Name: 2d and 3d chromosome painting in malaria mosquitoes
Uploaded: 2014-01-06T17:30:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about 2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av stipendet fra National Institutes of Health 1R21AI094289 til Igor V. Sharakhov

1) Polytene kromosom lysbilde forberedelse for laser fange mikrodissection
<ol><li>Dissekere halv-gravid Anopheles kvinner ved 25 timers post-blod fôring. Fest eggstokkene fra omtrent fem kvinner til 500 μl fersk modifisert Carnoys løsning (100% metanol: issyre, 3:1) ved romtemperatur i 24 timer. Overfør eggstokkene til -20 °C for langtidslagring.</li>
	<li>Forbered Carnoys løsning (100% etanol: iseddiksyre, 3:1) og 50% propionsyre like før du lager kromosomskred.</li>
	<li>Plasser ett par eggstokkene i en dråpe Carnoys løsning på en Zeiss 1.0 PET membransklie. Avhengig av størrelsen, del eggstokkene i ca 2-4 seksjoner med dissekering nåler og legg dem i en dråpe på 50% propionsyre på rene lysbilder under et disseksjonsmikroskop.</li>
	<li>Skill follikler og fjern gjenværende vev ved hjelp av papirhåndkle under et disseksjon stereomikroskop. Tilsett en ny dråpe 50% propionsyre til folliklene og la dem sitte i 3-5 min ved romtemperatur.</li>
	<li>Plasser en silikonisert deksle på toppen av dråpen. La skredet stå i ca. 1 min.</li>
	<li>Dekk lysbildet med et absorberende materiale (filterpapir brukes til denne metoden), og mens du bruker viskelærsiden av en blyant, bruk en sjenerøs mengde trykk på dekslene ved å trykke på den gjentatte ganger med viskelæret.</li>
	<li>Varm opp sklien til 60 °C på et glidendemetnings-/hybridiseringssystem i 15-20 min for å hjelpe til med å flate ut polytenkromosomene. Plasser sklier inn i et fuktig kammer ved 4 °C over natten for å la syren flate ut kromosomene ytterligere.</li>
	<li>Plasser sklier i kaldt 50% etanol i 10 min. Fjern forsiktig dekslene, og erstatt i kaldt 50% etanol i 10 minutter til.</li>
	<li>Dehydrere lysbilder i 70%, 90%, 100% etanol i 5 min hver. Lufttørk sklier.</li>
	<li>Forbered en løsning av GURR bufferløsning ved å legge til en enkelt buffertablett til 1 L destillert vann. autoklav.</li>
	<li>Forbered Giemsa-løsningen ved å tilsette 1 ml Giemsa fargingsoppløsning til 50 ml GURR-buffer.</li>
	<li>Plasser lufttørkede sklier i Giemsa-oppløsning i 10 min og vask tre ganger i 1X PBS. Lufttørk glir igjen i et kontrollert sterilt klima for å unngå forurensning.</li>
</ol>2) Laserfangst mikrodesisseksjon av en enkelt polytenkromosomarm
Denne delen beskriver bruken av PALMRobo-programvaren, som følger med PALM MicroBeam Laser Microdissection-systemet. 
<ol><li>Rengjør mikroskopet med 100% etanol. Steriliser hansker og rør med UV-lys i en UV-krysskobling.</li>
	<li>Slå på PALM MicroBeam Laser Microdissection-mikroskopet og slå på laseren. Åpne laser disseksjonspakken, PALMRobo, og konfigurer innstillingene "Power" og "Focus" etter behov.</li>
	<li>Søk etter polytene kromosomarm av interesse.</li>
	<li>Bruk blyantverktøyet til å disponere det valgte området.</li>
	<li>Åpne "Elements window" fra menylinjen.</li>
	<li>Velg tegnet element, sørg for at du har valgt Klipp ut.</li>
	<li>Monter det selvklebende hetterøret i holderen og plasser over lysbildet, og la et lite gap <1 mm i størrelse, og start laserkuttet.</li>
	<li>Plasser "Catapult-merket" på det kuttede nettstedet, og la det være plass mellom kanten og kromosomet.</li>
	<li>Velg "LPC" fra rullegardinmenyen og begynn å katapultere.</li>
	<li>Kontroller at prøven ble katapultert i hetten ved å trykke på "Eye" -ikonet.</li>
</ol>3) Rensing av DNA fra en enkelt mikrodissektert polytenkromosomarm
Følg instruksjonene i QIAamp DNA Micro Kit for å frigjøre og rense det innsamlede DNA-et. Trinn 3.1 ble modifisert for å imøtekomme det omvendte røret. 
<ol><li>Tilsett 15 μl Buffer ATL og 10 μl proteinase K til det inverterte røret (inne i hetten) og inkuber ved 56 °C i 3 timer.</li>
	<li>Legg til 25 μl buffer ATL, 50 μl buffer AL og 1 μl bærer RNA; blanding. Tilsett 50 μl 100% EtOH; blande.</li>
	<li>Overfør lysate til QIAamp kolonne; sentrifuge. Vask ved å legge til 500 μl buffer AW1; sentrifuge. Plasser kolonnen i nytt oppsamlingsrør, legg til 500 μl buffer AW2; sentrifuge. Plasser kolonnen i et nytt rør; sentrifuge for å fjerne overflødig væske.</li>
	<li>Plasser søylen i et 1,5 μl mikrosenterrør og tilsett 20 μl vann for å elute; sentrifuge.</li>
	<li>Fordamp ferskt eluted DNA ned til et siste volum på 9 μl ved hjelp av en vakuumfuge.</li>
</ol>4) Forsterkning av DNA fra en enkelt mikrodissektert polytenkromosomarm
To forskjellige protokoller ble brukt til WGA av en enkelt kromosomarm. 
<ol><li>DNA-forsterkning og sondeforberedelse via GenomePlex WGA<ol>
<li>Følg GenomePlex Single Cell WGA4 Kit-protokollen for å produsere den første batchen med forsterket DNA:<ol>
<li>Tilsett nylaget Proteinase K-løsning i 9 μl-prøven; inkuber DNA ved 50 °C i 1 time, og varm deretter opp til 99 °C i 4 minutter. Hold deg på isen.</li>
