Name: 2d and 3d chromosome painting in malaria mosquitoes
Uploaded: 2014-01-06T17:30:00
Duration: 9 min 57 s
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Este trabalho foi apoiado pela subvenção dos Institutos Nacionais de Saúde 1R21AI094289 a Igor V. Sharakhov

1) Preparação de slides cromossômicos de politeno para microdissecção de captura a laser
<ol><li>Disseque fêmeas anofeeles semi-gravid às 25 horas após a alimentação sanguínea. Fixar ovários de aproximadamente cinco fêmeas em 500 μl de solução de Carnoy modificada fresca (100% metanol: ácido acético glacial, 3:1) à temperatura ambiente por 24 horas. Transfira os ovários para -20 °C para um armazenamento a longo prazo.</li>
	<li>Prepare a solução de Carnoy (100% etanol: ácido acético glacial, 3:1) e 50% de ácido propínico pouco antes de fazer slides de cromossomo.</li>
	<li>Coloque um par de ovários em uma gota da solução de Carnoy em um slide de membrana PET Zeiss 1.0. Dependendo do tamanho, divida os ovários em aproximadamente 2-4 seções com agulhas dissecando e coloque-os em uma gota de 50% de ácido propínico em lâminas limpas sob um microscópio de dissecção.</li>
	<li>Separe os folículos e remova o tecido restante usando papel toalha sob um estereóscópio de dissecção. Adicione uma nova gota de 50% de ácido propiônico aos folículos e deixe-os sentar por 3-5 minutos à temperatura ambiente.</li>
	<li>Coloque uma mancha de cobertura siliconada em cima da gota. Deixe o slide ficar por aproximadamente 1 min.</li>
	<li>Cubra o slide com um material absorvente (o papel filtro é usado para este método), e ao usar o lado borracha de um lápis, aplique uma quantidade generosa de pressão ao deslizamento de tampa tocando nele repetidamente com a borracha.</li>
	<li>Aqueça o slide a 60 °C em um sistema de desnaturação/hibridização por 15-20 minutos para ajudar no achatamento dos cromossomos de politenso. Coloque slides em uma câmara úmida a 4 °C durante a noite para permitir que o ácido achate ainda mais os cromossomos.</li>
	<li>Coloque lâminas no frio 50% de etanol por 10 minutos. Retire suavemente a tampa e substitua no frio 50% de etanol por mais 10 minutos.</li>
	<li>Desidrata em 70%, 90%, 100% etanol por 5 min cada. Deslizamentos secos de ar.</li>
	<li>Prepare uma solução de solução tampão GURR adicionando um único tablet tampão a 1 L de água destilada. autoclave.</li>
	<li>Prepare a solução Giemsa adicionando 1 ml de solução de coloração Giemsa a 50 ml de tampão GURR.</li>
	<li>Coloque lâminas secas a ar na solução Giemsa por 10 minutos e lave três vezes em 1X PBS. As lâminas secas de ar novamente em um clima controlado estéril para evitar contaminação.</li>
</ol>2) Microdisseção de captura a laser de um único braço cromossomo politeno
Esta seção detalha o uso do software PALMRobo, que vem com o sistema de microdisseção a laser PALM MicroBeam. 
<ol><li>Limpe o microscópio com 100% de etanol. Esterilize luvas e tubos com uma luz UV em um UV-crosslinker.</li>
	<li>Ligue o microscópio de microdisseção a laser PALM MicroBeam e ligue o laser. Abra a suíte de dissecção a laser, PALMRobo, e configure as configurações "Power" e "Focus" conforme necessário.</li>
	<li>Procure por braço cromossomo de politenso de interesse.</li>
	<li>Usando a ferramenta "Lápis", delineie a região selecionada.</li>
	<li>Abra a "janela Elementos" da barra de menu.</li>
	<li>Selecione o "elemento desenhado", certifique-se de que você selecionou "Cortar".</li>
	<li>Instale o tubo de tampa adesiva no suporte e coloque acima do slide, deixando uma pequena lacuna <1 mm de tamanho e inicie o corte a laser.</li>
	<li>Coloque a "seleção da catapulta" dentro do local do corte, deixando espaço entre a borda e o cromossomo.</li>
	<li>Selecione "LPC" na opção drop down e comece a catapultar.</li>
	<li>Verifique se a amostra foi catapultada para a tampa pressionando o ícone "Olho".</li>
</ol>3) Purificação de DNA de um único braço cromossomo de politensecção microdissectada
Siga as instruções do QIAamp DNA Micro Kit para liberar e purificar o DNA coletado. O passo 3.1 foi modificado para acomodar o tubo invertido. 
