의 37.5%에 비해 12.5%의 비율을 보였습니다. 증폭된 마커의 비율(GenomePlex는 45.24% 증폭율을 보였고, 렙리-g는 30.0% 40. GenomePlex 키트는 또한 더 많은 양의 DNA를 제공하므로 여러 다운스트림 기술에 대한 더 나은 후보가되었습니다.  GenomePlex 시스템을 위한 재증폭 키트도 사용할 수 있어 DNA의 추가 증폭을 가능하게 합니다. 그러나 증폭이 완벽하지 않다는 점에 유의해야 합니다.  가능성은 성공적인 증폭 오류를 소개하거나 대상 DNA에 있는 특정 loci에 대한 편견이 있을 수 있다는 것을 남아 있습니다. 사용 가능한 게놈 증폭 방법의 최종 단편 크기를 고려하는 것이 중요합니다.  GenomePlex 조각화는 200-500 bp에 이르는 파편이 있는 라이브러리를 생성하며, REPLI-g 키트는 약 10-20 kb 크기의 조각을 생성합니다. 이 프로토콜의 의도된 다운스트림 응용 프로그램은 FISH이므로, 원하는 단편 크기와 WGA를 통해 DNA 단편을 직접 라벨로 표시하는 기능을 제공했기 때문에 GenomePlex 키트를 보다 실현 가능한 옵션으로 만듭니다. REPLI-g 증폭에 의해 생성된 긴 DNA 분자는 다운스트림 닉 번역 라벨링 반응에서 단편화되어야 합니다.
이 프로토콜은 단일 폴리텐 염색체 팔에서 DNA를 성공적으로 증폭하도록 조정되었습니다.  다른 프로토콜은 시료 7,11,28,40을 성공적으로 증폭시키기 위해 많은(일반적으로 10-30) 염색체 조각의 풀링을 필요로 한다.  다중 염색체의 풀링은 우리의 방법을 사용하여 가능하지만, 견본 오염의 증가한 가능성은 가능한 한 적은 염색체로 실험을 시작하는 의 중요성을 강조합니다. 폴리텐 염색체를 사용할 수 없는 경우, 우리의 프로토콜은 미토성 염색체에 사용하기 위해 적응될 수 있었습니다. 그러나 성공적인 FISH 11을위해 증폭되기 전에 10-15 개의 미토성 염색체를 풀기 위해 필요할 수 있습니다. 증폭 편향은 시작 템플릿 DNA 50의높은 수량으로 낮다. 폴리텐 염색체는 단일 DNA 서열의 약 512부와 2개의 상동성 DNA 서열의 1024부를 제공한다.  따라서, 미토성 염색체를 풀링하면 증폭 후 DNA 제품의 전반적인 품질을 높이는 데 도움이 될 것입니다.
이 절차는 세포 유전학 및 유전체 학 연구에서 많은 잠재적인 사용. 여기서는 염색체 페인트를 사용하여 안감비아에폴리텐과 미토틱 염색체 암의 유색세그먼트사이의 대응성을 확립했습니다. 동일한 페인팅 프로브는 An. 감비아 세포주의 세포유전학 적 특성화에 적용될 수 있다. 염색체 수의 광범위한 게놈 재배열 및 변화는 세포주 51,52의일반적인 특징이다. 전좌, 반전, 삭제 및 링 염색체와 같은 항문 재배열은 상이한 모기 세포주(53,54)에서검출되었다. 고전적인 세포 유전학 관찰 55 및 물리적 매핑 56 말라리아 모기의 진화에 있는 전쪽 무기 염색체 전좌의 발생을 입증했습니다. 따라서, 미세한 분제물질은 물고기 실험과 함께 종 간 염색체 영역의 상동성을 비교하는 데 사용될 수 있다. 우리는 성공적으로 전체 마운트 난소 간호사 세포에서 폴리텐 염색체에 2R 페인팅 프로브와 3D FISH를 수행. 이 방법은 염색체 궤적의 추적과 Anopheles의핵 아키텍처를 공부할 수 있습니다. DNA genotyping 57,58,차세대 게놈 시퀀싱 26,27,물리적 및 연계 맵 개발 및 염색체 페인팅 33,59 등의 기술은 모두 팔 및 지역 별 미세 절제로부터 혜택을 누릴 수 있다. LCM 기술을 결합하고 단일 세포 WGA를 발전시킴으로써 단일 다발성 염색체 암에서 합리적인 양의 DNA를 생산하는 효율적이고 실용적인 방법을 보여줍니다.