			<li>Legg til 2 μl 1X forberedelsesbuffer for enkeltcellebibliotek og 1 μl bibliotekstabiliseringsløsning; mix. Varm prøven til 95 °C i 2 min. Avkjøl på is og sentrifuge.</li>
			<li>Tilsett 1 μl av bibliotekets forberedelsesenzym; blanding og sentrifugering. Inkuber som følger: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq1.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
			<li>Tilsett 7,5 μl 10X forsterkning Master Mix, 48,5 μl vann. 5.0 μl WGA DNA polymerase; blanding og sentrifugering.</li>
			<li>Termocycle som følger: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq2.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Rens DNA ved hjelp av Genomisk DNA Clean &Concentrator Kit. Protokollen er som følger:<ol>
<li>Tilsett 5:1 DNA-bindingsbuffer:DNA-prøve (spesielt for genomisk DNA på mindre enn 2 kB. Hvis prøve-DNA er større enn 2 kB, bruk et 2:1-forhold) og overfør til angitt spinnkolonne. sentrifuge.</li>
			<li>Tilsett 200 μl DNA-vaskebuffer og sentrifuge. Gjenta vasketrinnet. Tilsett deretter 50 μl vann og elute DNA i et nytt 1,5 ml rør.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Forsterk prøve-DNA på nytt ved hjelp av GenomePlex WGA3-reamplifiseringssettet på følgende måte:<ol>
<li>Tilsett 10 μl DNA i PCR-røret (settet anbefaler 10 ng totalt DNA) med 49,5 μl vann, 7,5 μl 10x Forsterkning Master Mix, 3,0 μl 10 mM DNTP-blanding og 5,0 μl WGA DNA Polymerase. Bland og sentrifuger.</li>
			<li>Bruk følgende profil for reaksjonen: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq3.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
			<li>Oppbevar DNA ved -20 °C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Label DNA for FISH ved hjelp av GenomePlex WGA3 Reamplification Kit som følger:<ol>
<li>Lag en master mix fra GenomePlex WGA3 Reamplification Kit ved å legge 10 μl DNA til PCR-rør med 49,5 μl vann, 7,5 μl 10X Forsterkning Master Mix, 3,0 μl 1 mM dNTP blanding (1 mM dATP, dCTP, dGTP, 0,3 μl 1 mM dTTP - hvis du bruker merket dUTP), 1 μl av 25 nM merket dUTPP og 5,0 μl WGA DNA-polymerase.</li>
			<li>Bruk følgende profil for reaksjonen: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq3.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
			<li>Etanol utfeller den merkede sonden ved å tilsette 1/10 det endelige reaksjonsvolumet (7,5 μl for 75 μl reaksjon) av 3 M natriumacetat pH 5,2 og 2-3 volumer på 100% etanol. Chill DNA prøve ved -80 °C i minst 30 min.</li>
			<li>Sentrifugeprøve ved 4 °C i 10 minutter for å lage merket pellets og fjerne supernatant og lufttørr pellets.</li>
			<li>Opprett hybridiseringsbuffer på følgende måte: 0,2 g Dextran sulfat 1200 μl Deionisert formamid 580 μl H2O 120 μl 20X SSC</li>
			<li>Tilsett 40 μl hybridiseringsbuffer til lufttørket pellets.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>DNA-forsterkning og sondeforberedelse via REPLI-G Single Cell WGA etterfulgt av nick-oversettelse<ol>
<li>Følg REPLI-g Single Cell WGA Kit-protokollen for å produsere det forsterkede DNA-et:<ol>
<li>Klargjør buffer D2 (3 μl 1 M DTT + 33 μl buffer DLB).</li>
			<li>Bland 4 μl renset mikro uoppdaget materiale med 3 μl buffer D2. Vi sveip røret for å blande. Inkuber i 10 min ved 65 °C. Tilsett 3 μl stoppløsning; blande.</li>
			<li>Tilsett 9 μl H2O, 29 μl REPLI-g reaksjonsbuffer og 2 μl REPLI-g DNA-polymerase i prøven. Inkuber ved 30 °C i 8 timer. Inaktiver DNA-polymerase ved oppvarming til 65 °C i 3 minutter. Oppbevar DNA ved -20 °C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Følg nick oversettelsesprotokollen for å merke REPLI-g forsterket DNA:<ol>
<li>Forbered følgende etikettmiks: 1 μg forsterket DNA 5 μl 10X DNA polymerase buffer 5 μl 10X dNTP 5 μl 1X BSA 1 μl 1 mM merket dNTP 4 μl 1 U/μl DNase I 1 μl 10 U/μl DNA polymerase I H2O til 50 μl</li>
			<li>Inkuber ved 15 °C i 2 timer. Tilsett 2 μl 0,5 M EDTA for å stoppe reaksjonen. Kontroller DNA-fragmentstørrelsen ved å kjøre på gel.</li>
			<li>Følg trinnene fra 4.1.4.3-4.1.4.6 for å utfelle og løse pellets.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>5) 2D FISH på polytene og mititotiske kromosom squashpreparater
Se detaljerte protokoller for FISH om preparater av polytene squashes 47 og mitotic kromosom lysbilder 48. Her gir vi korte protokoller.
<ol><li>FISK på polytene kromosom squashpreparater<ol>
<li>Senk lysbildene i 1X PBS i 20 min på RT. Fest lysbildene i 4 % Paraformaldehyd i 1X PBS i 1 min.</li>
		<li>Dehydreres gjennom etanolvask: 50%, 70%, 90%, 100% i 5 min hver på RT. Lufttørke lysbilder.</li>
		<li>Forvarm sonden i hybridiseringsbuffer ved 37 °C. Tilsett 10-20 μl sonde for å skyve. Deksel med 22 X 22 mm deksler. Trykk ut eventuelle luftbobler ved hjelp av en pipettespiss.</li>
		<li>Denature kromosomer og sonde ved 90 °C i 10 min. Tetningskanter av dekslerlip med gummisement. Overfør gliden til fuktig kammer og inkuber ved 39 °C over natten.</li>