<ol><li>Adicione 15 μl de ATL tampão e 10 μl proteinase K ao tubo invertido (dentro da tampa) e incubar a 56 °C por 3 horas.</li>
	<li>Adicionar 25 μl de buffer ATL, 50 μl tampão AL e RNA portador de 1 μl; mix. Adicionar 50 μl 100% EtOH; misturar.</li>
	<li>Transferência para coluna QIAamp; centrifuga. Lave adicionando 500 μl tampão AW1; centrifuga. Coloque a coluna em novo tubo de coleta, adicione 500 μl de buffer AW2; centrifuga. Coloque a coluna em um novo tubo; centrífuga para remover o excesso de líquido.</li>
	<li>Coloque a coluna em um tubo de microcentrifus de 1,5 μl e adicione 20 μl de água ao elute; centrifuga.</li>
	<li>Evaporar DNA recém-elucido até um volume final de 9 μl usando um aspirador de vácuo.</li>
</ol>4) Amplificação do DNA de um único braço cromossomo de politensecção microdissectada
Dois protocolos diferentes foram usados para a WGA de um único braço cromossomo. 
<ol><li>Amplificação de DNA e preparação da sonda via GenomePlex WGA<ol>
<li>Siga o protocolo do Kit WGA4 de célula única do GenomePlex para produzir o primeiro lote de DNA amplificado:<ol>
<li>Adicione a solução Proteinase K recém-preparada à amostra de 9 μl; misturar. Incubar DNA a 50 °C por 1 hora e, em seguida, aquecer a 99 °C por 4 min. Mantenha-se no gelo.</li>
			<li>Adicionar 2 μl 1X Single Cell Library Preparation Buffer e 1 μl de Solução de Estabilização da Biblioteca; mix. Aqueça a amostra a 95 °C por 2 min. Esfrie no gelo e centrífuga.</li>
			<li>Adicionar 1 μl de enzima de preparação da biblioteca; mistura e centrífuga. Incubar da seguinte forma: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq1.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
			<li>Adicione 7,5 μl 10X Amplificação Master Mix, 48,5 μl de água. 5,0 μl WGA DNA Polymerase; mistura e centrífuga.</li>
			<li>Termociclo da seguinte forma: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq2.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Purificar o DNA usando o Kit De DNA Genômico Limpo & Concentrador. O protocolo é o seguinte:<ol>
<li>Adicionar 5:1 buffer de ligação de DNA:amostra de DNA (especificamente para DNA genômico de menos de 2 kb. Se o DNA da amostra for superior a 2 kb, use uma razão de 2:1) e transfira para a coluna de spin fornecida. centrifuga.</li>
			<li>Adicione 200 μl de buffer de lavagem de DNA e centrífuga. Repita o passo de lavagem. Em seguida, adicione 50 μl de água e elute o DNA em um novo tubo de 1,5 ml.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ressulifique o DNA da amostra usando o Kit de Reamplificação GenomePlex WGA3 da seguinte forma:<ol>
<li>Adicione 10 μl de DNA ao tubo PCR (o kit recomenda 10 ng total de DNA) com 49,5 μl de água, 7,5 μl 10x Amplificação Master Mix, 3,0 μl 10 mM DNTP mix e 5,0 μl WGA DNA Polymerase. Misture e centrífugue.</li>