염색체 페인팅은 karyotype 1-5의 진화를 연구하고 형광으로 표지된 염색체 DNA 1,6-8의혼성화를 통해 세포유전학 이상을 시각화하는 데 유용한 기술이다. 이 방법은 또한 개발 9 및 병리학 (10)에서염색체 영역의 3D 역학을 연구하는 데 적용됩니다. 차분하게 표지된 염색체 페인트는 개별 미토틱 11,12,메이오틱 13,14,또는 상 간 비폴리텐(15, 16 및 폴리텐 9, 11, 17 염색체)의 시각화에 사용된다. 염색체 페인트를 얻기 위한 간단하고 견고한 프로토콜은 모기와 같은 비 모형 유기체로 이 기술을 확장하는 데 매우 유용할 것입니다. Anopheles 감비아 복합체는 말라리아를 전송하는 기능을 포함하여 행동과 적응에 있는 변화하는 7개의 형태학적으로 구별할 수 없는 모기의 단입니다.  이 모기는 그들의 벡터 용량에 있는 크게 다른 밀접하게 관련된 종의 진화를 더 잘 이해하기 위하여 훌륭한 모형 역할을 합니다.  말라리아 모기에 있는 대부분의 세포유전학 연구 결과는 잘 발달된, 높게 다원화한 염색체를 사용하여 행해졌습니다 (18에서검토된,19). 폴리텐 염색체의 판독 가능한 밴딩 패턴은 연구원이 Anopheles 감비아20에서 다형성 반전과 생태 적응 사이의 연관성을 입증할 수 있게 했습니다. 또한, 조직별 21및 종별 22개의 특징인 3D 폴리텐 염색체 조직은 An. macullipennis 복합체에서 특징지어지고 있다. 그러나, 미토성 염색체를 공부하는 것은 추가 중요한 정보를 제공할 수 있었습니다. 예를 들어, 미토성 염색체에서 관찰된 이종다형성의 높은 수준은 An. gambiae 23에서감소된 짝짓기 활동 및 다산과 상관관계가 있다. 폴리텐과 미토성 염색체 암의 유록분 세그먼트 사이의 통신은 상대적 길이를 비교하여서만 확립하기가 어려울 수 있습니다. 이는 이종 염색체의 상당 부분을 구성하지만 폴리텐 염색체(24)에서과소 대표되기 때문이다. 말라리아 모기를 위한 염색체 페인트의 가용성은 연구원이 역학적으로 중요한 곤충의 이 단에 있는 karyotypic 진화 및 염색체의 3D 역학의 분석에서 비용 그리고 시간을 실질적으로 감소시키면서, 추가 종을 포함하여 세포유전학 연구 결과를 현저하게 확장하는 것을 허용할 것입니다.
염색체의 큰 뻗어를 얻기 위하여는, 미세 절부는 염색체 보충의 관심의 특정 지역을 조작하고 격리하는 필수적인 기술이 되었습니다.  전체 게놈 증폭(WGA)과 결합하면, 마이크로절은 FISH 11,12 및 차세대 게놈 시퀀싱 25-27을포함한 강력한 다운스트림 응용 을 초래한다. 이전에는 숙련된 사용자(28)가수동으로 제어해야 하는 특수 미세 절 바늘의 사용을 요구했습니다.  레이저 포획 미세 절제(LCM)의 발전으로 단일 셀 29,30 또는 개별 염색체 31-33을 오염 위험이 줄인 분리에 더 적합한 단순화 된 도구가 생겼습니다. 이 접근법은 사용자가 단일 세포에서 발생하는 유전 이질성 및 염색체 이상을 연구할 수 있게 해주며, 대신 여러 세포를 34-36으로풀링하여 발생하는 합의 풍경대신에 발생합니다. 여러 가지 방법이 마이크로 절제에서 생성된 DNA를 증폭시키는 데 사용되었습니다.  DOP-PCR은 고반복서열의 증폭에 유용한 기술로, 메뚜기(37), 가시 장어(38)및 나일틸라피아(39)를 포함한 종으로부터 미세한 염색체를 증폭시키는 데 사용되어 왔다.   최근에는 PCR 기반 GenomePlex WGA4 단일 세포 키트및 다중 변위 증폭 기반(MDA) Repli-G 단일 세포 키트가 메뚜기 37 및 로큐스트(43)의 B 염색체 시스템을 포함하여 단일 인간 세포뿐만 아니라 염색체40-42의유전자 분석을 포함하는 실험에 귀중한 도구가 되었습니다. 이 두 키트는 각각 장점과 단점을 가지고 있지만, 다른 사용 가능한 증폭 시스템 보다 그들의 명백한 우월성은 입증 되었습니다 44.
단일 염색체 또는 염색체 세그먼트로부터 얻을 수 있는 DNA의 양은 전체 핵보다 현저히 적습니다. 따라서 단일 염색체의 미세 절, 증폭 및 후속 분석은 특히 Drosophila 또는 Anopheles와같은 작은 게놈을 가진 유기체에서 훨씬 더 도전적입니다.  비록 인간의 단일 미세 한 염색체로부터 개발 되었지만 (33 및 말벌 45),성공적인 FISH 실험필요 여러 (적어도 10-15) 과일 플라이의 미세 한 미토성 염색체(11). 그러나, 단일 염색체를 미세하게 해와 증폭시키는 능력은 (i) 상이한 염색체로부터 물질로 오염의 가능성을 감소시키고, (ii) 미세절에 필요한 염색체 제제의 수를 최소화하고, (iii) 미세분해시 샘플의 뉴클레오티드 및 구조적 다형성을 낮추는 것이 중요할 것이다. 많은 Dipteran 종에서 찾아낸 폴리텐 염색체는 DNA의 훨씬 더 높은 개시 량을 취득하는 유일한 기회를 제공합니다. 그(것)들은 또한 미토성 염색체의 사용을 통해 달성될 수 없는 더 높은 해상도 및 염색체 구조물을 제공합니다. 이 추가 된 해상도는 염색체 재배열, 크로마틴 구조 및 염색체 세그먼트를 미세 하게 하여 28,46으로시각화하는 데 중요 할 수 있습니다.
여기서 우리는 단일 폴리텐 염색체 팔에서 유색 세그먼트를 효율적으로 분리하고 DNA를 증폭시키고 말라리아 모기의 하류 FISH 응용 프로그램에서 사용하는 절차를 제시합니다.  첫째, 특별히 준비된 멤브레인 슬라이드에서 단일 염색체 암을 분리하고 추출하기 위해 LCM을 적용합니다. 둘째, WGA는 미세한 분물질로부터 DNA를 증폭시키는 데 사용된다. 셋째, 우리는 생선 실험에서 증폭된 DNA를 혼성화하여 스쿼시 제제(47),메타위상 및 상간 염색체 슬라이드(48)와3D 난소 전체 마운트 샘플을 다포텐화한다. 이 절차는 성공적으로 An. 감비아의염색체 팔에 유크로 마틴의 대부분을 페인트하기 위해 수행되었습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="562">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">A491-212</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Methanol</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:120px;">A412-4</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Propionic acid&#160;</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">402907</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Membrane slides 1.0 PET</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;">415190-9051-000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Buffer tablets &#8220;GURR&#8221;</td>
			<td style="width:112px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">10582-013</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">KaryoMAX Giemsa Stain</td>
			<td style="width:112px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">10092-013</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">ThermoBrite Slide Denaturation/Hybridization System</td>
			<td style="width:112px;">Abbott Molecular</td>
			<td style="width:120px;">30-144110</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Vacufuge vacuum concentrator</td>
			<td style="width:112px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:120px;">22820001</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">Spectroline Microprocessor-Controlled UV Crosslinker XL-1000</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">11-992-89</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:59px;width:191px;">Thermo Scientific NanoDrop</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">ND-2000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">REPLI-g Single Cell Kit</td>