		<li>Vask lysbildene med 1X SSC ved 39 °C i 20 minutter. Vask lysbildene med 1X SSC ved RT i 20 minutter. Skyll lysbildene i 1X PBS, og tilsett deretter Prolong anti-fade med DAPI. Dekk med coverlip, og oppbevar i lysbildeboks ved 4 °C i minst en time før visualisering.</li>
	</ol>
</li>
	<li>FISK på mitotiske kromosom squashpreparater<ol>
<li>Trekk ut mitotiske kromosomer fra imaginale plater av4. instar larve av An. gambiae.</li>
		<li>Forbered kromosomsklier som passer for FISK.</li>
		<li>Tilsett 2-3 μl merket DNA-sonde til hybridiseringsbuffer i et rør og bland forsiktig ved pipettering.</li>
		<li>Påfør 10 μl av probeblandingen på gliden og dekk med en 22 X 22 mm dekslelip. Trykk ut eventuelle luftbobler ved hjelp av en pipettespiss.</li>
		<li>For motoppnåelse og deteksjon, bruk Prolong anti-fade med DAPI på preparatet og hold deg i mørke i minst en time før visualisering.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6) 3D FISH på helmontert eggstokkvev
<ol><li>Klargjør følgende buffer A-blanding: 60 mM KCl 15 mM NaCl 0,5 mM spermidin 0,15 mM spermin 2 mM EDTA 0,5 mM EGTA 15 mM RØR</li>
	<li>Forbered lysbilder for kjernefysisk visualisering ved å legge til et lag neglepolish i et firkantet mønster for å matche størrelsen på dekslene. Dette skaper en hevet overflate for å forhindre squashing av kjerner når du plasserer på dekslerlip i fremtiden.</li>
	<li>Disseker ferske eggstokkene fra Christophers stadium 3 kvinner og hold i en løsning på 150-250 μl Buffer A med 0,5% digitonin. Kjør større disseksjonsnål over follikler (i rør med buffer A med 0,5% digitonin) for å ødelegge follikulær membran.</li>
	<li>Vortex i 5-10 min for å forstyrre folliklene ytterligere. Skrap ned store follikulære stykker og sentrifugerør i 30 sek ved laveste innstilling på ~ 500 omdreininger per minutt (RPM). Overfør supernatant til et nytt 2 ml Eppendorf-rør, og tilsett 100 μl buffer A. Gjenta trinn 6,3 mellom 5-7 ganger, til det synlige vevet er brutt inn i små partikler.</li>
	<li>Spinn begge rørene i 10 min ved 2000 RPM. Kast supernatant i begge rørene. Merk: Begge rørene vil bli brukt til å lage endelige kjernefysiske visualiseringsskred. Røret med samlet supernatant skal inneholde primært ekstrahert kjerner, mens det opprinnelige røret med vev vil inneholde en blanding av vev og kjerner innebygd i sykepleierceller. Tilsett 200 μl buffer A – 0,1 % Triton og inkuber over natten ved 4 °C. Sentrifuge 5 min ved 10 000 o/min (10 621 x G) og fjern supernatant.</li>
	<li>Tilsett 200 μl 4% Paraformaldehyd i PBS. Inkuber i thermomixer i 30 min, bland ved 450 RPM. Sentrifuge 5 min ved 5000 RPM (2655 x G) og fjern supernatant. Vask med buffer A med 0,1% Triton i 5 min, bland ved 450 RPM i thermomixer. Sentrifuge 5 min ved 5000 RPM (2655 G) og fjern supernatant.</li>
	<li>Tilsett forvarmet ved 37 °C merket sonde på røret. Denature ved 95 °C i thermomixer, blanding ved 450 o/min, i 10 min. Fortsett denaturering ved 80 °C i 15 minutter med fortsatt blanding. Inkuber ved 37 °C i thermomixer, med 450 RPM blanding over natten. Sentrifuge 5 min ved 5000 RPM (2655 x G). Fjern supernatant.</li>
	<li>Vask med buffer A med 0,1% Triton i 5 min. Sentrifuge 5 min ved 5000 RPM (2655 x G). Gjenta 2 ganger. Påfør dråpe Prolong Anti-fade med DAPI.</li>
	<li>Rør ut nuklei/DAPI-oppløsningen forsiktig (unngå bobler), påfør på skyv og dekk med deksler.</li>
</ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Det er flere trinn som er avgjørende for å lykkes med å forsterke DNA fra mikrodisserte polytenkromosomprøver. Protokollen benytter bruk av LCM, en metode som både øker den generelle effektiviteten og reduserer eksponeringen for utenlandsk DNA ved å fjerne samspillet mellom fysiske verktøy og prøven. Forsterkning av utenlandsk DNA er imidlertid fortsatt den største potensielle fallgruven i dette eksperimentet. Under hele prosessen er det derfor viktig å holde prøvene beskyttet mot forurensning. Gjennom glideforberedelses- og mikrodesisseksjonsfasene er det viktig å vaske disseksjonsnåler, lysbilder, dekselslipper, samt arbeidsområdet.  Det anbefales også å UV behandle alt gjeldende utstyr (nåler, sklier, deksler) før bruk.
Membranen på disseksjonsskredene gjør spredning av kromosomene svært vanskelig.  Det er viktig å bruke mer av eggstokken (halvparten til et helt par eggstokkene) når du lager disse lysbildene, for å gi større sjanse for å finne en godt spredt kjerne.  Det anbefales også å bruke friskt vev når du lager lysbilder, da forsterkningsgraden ser ut til å falle etter hvert som vev i alderen 49 og kromosomspredning blir mer utfordrende.  Utarbeidelsen av lysbilder for mikrodisseksjon er det mest tidkrevende trinnet i denne protokollen.  Kromosomer må være godt spredt for å unngå utilsiktet oppkjøp av uønsket materiale.  Giemsa farging gjør det mulig for brukeren å sjekke spredningskvaliteten med et fasekontrastmikroskop før bruk av mikrodeseksjonssystemet.