			<li>Use o seguinte perfil para a reação: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq3.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
			<li>Armazenar DNA a -20 °C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Rotule DNA para PEIXEs usando o Kit de Reamplificação GenomePlex WGA3 como a seguir:<ol>
<li>Crie uma mistura mestre a partir do Kit de Reamplificação GenomePlex WGA3 adicionando 10 μl de DNA ao tubo PCR com 49,5 μl de água, 7,5 μl 10X Amplificação Master Mix, 3,0 μl 1 mM dNTP mix (1 mM de dATP, dCTP, dGTP, 0,3 μl 1 mM dTTP - se usar dUTP rotulado), 1 μl de 25 nM rotulado dUTP , e 5,0 μl WGA DNA Polymerase.</li>
			<li>Use o seguinte perfil para a reação: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq3.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
			<li>O etanol precipita a sonda rotulada adicionando 1/10 o volume de reação final (7,5 μl para reação de 75 μl) de 3 M de acetato de sódio pH 5,2 e 2-3 volumes de 100% etanol. Fria amostra de DNA a -80 °C por pelo menos 30 min.</li>
			<li>Amostra de centrífugas a 4 °C por 10 minutos para criar pelotas rotuladas e remover pelotas supernascedoras e secas a ar.</li>
			<li>Criar buffer de hibridização da seguinte forma: 0,2 g Dextran Sulfato 1200 μl Formamide Deionizado 580 μl H2O 120 μl 20X SSC</li>
			<li>Adicione 40 μl de tampão de hibridização à pelota seca a ar.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Amplificação de DNA e preparação da sonda via REPLI-G Single Cell WGA seguido por nick-tradução<ol>
<li>Siga o protocolo REPLI-g Single Cell WGA Kit para produzir o DNA amplificado:<ol>
<li>Prepare buffer D2 (3 μl de 1 M DTT + 33 μl Buffer DLB).</li>
			<li>Misture 4 μl de material microdissectado purificado com 3 μl buffer D2. Tubo de movimento para misturar. Incubar por 10 min a 65 °C. Adicionar 3 μl de solução Stop; misturar.</li>
			<li>Adicione 9 μl H2O, 29 μl RELI-g Reaction Buffer e 2 μl de POLImerase de DNA REPLI-g à amostra. Incubar a 30 °C por 8 horas. Inativar polimerase de DNA aquecendo a 65 °C por 3 min. Armazenar DNA a -20 °C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Siga o protocolo de tradução nick para rotular o DNA amplificado REPLI-g:<ol>
<li>Prepare a seguinte mistura de rotulagem: 1 μg de DNA amplificado 5 μl 10X Buffer de polimerase de DNA 5 μl 10X dNTP 5 μl 1X BSA 1 μl 1 mM Rotulado dNTP 4 μl 1 U/μl DNase I 1 μl 10 U/μl DNA Polymerase I H2O a 50 μl</li>
			<li>Incubar a 15 °C por 2 horas. Adicione 2 μl de 0,5 M EDTA para parar a reação. Verifique o tamanho do fragmento de DNA rodando em gel.</li>
			<li>Siga os passos de 4.1.4.3-4.1.4.6 para precipitar e solubilizar pelotas.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>5) PEIXE 2D em preparações de abóbora de politene e cromossomo mitotmático
Consulte protocolos detalhados para PEIXEs sobre os preparos de abóboras de politenso 47 e slides de cromossomo mitotísticos 48. Aqui fornecemos protocolos breves.