			<td style="width:112px;">Qiagen</td>
			<td style="width:120px;">150343</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:191px;">GenomePlex Single Cell Kit (WGA4)</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">WGA4-10RXN</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">GenomePlex WGA Reamplification Kit (WGA3)</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">WGA3-50RXN</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:191px;">MZ6 Leica stereomicroscope</td>
			<td style="width:112px;">Leica</td>
			<td style="width:120px;">VA-OM-E194-354</td>
			<td style="width:139px;">A different stereomicroscope can be used</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">Olympus CX41 Phase Microscope</td>
			<td style="width:112px;">Olympus</td>
			<td style="width:120px;">CX41RF-5</td>
			<td style="width:139px;">A different phase microscope can be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">PALM MicroBeam Laser Microdissection Microscope</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Thermomixer</td>
			<td style="width:112px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:120px;">22670000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">10x PBS</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:120px;">P5493</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">50x Denhardt&#8217;s solution</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">D2532</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">99% Formamide</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP227500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Dextran sulfate sodium salt</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td style="width:120px;">D8906</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">20x SSC buffer</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:120px;">AM9765</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">ProLong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:120px;">P-36931</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">dATP, dCTP, dGTP, dTTP</td>
			<td style="width:112px;">Fermentas</td>
			<td style="width:120px;">R0141, R0151, R0161, R0171</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Cy3-dUTP, Cy5-dUTP</td>
			<td style="width:112px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:120px;">PA53022, PA55022</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">BSA</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">A3294</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">DNA polymerase I</td>
			<td style="width:112px;">Fermentas</td>
			<td style="width:120px;">EP0041</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">DNase I&#160;</td>
			<td style="width:112px;">Fermentas</td>
			<td style="width:120px;">EN0521</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Spermine</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">S3256-1G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Spermidine</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">S0266-1G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP366-500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP3581</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">EGTA</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">E0396-25G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">PIPES</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">P6757-25G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">EDTA</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">S311-500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Digitonin</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">D141-100MG</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Triton-X100</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP151-100</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">AdhesiveCap 500 clear</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;">415190-9211-000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">QIAamp DNA Micro Kit (50)</td>
			<td style="width:112px;">Qiagen</td>
			<td style="width:120px;">56304</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Genomic DNA Clean and Concentrator Kit</td>
			<td style="width:112px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:120px;">D4010</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">37% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">F79-500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