Kombinasjonen av mikrodisseksjon og forsterkning gir mulighet til å trekke ut og analysere kromosomale fragmenter som varierer i størrelse fra små interesseregioner til et flertall av armene.  Denne protokollen gjør det mulig for brukeren å få DNA fra morfologisk forskjellige regioner som inversjoner, spesifikke eukromatiske bånd og interbands, telomerisk, sentromerisk og interkalær heterochromatin. Brukeren kan bruke de genererte malingssondene til å undersøke avvikende kromosomer, studere inter-arter homologi på bestemt loci, eller karakterisere romlig organisering av kromosomer i en intakt 3D-kjerne. For å utvikle kromosommaling valgte vi eukromatiske segmenter for å unngå hybridisering av repeterende DNA med flere kromosomale regioner. Som et resultat fikk vi arm-spesifikt maleri uten å bruke en konkurrent, som totalt genomisk DNA eller C0t-1 DNA-fraksjon.
Vi valgte å bruke GenomePlex WGA- og REPLI-G-settene basert på vurderinger som sammenlignet effektiviteten og frafallshastigheten til flere forsterkningssett 40,44.  Begge settene presterte best blant de tilgjengelige metodene i begge frafallsfrekvensen (GenomePlex hadde en rate på 12,5% sammenlignet med REPLI-gs 37,5%) og prosentandel av forsterkede markører (GenomePlex hadde en forsterkningshastighet på 45,24 % sammenlignet med REPLI-gs 30,0 %) 40. GenomePlex-settet ga også en høyere mengde DNA, og gjorde det dermed til en bedre kandidat for flere nedstrømsteknikker.  Et reforsterkningssett for GenomePlex-systemet er også tilgjengelig, noe som muliggjør ytterligere forsterkning av DNA. Det er imidlertid viktig å merke seg at forsterkning ikke er perfekt.  Muligheten er fortsatt at vellykket forsterkning kan introdusere feil eller ha en skjevhet mot spesifikk loci i målet DNA. Det er viktig å vurdere den endelige fragmentstørrelsen på de tilgjengelige genomforsterkningsmetodene.  GenomePlex fragmentering resulterer i et bibliotek med fragmenter fra 200-500 bp, mens REPLI-g-settet produserer fragmenter omtrent 10-20 kb i størrelse. Den tiltenkte nedstrøms anvendelsen av denne protokollen er FISH, noe som gjør GenomePlex-settet til et mer gjennomførbart alternativ, da det ga ønsket fragmentstørrelse og muligheten til å merke DNA-fragmenter direkte gjennom WGA. Lange DNA-molekyler produsert av REPLI-g-forsterkningen må fragmenteres i nedstrøms nick-oversettelsesmerkingsreaksjon.
Denne protokollen er tilpasset for å forsterke DNA fra en enkelt polytenkromosomarm.  Andre protokoller krever gruppering av mange (vanligvis 10-30) kromosomfragmenter for å kunne forsterke prøven 7,11,28,40.  Selv om sammenslåing av flere kromosomer er mulig ved hjelp av vår metode, understreker den økte sannsynligheten for prøveforurensning viktigheten av å starte eksperimentet med så få kromosomer som mulig. Hvis polytene kromosomer ikke er tilgjengelige, kan vår protokoll tilpasses for bruk i mititotiske kromosomer. Det kan imidlertid være nødvendig å samle 10-15 mitotiske kromosomer før forsterkning for vellykket FISH 11. Forsterkningsbias er lavere med høye mengder startmal DNA 50. Polytene kromosomer gir omtrent 512 kopier av en enkelt DNA-sekvens og 1024 kopier av to homologe DNA-sekvenser.  Dermed vil sammenslåing av mititotiske kromosomer bidra til å øke den generelle kvaliteten på DNA-produktet etter forsterkning.
Denne prosedyren har mange potensielle bruksområder i cytogenetiske og genomiske studier. Her brukte vi kromosommaling for å etablere korrespondansen mellom eukromatiske segmenter av polytene og mititotiske kromosomarmer i An. gambiae. De samme malesondene kan brukes på cytogenetisk karakterisering av An. gambiske cellelinjer. Omfattende genomiske omorganiseringer og endringer i kromosomtall er vanlige trekk ved cellelinjene 51,52. Aneuploidy, polyploidy og kromosomale omorganiseringer som translokasjoner, inversjoner, slettinger og ringkromosomer har blitt oppdaget i forskjellige myggcellelinjer 53,54. Klassiske cytogenetiske observasjoner 55 og fysisk kartlegging 56 har vist forekomsten av helarms kromosomale translokasjoner i utviklingen av malaria mygg. Derfor kan mikro uoppdaget materiale brukes sammen med FISH-eksperimenter for å sammenligne homologi av kromosomale regioner mellom arter. Vi utførte vellykket 3D FISH med 2R-maleri sonde på polytene kromosomer i hele mount ovarie sykepleierceller. Denne metoden vil lette sporing av kromosombaner og studere atomarkitekturen i Anopheles. Teknikker som DNA genotyping 57,58, neste generasjons genomsekvensering 26,27, fysisk og linkage kartutvikling, og generering av sonder for kromosommaling 33,59 alle kan dra nytte av arm- og regionspesifikk mikrodesinfeksjon. Ved å kombinere LCM-teknologi og fremme encellet WGA, demonstrerer vi en effektiv, praktisk metode for å produsere rimelige mengder DNA fra en enkelt polyfinkromosomarm.