<ol><li>PEIXEs em preparações de cromossomo de politenso<ol>
<li>Mergulhe slides em 1X PBS por 20 min no RT. Corrija slides em 4% paraformaldeído em 1X PBS por 1 min.</li>
		<li>Desidratar slides através de lavagens de etanol: 50%, 70%, 90%, 100% para 5 min cada na RT. Lâminas secas.</li>
		<li>Pré-aquecimento da sonda em tampão de hibridização a 37 °C. Adicione 10-20 μl de sonda para deslizar. Cubra com tampa de 22 X 22 mm. Pressione todas as bolhas de ar usando uma ponta de pipeta.</li>
		<li>Cromossomos de desnaturação e sonda a 90 °C por 10 min. Veda as bordas da tampa com cimento de borracha. Transfira o deslizamento para a câmara úmida e incubar a 39 °C durante a noite.</li>
		<li>Lave os slides com 1X SSC a 39 °C por 20 min. Lave os slides com 1X SSC na RT por 20 minutos. Enxágüe slides em 1X PBS e adicione prolongar anti-fade com DAPI. Cubra com tampas e armazene na caixa de slides a 4 °C por pelo menos uma hora antes da visualização.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Peixes em preparações de abóbora cromossômica mitótica<ol>
<li>Extrair cromossomos mitóticos de discos imagináveis de4ª larva instar de An. gambiae.</li>
		<li>Prepare lâminas de cromossomo adequadas para PEIXES.</li>
		<li>Adicione 2-3 μl de sonda de DNA rotulada ao tampão de hibridização em um tubo e misture suavemente por pipetação.</li>
		<li>Aplique 10 μl da mistura da sonda no slide e cubra com uma tampa de 22 X 22 mm. Pressione todas as bolhas de ar usando uma ponta de pipeta.</li>
		<li>Para contra-manter e detecção, aplique prolongar anti-fade com DAPI na preparação e mantenha-se no escuro por pelo menos uma hora antes da visualização.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6) PEIXE 3D em tecido ovariano de montagem inteira
<ol><li>Prepare a seguinte mistura buffer A: 60 mM KCl 15 mM NaCl 0,5 mM Spermidina 0,15 mM Spermine 2 mM EDTA 0,5 mM EGTA TUBOS DE 15 mM</li>
	<li>Prepare slides para visualização nuclear adicionando uma camada de esmalte em um padrão quadrado para combinar com o tamanho das tampas. Isso cria uma superfície elevada para evitar a esmagamento de núcleos ao colocar em deslizamento de tampa no futuro.</li>
	<li>Disseca os ovários frescos das fêmeas estágio 3 de Christopher e mantenha-se em uma solução de 150-250 μl Buffer A com 0,5% de digitonina. Execute agulha de dissecção maior sobre folículos (em tubo com buffer A com 0,5% de digitonina) para destruir a membrana folicular.</li>
	<li>Vórtice por 5-10 minutos para perturbar ainda mais os folículos. Raspe quaisquer grandes pedaços foliculares e tubo de centrífuga por 30 segundos na configuração mais baixa de ~500 revoluções por minuto (RPM). Transfira supernante para um novo tubo Eppendorf de 2 ml e adicione 100 μl de Buffer A. Repita o passo 6.3 entre 5-7 vezes, até que o tecido visível seja quebrado em pequenas partículas.</li>
	<li>Gire os dois tubos por 10 min a 2.000 RPM. Descarte o supernaspe de supernasal em ambos os tubos. Nota: Ambos os tubos serão usados para fazer slides de visualização nuclear finais. O tubo com supernanato coletado deve conter núcleos extraídos principalmente, enquanto o tubo original com tecido conterá uma mistura de tecido e núcleos embutidos em células enfermeiras. Adicione 200 μl de Buffer A – Tritão 0,1% e incubar durante a noite a 4 °C. Centrifugar 5 min a 10.000 RPM (10.621 x G) e remover supernaspe.</li>
	<li>Adicione 200 μl 4% paraformaldeído em PBS. Incubar em termomixer por 30 min, misturando a 450 RPM. Centrifugar 5 min a 5.000 RPM (2.655 x G) e remover supernaspe. Lave com buffer A com Triton de 0,1% por 5 min, misturando a 450 RPM em termomixer. Centrifugar 5 min a 5.000 RPM (2.655 G) e remover supernaspe.</li>
	<li>Adicione a sonda pré-aquecida a 37 °C à sonda. Denatura a 95 °C em termomixer, misturando a 450 RPM, por 10 min. Continue a desnaturação a 80 °C por 15 min com mistura contínua. Incubar a 37 °C em termomixer, com 450 RPM misturando durante a noite. Centrifugar 5 min a 5.000 RPM (2.655 x G). Remova o supernatante.</li>
	<li>Lave com buffer A com Triton de 0,1% por 5 min. Centrifugar 5 min a 5.000 RPM (2.655 x G). Repita duas vezes. Aplique gota de Prolong Anti-fade com DAPI.</li>
	<li>Pipet nuclei/DAPI solução cuidadosamente (evitando bolhas), aplique para deslizar e cubra com tampa.</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Existem vários passos críticos para amplificar com sucesso o DNA a partir de amostras de cromossomo de politensecção microdissectada. O protocolo emprega o uso de LCM, um método que tanto aumenta a eficiência geral quanto reduz a exposição ao DNA estranho, removendo a interação de ferramentas físicas com a amostra. No entanto, a amplificação do DNA estranho ainda é a maior armadilha potencial deste experimento. Assim, durante todo o processo, é essencial manter as amostras protegidas contra contaminação. Ao longo das fases de preparação e microdisseção do slide, é essencial que as agulhas de dissecção de lavagem de etanol, lâminas, deslizamentos de cobertura, bem como o espaço de trabalho.  Também é aconselhável tratar todos os equipamentos aplicáveis (agulhas, lâminas, tampas) antes de serem utilizados.