2d and 3d chromosome painting in malaria mosquitoes

전체 암 염색체 프로브의 현장 혼성화(FISH)의 형광은 게놈 영역을 매핑하고, 염색체 재배열을 감지하고, 세포 핵에서 염색체의 3차원(3D) 조직을 연구하기 위한 강력한 기술이다. 레이저 포획 미세 절(LCM) 및 전체 게놈 증폭(WGA)의 출현은 단일 세포로부터 다량의 DNA를 얻을 수 있게 합니다. WGA 키트의 감도가 높아짐에 따라 염색체 페인트를 개발하고 염색체 조직과 비모델 유기체의 진화를 탐구하는 데 사용하게 되었습니다. 여기서, 우리는 아프리카 말라리아 모기 아노펠스 감비아의난소 간호사 세포로부터 단일 폴리텐 염색체 암의 유색세그먼트를 분리하고 증폭시키는 간단한 방법을 제시한다. 이 절차는 염색체 페인트를 얻기 위한 효율적인 플랫폼을 제공하며, 시료에 외국 DNA를 도입할 위험을 줄입니다. WGA의 사용은 재 증폭의 여러 라운드를 허용, 2D 및 3D FISH를 포함하여 여러 실험에 사용할 수있는 DNA의 높은 수량의 결과. 개발된 염색체 페인트는 안감비아에폴리텐과 미토성 염색체 암의 유록분 부분 사이의 대응을 성공적으로 확립하는 데 사용될 수 있음을 입증했다. 전반적으로, LCM과 단 염색체 WGA의 조합은 미래 세포 유전학 및 유전체 학 연구를 위한 표적 DNA의 상당한 양을 만들기 위한 능률적인 공구를 제공합니다.