Kromosommaling er en nyttig teknikk for å studere utviklingen av karyotyper 1-5 og for å visualisere cytogenetiske abnormiteter via hybridisering av fluorescerende merket kromosomalt DNA 1,6-8. Denne metoden brukes også til å studere 3D-dynamikken i kromosomområder i utvikling 9 og patologi 10. Differensialt merkede kromosommaling brukes til visualisering av individuelle mititotiske 11,12, meiotiske 13,14eller interfase ikke-polytene 15,16 og polytenen 9,11,17 kromosomer. En enkel og robust protokoll for å oppnå kromosommaling ville være svært nyttig for å utvide denne teknikken til ikke-modellorganismer, for eksempel mygg. Anopheles gambiae komplekset er en gruppe på syv morfologisk uutslettelige mygg som varierer i oppførsel og tilpasning, inkludert evnen til å overføre malaria.  Disse myggene tjener som en utmerket modell for bedre å forstå utviklingen av nært beslektede arter som varierer sterkt i deres vektorkapasitet.  De fleste cytogenetiske studier i malaria mygg har blitt gjort ved hjelp av velutviklede, svært polyteniserte kromosomer (gjennomgått i 18,19). De lesbare bandingmønstrene til polytene kromosomer tillot forskere å demonstrere sammenhengen mellom polymorfiske inversjoner og økologiske tilpasninger i Anopheles gambiae 20. Også vevsspesifikke 21 og artsspesifikke 22 trekk ved 3D polytene kromosomorganisasjon har blitt karakterisert i An. macullipennis-komplekset. Studier av mititotiske kromosomer kan imidlertid gi ytterligere viktig informasjon. For eksempel har et høyere nivå av heterokromatinpolymorfisme observert i mititotiske kromosomer blitt korrelert med redusert parringsaktivitet og fruktbarhet i An. gambiae 23. Korrespondansen mellom eukromatiske segmenter av polytene og mititotiske kromosomarmer kan være vanskelig å etablere bare ved å sammenligne deres relative lengder. Dette skyldes at heterokromatin utgjør en betydelig del av mitotiske kromosomer, men er underrepresentert i polyfinkromosomer 24. Tilgjengeligheten av kromosommaling for malaria mygg ville tillate forskere å utvide cytogenetiske studier betydelig ved å inkludere flere arter, samtidig som de betydelig reduserer kostnadene og tiden i analysene av karyotypisk evolusjon og 3D-dynamikk av kromosomer i denne gruppen epidemiologisk viktige insekter.
For å oppnå store strekninger av kromosomer har mikrodeseksjon blitt en integrert teknikk for å manipulere og isolere spesifikke interesseregioner av kromosomal komplement.  Kombinert med full genomforsterkning (WGA) resulterer mikrodeseksjon i kraftige nedstrømsapplikasjoner, inkludert FISH 11,12 og neste generasjons genomsekvensering 25-27. Tidligere krevde teknikken bruk av spesialiserte mikrodesisseksjonsnåler som måtte kontrolleres manuelt av en erfaren bruker 28.  Fremrykningen av laserfangstmikrodisseksjon (LCM) har resultert i et forenklet verktøy som er bedre egnet for å isolere enkeltceller 29,30 eller individuelle kromosomer 31-33 med redusert risiko for forurensning. Denne tilnærmingen lar brukeren studere de genetiske heterogeniteter og kromosomale abnormiteter som forekommer i enkeltceller, i stedet for et konsensuslandskap som skyldes sammenslåing av flere celler sammen 34-36. Flere metoder har blitt brukt til å forsterke DNA-et som produseres fra mikrodesisseksjon.  DOP-PCR, en teknikk som er nyttig for forsterkning av svært repeterende sekvenser, har blitt brukt til å forsterke mikrodisserte kromosomer fra arter, inkludert gresshopper 37, spiny ål 38og Nile tilapia 39.  Mer nylig har det PCR-baserte GenomePlex WGA4 Single Cell-settet og multippel forskyvningsforsterkningsbasert (MDA) Repli-G Single Cell kit blitt verdifulle verktøy for eksperimenter som involverer genetisk analyse av enkeltmenneskeceller samt kromosomer40-42, inkludert B-kromosomsystemene i gresshopper 37 og gresshopper 43. Disse to settene har hver fordeler og ulemper, men deres tilsynelatende overlegenhet over andre tilgjengelige forsterkningssystemer har blitt demonstrert 44.
Mengden DNA som kan fås fra et enkelt kromosom eller et kromosomsegment er betydelig mindre enn for en hel kjerne. Derfor er mikrodeseksjon, forsterkning og etterfølgende analyse av et enkelt kromosom langt mer utfordrende, spesielt i organismer med små genomer som i Drosophila eller Anopheles.  Selv om maling er utviklet fra enkelt mikrodisserte kromosomer av et menneske 33 og en veps 45, krevde et vellykket FISH-eksperiment flere (minst 10-15) mikrodisserte mitotiske kromosomer av en fruktflue 11. Imidlertid vil evnen til å mikrodissektere og forsterke et enkelt kromosom være viktig for (i) å redusere sjansen for forurensning med materiale fra et annet kromosom, (ii) minimere antall kromosomale preparater som trengs for mikrodisseksjon, (iii) senke nukleotid og strukturell polymorfisme av den mikrodissifiserte prøven i både FISK og sekvensering av nedstrømsapplikasjoner. Polytene kromosomer som finnes i mange dipteranske arter gir en unik mulighet til å skaffe seg en mye høyere startmengde av DNA. De gir også en høyere oppløsning og kromosomstruktur som ikke kan oppnås ved bruk av mitotiske kromosomer. Denne ekstra oppløsningen kan være avgjørende for å visualisere kromosomale omorganiseringer, kromatinstruktur og kromosomale segmenter som skal mikrodisserte 28,46.
Her presenterer vi en prosedyre for effektivt å isolere et eukromatisk segment fra en enkelt polytenkromosomarm, forsterke DNA og bruke det i nedstrøms FISKEapplikasjoner i malaria mygg.  Først bruker vi LCM for å isolere og trekke ut en enkelt kromosomarm fra spesiallagde membransklier. For det andre brukes WGA til å forsterke DNA-et fra det mikrodisserte materialet. For det tredje hybridiserer vi det forsterkede DNA-et i FISH-eksperimenter til polytene squashpreparater 47, metafase og interfasekromosom lysbilder 48, samt 3D ovarial hele monteringsprøver. Denne prosedyren er gjort for å kunne male et flertall av eukromatin i kromosomale armer av An. gambiae.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="562">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">A491-212</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Methanol</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:120px;">A412-4</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Propionic acid&#160;</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">402907</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Membrane slides 1.0 PET</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;">415190-9051-000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Buffer tablets &#8220;GURR&#8221;</td>
			<td style="width:112px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">10582-013</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">KaryoMAX Giemsa Stain</td>
			<td style="width:112px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">10092-013</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">ThermoBrite Slide Denaturation/Hybridization System</td>
			<td style="width:112px;">Abbott Molecular</td>
			<td style="width:120px;">30-144110</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Vacufuge vacuum concentrator</td>
			<td style="width:112px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:120px;">22820001</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">Spectroline Microprocessor-Controlled UV Crosslinker XL-1000</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">11-992-89</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:59px;width:191px;">Thermo Scientific NanoDrop</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">ND-2000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">REPLI-g Single Cell Kit</td>
			<td style="width:112px;">Qiagen</td>
			<td style="width:120px;">150343</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:191px;">GenomePlex Single Cell Kit (WGA4)</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">WGA4-10RXN</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">GenomePlex WGA Reamplification Kit (WGA3)</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">WGA3-50RXN</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:191px;">MZ6 Leica stereomicroscope</td>
			<td style="width:112px;">Leica</td>
			<td style="width:120px;">VA-OM-E194-354</td>
			<td style="width:139px;">A different stereomicroscope can be used</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">Olympus CX41 Phase Microscope</td>
			<td style="width:112px;">Olympus</td>
			<td style="width:120px;">CX41RF-5</td>
			<td style="width:139px;">A different phase microscope can be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">PALM MicroBeam Laser Microdissection Microscope</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Thermomixer</td>
			<td style="width:112px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:120px;">22670000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">10x PBS</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:120px;">P5493</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">50x Denhardt&#8217;s solution</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">D2532</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">99% Formamide</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP227500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Dextran sulfate sodium salt</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td style="width:120px;">D8906</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">20x SSC buffer</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:120px;">AM9765</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">ProLong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:120px;">P-36931</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">dATP, dCTP, dGTP, dTTP</td>
			<td style="width:112px;">Fermentas</td>
			<td style="width:120px;">R0141, R0151, R0161, R0171</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Cy3-dUTP, Cy5-dUTP</td>
			<td style="width:112px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:120px;">PA53022, PA55022</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">BSA</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">A3294</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">DNA polymerase I</td>
			<td style="width:112px;">Fermentas</td>
			<td style="width:120px;">EP0041</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">DNase I&#160;</td>
			<td style="width:112px;">Fermentas</td>
			<td style="width:120px;">EN0521</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Spermine</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">S3256-1G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Spermidine</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">S0266-1G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP366-500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP3581</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">EGTA</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">E0396-25G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">PIPES</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">P6757-25G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">EDTA</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">S311-500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Digitonin</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">D141-100MG</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Triton-X100</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP151-100</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">AdhesiveCap 500 clear</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;">415190-9211-000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">QIAamp DNA Micro Kit (50)</td>
			<td style="width:112px;">Qiagen</td>
			<td style="width:120px;">56304</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Genomic DNA Clean and Concentrator Kit</td>
			<td style="width:112px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:120px;">D4010</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">37% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">F79-500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