A membrana nos slides de dissecção torna a propagação dos cromossomos muito difícil.  É importante usar mais do ovário (metade a um par completo de ovários) ao fazer esses slides, para proporcionar uma maior chance de encontrar um núcleo bem espalhado.  Também é recomendado o uso de tecido fresco ao fazer slides, pois as taxas de amplificação parecem cair à medida que os tecidos com 49 anos e a propagação do cromossomo se tornam mais desafiadoras.  A preparação de slides para microdisseção é o passo mais demorado neste protocolo.  Os cromossomos devem estar bem espalhados para evitar a aquisição acidental de material indesejado.  A coloração de Giemsa permite que o usuário verifique a qualidade do spread com um microscópio de contraste de fase antes de usar o sistema de microdisseção.
A combinação de microdisseção e amplificação proporciona a oportunidade de extrair e analisar fragmentos cromossômicos que variam em tamanho desde pequenas regiões de interesse até a maioria dos braços.  Este protocolo permite ao usuário obter DNA de regiões morfologicamente distintas, como inversões, bandas eucromáticas específicas e bandas interbandas, telomeric, centromeric e intercalar heterocromatina. O usuário pode aplicar as sondas de pintura geradas para examinar cromossomos aberrantes, estudar a hosmologia entre espécies em loci particular, ou caracterizar a organização espacial de cromossomos em um núcleo 3D intacto. Para o desenvolvimento de tintas cromossômicas, selecionamos segmentos eucromáticos para evitar a hibridização do DNA repetitivo com múltiplas regiões cromossômicas. Como resultado, obtivemos pintura específica do braço sem usar um concorrente, como DNA genômico total ou fração de DNA C0t-1.
Optamos por usar os kits GenomePlex WGA e REPLI-G com base em avaliações que comparassem a eficiência e a taxa de abandono de vários kits de amplificação 40,44.  Ambos os kits tiveram o melhor desempenho entre os métodos disponíveis em ambas as taxas de abandono (o GenomePlex apresentou uma taxa de 12,5% em comparação com os 37,5% do REPLI-g. e percentual de marcadores amplificados (GenomePlex teve uma taxa de amplificação de 45,24% versus 30,0% do REPLI-g) 40. O kit GenomePlex também forneceu uma maior quantidade de DNA, e assim tornou-o um melhor candidato para múltiplas técnicas a jusante.  Um kit de ream amplificação para o sistema GenomePlex também está disponível, permitindo uma maior amplificação do DNA. No entanto, é importante notar que a amplificação não é perfeita.  A possibilidade é que a amplificação bem sucedida possa introduzir erros ou ter um viés em relação a locis específicos no DNA alvo. É importante considerar o tamanho final do fragmento dos métodos de amplificação do genoma disponíveis.  A fragmentação do GenomePlex resulta em uma biblioteca com fragmentos que variam de 200 a 500 bp, enquanto o kit REPLI-g produz fragmentos de aproximadamente 10-20 kb de tamanho. A aplicação a jusante pretendida deste protocolo é o FISH, tornando assim o kit GenomePlex uma opção mais viável, pois forneceu o tamanho do fragmento desejado e a capacidade de rotular fragmentos de DNA diretamente através da WGA. Moléculas longas de DNA produzidas pela amplificação REPLI-g devem ser fragmentadas na reação de rotulagem de tradução a jusante.