그림 1에서는 이 문서에 설명된 프로토콜의 전체 흐름 에 대해 설명합니다.  사용자는 처음에 막 슬라이드에서 염색체 DNA 샘플을 미세 하게 하여 시작합니다.  미세 한 분은 추출 및 정제됩니다. 정제 된 DNA는 다음 증폭, 다시 증폭, 라벨, 다음 염색체 확산을 표시하기 위해 FISH에 사용됩니다.
LCM 프로토콜은 세 가지 전체 단계로 세분화될 수 있다: 1) 관심있는 염색체를 찾아서 절단 부위를준비(도 2A),2) 레이저(도2B)를통해 관심 있는 염색체 영역을 절단 및 촉매시키는 3) 샘플이 실제로 접착제캡(그림 2C)으로발사되는지 확인한다. An. 감비아에 수아 균주 폴리텐 염색체에 사용되는 LCM의 과정은 비디오 1에 도시된다. 비디오는 중요한 소프트웨어 기능과 팁을 포함하여 프로그램 시작의 전체 프로세스에 대해 자세히 설명합니다.
이 프로토콜에 사용되는 GenomePlex 및 REPLI-g 단일 셀 WGA 키트는 결과 제품 크기와 전체 수율에 크게 다릅니다.  도 3은 GenomePlex 및 REPLI-g 키트에 대한 겔 전기전도의 결과뿐만 아니라 나노드롭에 의한 시료의 정량화를 나타낸다.
미세 한 분은 염색체의 유체 영역을 대상으로 하는 FISH 프로브를 만드는 데 사용되었습니다.  도 4는 An. 감비아의폴리텐 염색체에 미세한 분과 물질에서 생성된 5개의 프로브의 FISH를 시연한다.  4개의 자가암은 WGA3 키트를 사용하여 3개의 형광으로 표시되었다: 3R 염색체는 녹색(형광체), 3L 염색체는 빨간색(Cy-3)과 노란색(Cy-5)의 혼합물에 있고, 2R 염색체는 노란색(Cy-5), 및 2L 염색체(Cy-5)에 있고 2L 염색체는 3L 염색체(Cy-5)에 속한다. X 염색체는 별도의 실험에서 REPLI-g 물질의 닉 번역을 사용하여 주황색(Cy-3)으로 표지되었다. 폴리텐과 미토틱 염색체 암의 유록분 부분 사이의 대응을 확립하기 위해 염색체 페인트는 An. 감비아의 상, 프로페이즈, 프로메타상 및 메타상 염색체에 혼성화되었다(그림5).  세포 핵에서 단일 폴리텐 염색체 암의 3D 조직을 시각화하기 위해, 전체 마운트 FISH는 An. 감비아 수아 균주 난소 간호사 세포(Video 2)에서 수행되었다.  뚜렷한 염색체 암 계열은 상(도5D)및 폴리텐(Video 2) 염색체를 가진 핵에서 명확하게 볼 수 있다.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig1.jpg"> 그림 1. 염색체 페인트의 준비를 향한 실험 절차의 회로도 표현. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig1highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig2.jpg"> 그림 2. 염색체 미세 절제의 주요 단계. A) 멤브레인을 통해 관심있는 염색체 영역의 레이저 보조 절단. B) 발사 후 구멍이 있는 멤브레인이 수행됩니다. C) 접착캡에 부착된 염색체 세그먼트를 가진 멤브레인의 촉매제 조각의 보기. 화살표는 슬라이드에 남아 있는 X 염색체의 이종로크로마틴을 나타냅니다. 별표는 슬라이드에 남아 있는 또 다른 염색체 조각을 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig2highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig3.jpg"> 그림 3. WGA 후 DNA를 보여주는 아가로즈 젤 이미지. A) WGA4 및 WGA3 GenomePlex 키트를 사용한 후 팔 3R에서 저분자량(200-500 bp) DNA. B) 리플리-g 증폭 후 팔 2L로부터 의 높은 분자량(10-20 kb) DNA. 100 bp 사다리는 왼쪽 차선에 표시됩니다. 젤 이미지 아래 표는 Nanodrop에 의해 측정된 DNA 농도를 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig3highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig4.jpg"> 그림 4. 미세 한 분체 물질에서 생성 된 4 개의 프로브를 사용하여 An. 감비아의 난소 간호사 세포에서 폴리텐 염색체의 페인팅. X 염색체는 REPLI-g 재료의 닉 번역에 의해 주황색(Cy-3)으로 표시됩니다. 2R 암은 노란색(Cy-5)으로 표시되어 있습니다. 2L 팔은 빨간색 (Cy-3); 3R 암은 녹색(형광체)으로 표시되어 있습니다. 3L 암은 빨간색(Cy-3)과 노란색(Cy-5)의 혼합물로 표시된다. 오토솜에는 WGA3 증폭 키트가 라벨이 부착되어 있습니다. 크로마틴은 파란색(DAPI)으로 염색됩니다. 염색체 이름은 텔로머 영역 근처에 배치됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig4highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig5.jpg"> 그림 5. WGA3에 의해 표지된 미세한 분질에서 생성된 3개의 프로브를 사용하여 An. 감비아에 Mopti 균주의 애벌레 상상 디스크에서 단계(A), prophase (B), 프로메타위상(C) 및 메타상(D) 염색체의 페인팅. 2R 암은 녹색 (형광체)으로 표시됩니다. 2L 팔의 라벨이 지정되지 않습니다. 3R 암은 분홍색, 빨간색 (Cy-3)과 오렌지 (Cy-5)의 혼합물입니다. 3L 암은 주황색(Cy-5)으로 표시되어 있습니다. X 염색체에는 18S rDNA 프로브에 해당하는 빨간색 라벨이 있습니다. 크로마틴은 파란색(DAPI)으로 염색됩니다. 염색체의 밝게 얼룩진 지역은 이종으로 막트로마틴에 해당합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig5highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
비디오 1. An. 감비아제 폴리텐 염색체의 LCM 프로세스. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/Sharakhov_video1.mp4" target="_blank">비디오 1을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
비디오 2. 전체 마운트 3D FISH는 An. 감비아난소 간호사 세포에서 수행됩니다. 프로브는 Cy-3(파란색으로 묘사)로 표시되어 미세한 2R 염색체 팔로 만들어졌습니다.  크로마틴은 DAPI로 염색되었으며 시안 의사 색소(라이트 블루)에 의해 묘사됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/Video2.avi" target="_blank">비디오 2를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