2d and 3d chromosome painting in malaria mosquitoes

Fluorescerende in situ hybridisering (FISH) av hele arm kromosom sonder er en robust teknikk for å kartlegge genomiske regioner av interesse, oppdage kromosomale omorganiseringer, og studere tredimensjonal (3D) organisering av kromosomer i cellekjernen. Fremveksten av laserfangstmikrodisseksjon (LCM) og hel genomforsterkning (WGA) gjør det mulig å skaffe store mengder DNA fra enkeltceller. Den økte følsomheten til WGA-settene fikk oss til å utvikle kromosommaling og bruke dem til å utforske kromosomorganisasjon og evolusjon i ikke-modellorganismer. Her presenterer vi en enkel metode for å isolere og forsterke de eukromatiske segmentene av enkelt polytene kromosomarmer fra eggstokksykepleierceller av den afrikanske malaria mygg Anopheles gambiae. Denne prosedyren gir en effektiv plattform for å skaffe kromosommaling, samtidig som den reduserer den totale risikoen for å introdusere utenlandsk DNA til prøven. Bruken av WGA tillater flere runder med reforsterkning, noe som resulterer i høye mengder DNA som kan brukes til flere eksperimenter, inkludert 2D og 3D FISH. Vi demonstrerte at de utviklede kromosommalingene med hell kan brukes til å etablere korrespondansen mellom eukromatiske deler av polytene og mititotiske kromosomarmer i An. gambiae. Samlet sett gir foreningen av LCM og enkeltkromosom WGA et effektivt verktøy for å skape betydelige mengder mål-DNA for fremtidige cytogenetiske og genomiske studier.

Figur 1 beskriver den totale gjennomflyten av protokollen som er beskrevet i denne artikkelen.  Brukeren starter i utgangspunktet med mikrodissekterende kromosom-DNA-prøver fra membranskred.  Mikro uoppdaget materiale ekstraheres og renses. Det rensede DNA-et forsterkes deretter, forsterkes, merkes på nytt og brukes deretter til FISH for å merke kromosomspredninger.
LCM-protokollen kan deles inn i tre generelle trinn: 1) Finne kromosomer av interesse og klargjøre regionen for kutting (Figur 2A), 2) Skjære og katapultere kromosomområdet av interesse via laser (Figur 2B) og 3) Kontrollere om prøven faktisk er katapultert i limhette (Figur 2C). Prosessen med LCM som brukes på An. gambiae Sua stammepolyfinkromosomer er vist i video 1. Videoen beskriver hele prosessen fra programoppstart, inkludert viktige programvarefunksjoner og tips.
GenomePlex og REPLI-g enkeltcellede WGA-sett som brukes i denne protokollen, varierer sterkt i resulterende produktstørrelse så vel som samlet utbytte.  Figur 3 viser resultatene av gelelektroforese som ble kjørt for GenomePlex- og REPLI-g-settene, samt kvantifisering av prøvene av Nanodrop.
Mikro uoppdaget materiale har blitt brukt til å lage FISH-sonder som retter seg mot eukromatiske regioner i et kromosom.  Figur 4 demonstrerer FISK av fem sonder generert fra mikro uoppdaget materiale på polytene kromosomer av An. gambiae.  Fire autosomale armer ble merket med tre fluoroforer ved hjelp av WGA3-settet: 3R-kromosomet er merket med grønt (fluorescein), 3L-kromosomet er i en blanding av rødt (Cy-3) og gult (Cy-5), 2R-kromosomet er i gult (Cy-5), og 2L-kromosomet er i rødt (Cy-3). X-kromosomet ble merket i oransje (Cy-3) ved hjelp av nick-oversettelse av REPLI-g-materialet i et eget eksperiment. For å etablere korrespondansen mellom eukromatiske deler av polytene og mititotiske kromosomarmer, har kromosommaling blitt hybridisert til interfase, profase, prometaphase og metafasekromosomer av An. gambiae (figur 5).  For å visualisere 3D-organiseringen av en enkelt polytenkromosomarm i cellekjernen, ble hele fjellet FISH utført på An. gambiae Sua stamme eggstokksykepleierceller (Video 2).  Distinkte kromosomarmområder er tydelig sett i kjerner med interfase (Figur 5D) og polyfin (Video 2) kromosomer.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig1.jpg"> Figur 1. Skjematisk representasjon av eksperimentelle prosedyrer mot fremstilling av kromosommaling. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig1highres.jpg" target="_blank">Klikk her for å vise større bilde.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig2.jpg"> Figur 2. De viktigste trinnene i kromosommikrodisseksjon. A) Laserassistert kutting av kromosomområdet av interesse gjennom membranen. B) Membranen med et hull etter at katapulteringen er utført. C) Utsikten over det katapulterte membranstykket med et kromosomsegment i den festet til klebehetten. Pilen indikerer heterokromatinet til X-kromosomet som forblir på lysbildet. Stjernen viser et stykke av et annet kromosom som ble igjen på lysbildet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig2highres.jpg" target="_blank">Klikk her for å vise større bilde.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig3.jpg"> Figur 3. Agarose gel bilder som viser DNA etter WGA. A) Lav molekylvekt (200-500 bp) DNA fra arm 3R etter bruk av WGA4- og WGA3 GenomePlex-settene. B) Høy molekylvekt (10-20 kb) DNA fra arm 2L etter REPLI-g forsterkning. 100 bp stigen vises i venstre kjørefelt. Tabellene under gelbilder viser DNA-konsentrasjoner målt ved Nanodrop. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig3highres.jpg" target="_blank">Klikk her for å vise større bilde.</a>
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig4.jpg"> Figur 4. Maleri av polytene kromosomer fra ovariesykepleierceller av An. gambiae ved hjelp av fire sonder generert fra mikrodissektert materiale. X-kromosomet er merket med oransje (Cy-3) ved nick-oversettelse av REPLI-g-materialet. 2R-armen er merket i gult (Cy-5); 2L-armen er i rødt (Cy-3); 3R-armen er merket i grønt (fluorescein); 3L-armen er merket i en blanding av rødt (Cy-3) og gult (Cy-5). Autosomer er merket med WGA3-forsterkningssettet. Kromatin er farget i blått (DAPI). Kromosomnavn er plassert i nærheten av telomeriske regioner. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig4highres.jpg" target="_blank">Klikk her for å vise større bilde.</a>
<img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig5.jpg"> Figur 5. Maleri av interfase (A), profase (B), prometaphase (C) og metafase (D) kromosomer fra larval imaginale plater av An. gambiae Mopti-stammen ved hjelp av tre sonder generert fra mikro uoppdaget materiale merket av WGA3. 2R-armen er merket i grønt (fluorescein); 2L-armen er uten etikett; 3R-armen er i rosa, en blanding av rød (Cy-3) og oransje (Cy-5); 3L-armen er merket med oransje (Cy-5). X-kromosomet har en rød etikett som tilsvarer 18S rDNA-sonden. Kromatin er farget i blått (DAPI). Sterkt fargede områder av kromosomer tilsvarer heterochromatin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig5highres.jpg" target="_blank">Klikk her for å vise større bilde.</a>
Video 1. Prosessen med LCM av An. gambiae polytene kromosomer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/Sharakhov_video1.mp4" target="_blank">Klikk her for å se video 1.</a>
Video 2. Hele fjellet 3D FISH utført på An. gambiae ovarie sykepleierceller. Sonden er merket i Cy-3 (avbildet i blått) og ble laget av en mikrodissektert 2R-kromosomarm.  Kromatin ble farget med DAPI og er avbildet av cyan pseudo-fargestoffer (lyseblå). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/Video2.avi" target="_blank">Klikk her for å se video 2.</a>