염색체 페인팅은 세포 핵의 조직과 카요타입의 진화를 연구하는 데 유용한 방법입니다. 여기서, 우리는 이후 시상 혼성화(FISH)에서 2차원 및 3차원 형광에 사용되는 단일 폴리텐 염색체로부터 관심 있는 특정 영역을 분리하고 증폭시키는 접근법을 시연한다.

말라리아 모기의 2D 및 3D 염색체 페인팅

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

2d-and-3d-chromosome-painting-in-malaria-mosquitoes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

에서 DNA 추출을위한 간단한 Chelex 프로토콜<em&gt; 아노펠레스</em&gt; 종.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

연구

면역학 및 감염병학

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes. Investigation of transcripts and gene regulators that are expressed in tissues in which the mosquito host and pathogen interact, and in organs involved in reproduction are of great interest for strategies to reduce mosquito-borne disease transmission and disrupt egg development. A number of tools have been employed to study and validate the temporal and tissue-specific regulation of gene expression. Here, we describe protocols that have been developed to obtain spatial information, which enhances our understanding of where specific genes are expressed and their products accumulate. The protocol described has been used to validate expression and determine accumulation patterns of transcripts in tissues related to mosquito-borne pathogen transmission, such as female salivary glands, as well as subcellular compartments of ovaries and embryos, which relate to mosquito reproduction and development. 
 The following procedures represent an optimized methodology that improves the efficiency of various steps in the protocol without loss of target-specific hybridization signals. Guidelines for RNA probe preparation, dissection of soft tissues and the general procedure for fixation and hybridization are described in Part A, while steps specific for the collection, fixation, pre-hybridization and hybridization of mosquito embryos are detailed in Part B.

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Temporal and spatial gene expression analyses have a crucial role in functional genomics. Whole-mount hybridization in situ is useful for determining the localization of transcripts within tissues and subcellular compartments. Here we outline a hybridization in situ protocol with modifications for specific target tissues in mosquitoes.

이종 교잡<em&gt; 현장에서</em&gt; 침샘, 난소, 그리고 벡터 모기의 태아의

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. One important application of this method is the development of high-quality physical maps useful for improving the genome assemblies for various organisms. The natural banding pattern of polytene and mitotic chromosomes provides guidance for the precise ordering and orientation of the genomic supercontigs. Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, a well-established chromosome-based mapping technique has been developed only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes 1. As a result of genome mapping efforts, 88% of the An. gambiae genome has been placed to precise chromosome positions 2,3 . Two other mosquito genera, Aedes and Culex, have poorly polytenized chromosomes because of significant overrepresentation of transposable elements in their genomes 4, 5, 6. Only 31 and 9% of the genomic supercontings have been assigned without order or orientation to chromosomes of Ae. aegypti 7 and Cx. quinquefasciatus 8, respectively. Mitotic chromosome preparation for these two species had previously been limited to brain ganglia and cell lines. However, chromosome slides prepared from the brain ganglia of mosquitoes usually contain low numbers of metaphase plates 9. Also, although a FISH technique has been developed for mitotic chromosomes from a cell line of Ae. aegypti 10, the accumulation of multiple chromosomal rearrangements in cell line chromosomes 11 makes them useless for genome mapping. Here we describe a simple, robust technique for obtaining high-quality mitotic chromosome preparations from imaginal discs (IDs) of 4th instar larvae which can be used for all three genera of mosquitoes. A standard FISH protocol 12 is optimized for using BAC clones of genomic DNA as a probe on mitotic chromosomes of Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus, and for utilizing an intergenic spacer (IGS) region of ribosomal DNA (rDNA) as a probe on An. gambiae chromosomes. In addition to physical mapping, the developed technique can be applied to population cytogenetics and chromosome taxonomy/systematics of mosquitoes and other insect groups.

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, physical genome mapping techniques were established only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes. For the genera of Aedes and Culex, however, cytogenetic mapping remains challenging because of the poor quality of polytene chromosomes. Here we present a universal protocol for obtaining high-quality preparations of mitotic chromosomes and an optimized FISH protocol for all three genera of mosquitoes.

형광성의<em&gt; 현장에서</em모기의 Mitotic의 염색체에&gt; 하이브리드

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency and type of chromosome aberrations in different cell types allows defects in DNA repair pathways to be elucidated. Understanding mammalian DNA repair biology has been greatly helped by the production of mice with knockouts in specific genes. The goal of this protocol is to quantify genomic instability in mouse B lymphocytes. Labeling of the telomeres using PNA-FISH probes (peptide nucleic acid - fluorescent in situ hybridization) facilitates the rapid analysis of genomic instability in metaphase chromosome spreads. B cells have specific advantages relative to fibroblasts, because they have normal ploidy and a higher mitotic index. Short-term culture of B cells therefore enables precise measurement of genomic instability in a primary cell population which is likely to have fewer secondary genetic mutations than what is typically found in transformed fibroblasts or patient cell lines.

DNA repair pathways are essential for maintenance of genomic integrity and preventing mutation and cancer. The goal of this protocol is to quantify genomic instability by direct observation of chromosome aberrations in metaphase spreads from mouse B cells using fluorescent in situ hybridization (FISH) for telomeric DNA repeats.

PNA-FISH에 의해 마우스 B 림프구에서 염색체 이상을 신속하게 분석

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria

Despite decades of eradication efforts, malaria remains a global burden. Recent renewed interest in regional elimination and global eradication has been accompanied by increased genomic information about Plasmodium parasite species responsible for malaria, including characteristics of geographical populations as well as variations associated with reduced susceptibility to anti-malarial drugs.
One common genetic variation, single-nucleotide polymorphisms (SNPs), offers attractive targets for parasite genotyping. These markers are useful not only for tracking drug resistance markers but also for tracking parasite populations using markers not under drug or other selective pressures.
SNP genotyping methods offer the ability to track drug resistance as well as to fingerprint individual parasites for population surveillance, particularly in response to malaria control efforts in regions nearing elimination status.
While informative SNPs have been identified that are agnostic to specific genotyping technologies, high-resolution melting (HRM) analysis is particularly suited to field-based studies. Compared to standard fluorescent-probe based methods that require individual SNPs in a single labeled probe and offer at best 10% sensitivity to detect SNPs in samples that contain multiple genomes (polygenomic), HRM offers 2-5% sensitivity. Modifications to HRM, such as blocked probes and asymmetric primer concentrations as well as optimization of amplification annealing temperatures to bias PCR towards amplification of the minor allele, further increase the sensitivity of HRM. While the sensitivity improvement depends on the specific assay, we have increased detection sensitivities to less than 1% of the minor allele.
In regions approaching malaria eradication, early detection of emerging or imported drug resistance is essential for prompt response. Similarly, the ability to detect polygenomic infections and differentiate imported parasite types from cryptic local reservoirs can inform control programs.
This manuscript describes modifications to high resolution melting technology that further increase its sensitivity to identify polygenomic infections in patient samples.