Watch this Scientific Journal Video about 2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes at JoVE.com

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

Kromosommaleri er en nyttig metode for å studere organisering av cellekjernen og utviklingen av karyotypen. Her demonstrerer vi en tilnærming for å isolere og forsterke spesifikke interesseområder fra enkeltpolytenkromosomer som senere brukes til to- og tredimensjonal fluorescerende in situ hybridisering (FISH).

2D- og 3D-kromosommaleri i malariamygg

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

2d-and-3d-chromosome-painting-in-malaria-mosquitoes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

En enkel Chelex Protocol for DNA-ekstraksjon fra<em&gt; Anopheles</em&gt; Spp..

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes. Investigation of transcripts and gene regulators that are expressed in tissues in which the mosquito host and pathogen interact, and in organs involved in reproduction are of great interest for strategies to reduce mosquito-borne disease transmission and disrupt egg development. A number of tools have been employed to study and validate the temporal and tissue-specific regulation of gene expression. Here, we describe protocols that have been developed to obtain spatial information, which enhances our understanding of where specific genes are expressed and their products accumulate. The protocol described has been used to validate expression and determine accumulation patterns of transcripts in tissues related to mosquito-borne pathogen transmission, such as female salivary glands, as well as subcellular compartments of ovaries and embryos, which relate to mosquito reproduction and development. 
 The following procedures represent an optimized methodology that improves the efficiency of various steps in the protocol without loss of target-specific hybridization signals. Guidelines for RNA probe preparation, dissection of soft tissues and the general procedure for fixation and hybridization are described in Part A, while steps specific for the collection, fixation, pre-hybridization and hybridization of mosquito embryos are detailed in Part B.

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Temporal and spatial gene expression analyses have a crucial role in functional genomics. Whole-mount hybridization in situ is useful for determining the localization of transcripts within tissues and subcellular compartments. Here we outline a hybridization in situ protocol with modifications for specific target tissues in mosquitoes.

Hybridisering<em&gt; In situ</em&gt; Av spyttkjertler, eggstokker, og embryo av Vector Mygg

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. One important application of this method is the development of high-quality physical maps useful for improving the genome assemblies for various organisms. The natural banding pattern of polytene and mitotic chromosomes provides guidance for the precise ordering and orientation of the genomic supercontigs. Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, a well-established chromosome-based mapping technique has been developed only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes 1. As a result of genome mapping efforts, 88% of the An. gambiae genome has been placed to precise chromosome positions 2,3 . Two other mosquito genera, Aedes and Culex, have poorly polytenized chromosomes because of significant overrepresentation of transposable elements in their genomes 4, 5, 6. Only 31 and 9% of the genomic supercontings have been assigned without order or orientation to chromosomes of Ae. aegypti 7 and Cx. quinquefasciatus 8, respectively. Mitotic chromosome preparation for these two species had previously been limited to brain ganglia and cell lines. However, chromosome slides prepared from the brain ganglia of mosquitoes usually contain low numbers of metaphase plates 9. Also, although a FISH technique has been developed for mitotic chromosomes from a cell line of Ae. aegypti 10, the accumulation of multiple chromosomal rearrangements in cell line chromosomes 11 makes them useless for genome mapping. Here we describe a simple, robust technique for obtaining high-quality mitotic chromosome preparations from imaginal discs (IDs) of 4th instar larvae which can be used for all three genera of mosquitoes. A standard FISH protocol 12 is optimized for using BAC clones of genomic DNA as a probe on mitotic chromosomes of Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus, and for utilizing an intergenic spacer (IGS) region of ribosomal DNA (rDNA) as a probe on An. gambiae chromosomes. In addition to physical mapping, the developed technique can be applied to population cytogenetics and chromosome taxonomy/systematics of mosquitoes and other insect groups.

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, physical genome mapping techniques were established only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes. For the genera of Aedes and Culex, however, cytogenetic mapping remains challenging because of the poor quality of polytene chromosomes. Here we present a universal protocol for obtaining high-quality preparations of mitotic chromosomes and an optimized FISH protocol for all three genera of mosquitoes.

Fluoriserende<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering på mitotiske kromosomer Mygg

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency and type of chromosome aberrations in different cell types allows defects in DNA repair pathways to be elucidated. Understanding mammalian DNA repair biology has been greatly helped by the production of mice with knockouts in specific genes. The goal of this protocol is to quantify genomic instability in mouse B lymphocytes. Labeling of the telomeres using PNA-FISH probes (peptide nucleic acid - fluorescent in situ hybridization) facilitates the rapid analysis of genomic instability in metaphase chromosome spreads. B cells have specific advantages relative to fibroblasts, because they have normal ploidy and a higher mitotic index. Short-term culture of B cells therefore enables precise measurement of genomic instability in a primary cell population which is likely to have fewer secondary genetic mutations than what is typically found in transformed fibroblasts or patient cell lines.