While high resolution melting analysis offers the ability to differentiate between single nucleotide polymorphisms in a heterogeneous population, mutant allele amplification bias can increase its ability to detect alleles present at relatively low percentages within a sample. This protocol describes improvements that improve the sensitivity of high resolution melting analysis.

방법은 말라리아에 단일 염기 다형성 유전자형 녹는 고해상도의 감도를 증가

Despite decades of eradication efforts, malaria remains a global burden. Recent renewed interest in regional elimination and global eradication has been ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

<em&gt; 체외</em&gt; HIV 공동 감염의 맥락에서 말라리아에 면역 반응을 측정하기위한 모델

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible for most malaria-related deaths globally. Several factors including parasite sequestration in tissues, vascular dysfunction, and inflammatory responses influence the evolution of the disease in malaria-infected people. P. falciparum-infected red blood cells (iRBCs) release small extracellular vesicles (EVs) containing different kinds of cargo molecules that mediate pathogenesis and cellular communication between parasites and host. EVs are efficiently taken up by cells in which they modulate their function. Here we discuss strategies to address the role of EVs in parasite-host interactions. First, we describe a straightforward method for labeling and tracking EV internalization by endothelial cells, using a green cell linker dye. Second, we report a simple way to measure permeability across an endothelial cell monolayer by using a fluorescently labeled dextran. Finally, we show how to investigate the role of small non-coding RNA molecules in endothelial cell function.

In this work, we describe protocols to investigate the role of extracellular vesicles (EVs) released by Plasmodium falciparum infected erythrocytes. In particular, we focus on the interactions of EVs with endothelial cells.

말라리아 감염 시 세포 외 기 기능의 평가

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines and/or antivirals have underscored the urgent need to develop ZIKV reverse genetic systems to facilitate the study of ZIKV biology and the development of therapeutic and/or prophylactic approaches. However, like with other flaviviruses, the generation of ZIKV full-length infectious cDNA clones has been hampered due to the toxicity of viral sequences during its amplification in bacteria. To overcome this problem, we have developed a nontraditional approach based on the use of bacterial artificial chromosomes (BACs). Using this approach, the full-length cDNA copy of the ZIKV strain Rio Grande do Norte Natal (ZIKV-RGN) is generated from four synthetic DNA fragments and assembled into the single-copy pBeloBAC11 plasmid under the control of the human cytomegalovirus (CMV) immediate-early promoter. The assembled BAC cDNA clone is stable during propagation in bacteria, and infectious recombinant (r)ZIKV is recovered in Vero cells after transfection of the BAC cDNA clone. The protocol described here provides a powerful technique for the generation of infectious clones of flaviviruses, including ZIKV, and other positive-strand RNA viruses, particularly those with large genomes that have stability problems during bacterial&#160;propagation.

The recent epidemic of Zika virus highlights the importance of establishing reverse genetic approaches to develop vaccines and/or therapeutic strategies. Here, we describe the protocol to rescue an infectious recombinant Zika virus from a full-length cDNA clone assembled in a bacterial artificial chromosome under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter.

세균성 인공 염색체 cDNA 클론에서 재조합 Zika 바이러스의 구조

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

지카 바이러스를 사용하여 Aedes aegypti 모기에 벡터 역량 분석

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of disease cases each year. E. aedis causes mortality and reduced reproductive fitness in the mosquito vector and has been explored for its potential as a biocontrol agent. The protocol we present for culturing E. aedis is based on its natural infection cycle, which involves both horizontal and vertical transmission at different life stages of the mosquito host. Ae. aegypti mosquitoes are exposed to spores in the larval stage. These infected larvae then mature into adults and transmit the parasite vertically to their offspring. Infected offspring are then used as a source of spores for future horizontal transmission. Culturing E. aedis can be challenging to the uninitiated given the complexities of the parasite&#8217;s life cycle, and this protocol provides detailed guidance and visual aids for clarification.

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

A protocol to culture the microsporidian parasite Edhazardia aedis. The parasite is passaged from one generation of Aedes aegypti mosquitoes to the next via horizontal transfer at the larval stage followed by vertical transmission at the adult stage. Live sporoplasms survive long-term in infected eggs.

Aedes aegypti 모기에서 현미경 포리디안 기생충 에드hazardia aedis의 전파

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of ...