DNA repair pathways are essential for maintenance of genomic integrity and preventing mutation and cancer. The goal of this protocol is to quantify genomic instability by direct observation of chromosome aberrations in metaphase spreads from mouse B cells using fluorescent in situ hybridization (FISH) for telomeric DNA repeats.

Rapid Analyse av kromosomavvik i Mouse B-lymfocytter ved PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria

Despite decades of eradication efforts, malaria remains a global burden. Recent renewed interest in regional elimination and global eradication has been accompanied by increased genomic information about Plasmodium parasite species responsible for malaria, including characteristics of geographical populations as well as variations associated with reduced susceptibility to anti-malarial drugs.
One common genetic variation, single-nucleotide polymorphisms (SNPs), offers attractive targets for parasite genotyping. These markers are useful not only for tracking drug resistance markers but also for tracking parasite populations using markers not under drug or other selective pressures.
SNP genotyping methods offer the ability to track drug resistance as well as to fingerprint individual parasites for population surveillance, particularly in response to malaria control efforts in regions nearing elimination status.
While informative SNPs have been identified that are agnostic to specific genotyping technologies, high-resolution melting (HRM) analysis is particularly suited to field-based studies. Compared to standard fluorescent-probe based methods that require individual SNPs in a single labeled probe and offer at best 10% sensitivity to detect SNPs in samples that contain multiple genomes (polygenomic), HRM offers 2-5% sensitivity. Modifications to HRM, such as blocked probes and asymmetric primer concentrations as well as optimization of amplification annealing temperatures to bias PCR towards amplification of the minor allele, further increase the sensitivity of HRM. While the sensitivity improvement depends on the specific assay, we have increased detection sensitivities to less than 1% of the minor allele.
In regions approaching malaria eradication, early detection of emerging or imported drug resistance is essential for prompt response. Similarly, the ability to detect polygenomic infections and differentiate imported parasite types from cryptic local reservoirs can inform control programs.
This manuscript describes modifications to high resolution melting technology that further increase its sensitivity to identify polygenomic infections in patient samples.

While high resolution melting analysis offers the ability to differentiate between single nucleotide polymorphisms in a heterogeneous population, mutant allele amplification bias can increase its ability to detect alleles present at relatively low percentages within a sample. This protocol describes improvements that improve the sensitivity of high resolution melting analysis.

Metoder for å øke følsomheten av High Resolution Melting Enkelt nucleotide polymorphism Genotyping i Malaria

Despite decades of eradication efforts, malaria remains a global burden. Recent renewed interest in regional elimination and global eradication has been ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

En<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell for måling av immunresponser mot Malaria i sammenheng med HIV Samtidig infeksjon

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible for most malaria-related deaths globally. Several factors including parasite sequestration in tissues, vascular dysfunction, and inflammatory responses influence the evolution of the disease in malaria-infected people. P. falciparum-infected red blood cells (iRBCs) release small extracellular vesicles (EVs) containing different kinds of cargo molecules that mediate pathogenesis and cellular communication between parasites and host. EVs are efficiently taken up by cells in which they modulate their function. Here we discuss strategies to address the role of EVs in parasite-host interactions. First, we describe a straightforward method for labeling and tracking EV internalization by endothelial cells, using a green cell linker dye. Second, we report a simple way to measure permeability across an endothelial cell monolayer by using a fluorescently labeled dextran. Finally, we show how to investigate the role of small non-coding RNA molecules in endothelial cell function.

In this work, we describe protocols to investigate the role of extracellular vesicles (EVs) released by Plasmodium falciparum infected erythrocytes. In particular, we focus on the interactions of EVs with endothelial cells.

Evaluering av ekstracellulære Vesicle funksjonen under Malaria smitte

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines and/or antivirals have underscored the urgent need to develop ZIKV reverse genetic systems to facilitate the study of ZIKV biology and the development of therapeutic and/or prophylactic approaches. However, like with other flaviviruses, the generation of ZIKV full-length infectious cDNA clones has been hampered due to the toxicity of viral sequences during its amplification in bacteria. To overcome this problem, we have developed a nontraditional approach based on the use of bacterial artificial chromosomes (BACs). Using this approach, the full-length cDNA copy of the ZIKV strain Rio Grande do Norte Natal (ZIKV-RGN) is generated from four synthetic DNA fragments and assembled into the single-copy pBeloBAC11 plasmid under the control of the human cytomegalovirus (CMV) immediate-early promoter. The assembled BAC cDNA clone is stable during propagation in bacteria, and infectious recombinant (r)ZIKV is recovered in Vero cells after transfection of the BAC cDNA clone. The protocol described here provides a powerful technique for the generation of infectious clones of flaviviruses, including ZIKV, and other positive-strand RNA viruses, particularly those with large genomes that have stability problems during bacterial&#160;propagation.

The recent epidemic of Zika virus highlights the importance of establishing reverse genetic approaches to develop vaccines and/or therapeutic strategies. Here, we describe the protocol to rescue an infectious recombinant Zika virus from a full-length cDNA clone assembled in a bacterial artificial chromosome under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter.

Redning av rekombinant Zika virus fra en bakteriell kunstig kromosom cDNA Clone

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

Vector Kompetanse Analyser på Aedes aegypti Mygg ved hjelp av Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of disease cases each year. E. aedis causes mortality and reduced reproductive fitness in the mosquito vector and has been explored for its potential as a biocontrol agent. The protocol we present for culturing E. aedis is based on its natural infection cycle, which involves both horizontal and vertical transmission at different life stages of the mosquito host. Ae. aegypti mosquitoes are exposed to spores in the larval stage. These infected larvae then mature into adults and transmit the parasite vertically to their offspring. Infected offspring are then used as a source of spores for future horizontal transmission. Culturing E. aedis can be challenging to the uninitiated given the complexities of the parasite&#8217;s life cycle, and this protocol provides detailed guidance and visual aids for clarification.

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

A protocol to culture the microsporidian parasite Edhazardia aedis. The parasite is passaged from one generation of Aedes aegypti mosquitoes to the next via horizontal transfer at the larval stage followed by vertical transmission at the adult stage. Live sporoplasms survive long-term in infected eggs.

Forplantning av mikrosporidisk parasitt Edhazardia aedis i Aedes aegypti Mygg

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of ...