Este protocolo foi adaptado para amplificar com sucesso o DNA de um único braço cromossomo de politeno.  Outros protocolos exigem a junção de muitos fragmentos de cromossomo (tipicamente 10-30) a fim de amplificar com sucesso a amostra 7,11,28,40.  Embora a junção de cromossomos múltiplos seja possível usando nosso método, a maior probabilidade de contaminação da amostra enfatiza a importância de iniciar o experimento com o menor número possível de cromossomos. Se cromossomos de politenso não estiverem disponíveis, nosso protocolo pode ser adaptado para uso em cromossomos mitóticos. Pode ser necessário, no entanto, reunir cromossomos mitotísticos 10-15 antes da amplificação para o bem sucedido FISH 11. O viés de amplificação é menor com altas quantidades de DNA de modelo inicial 50. Cromossomos de politenso fornecem aproximadamente 512 cópias de uma única sequência de DNA e 1024 cópias de duas sequências de DNA homólogos.  Assim, a junção de cromossomos mitóticos ajudará a aumentar a qualidade geral do produto de DNA após a amplificação.
Este procedimento tem muitos usos potenciais em estudos citogenéticos e genômicos. Aqui, usamos tintas cromossômicas para estabelecer a correspondência entre segmentos eucromáticos de braços de politeno e cromossomo mitotístico em An. gambiae. As mesmas sondas de pintura podem ser aplicadas à caracterização citogenética das linhas celulares An. gambiae. Rearranjos genômicos extensos e alterações nos números de cromossomos são características comuns das linhas celulares 51,52. Foram detectados rearranjos aneuploides, poliploides e cromossômicos, como translocações, inversões, supressões e cromossomos de anel nas diferentes linhas de células do mosquito 53,54. Observações citogenéticas clássicas 55 e mapeamento físico 56 demonstraram a ocorrência de translocações cromossômicas de braço inteiro na evolução dos mosquitos da malária. Portanto, o material microdissectado pode ser usado em conjunto com experimentos fish para comparar a homologia de regiões cromossômicas entre espécies. Realizamos com sucesso peixes 3D com a sonda de pintura 2R em cromossomos de politeno em células enfermeiras ovarianas de montagem inteira. Este método facilitará o rastreamento de trajetórias cromossômicas e o estudo da arquitetura nuclear em Anopheles. Técnicas como genotipagem de DNA 57,58, sequenciamento de genoma de última geração 26,27, desenvolvimento de mapas físicos e de ligação, e geração de sondas para pintura cromossômica 33,59 todos podem se beneficiar de microdisseção específica do braço e região. Combinando a tecnologia LCM e avançando wga unicelular, demonstramos um método eficiente e prático para produzir quantidades razoáveis de DNA a partir de um único braço cromossomo de politeno.

A pintura cromossômica é uma técnica útil para estudar a evolução dos karyótipos 1-5 e para visualizar anormalidades citogenéticas por meio da hibridização do DNA cromossômico fluorescentemente rotulado 1,6-8. Este método também é aplicado ao estudo da dinâmica 3D dos territórios cromossomos no desenvolvimento 9 e patologia 10. As tintas cromossômicas rotuladas diferencialmente são utilizadas para a visualização de mitos individuais 11,12, meiotic 13,14, ou interfase não-politeno 15,16 e politeno 9,11,17 cromossomos. Um protocolo simples e robusto para obter tintas cromossômicas seria muito útil na expansão dessa técnica para organismos não modelo, como mosquitos. O complexo anopheles gambiae é um grupo de sete mosquitos morfologicamente indistinguíveis que variam de comportamento e adaptação, incluindo a capacidade de transmitir malária.  Esses mosquitos servem como um excelente modelo para entender melhor a evolução de espécies intimamente relacionadas que diferem muito em sua capacidade vetorial.  A maioria dos estudos citogenéticos em mosquitos da malária tem sido feita utilizando cromossomos altamente politenizados (revisados em 18,19). Os padrões legíveis de banda de cromossomos de politenso permitiram aos pesquisadores demonstrar a associação entre inversões polimórficas e adaptações ecológicas em Anopheles gambiae 20. Além disso, 21 características específicas do tecido e específicas das espécies 22 da organização do cromossomo de politenso 3D foram caracterizadas no complexo an. macullipennis. No entanto, estudar cromossomos mitos poderia fornecer informações importantes adicionais. Por exemplo, um nível mais alto de polimorfismo de heterocromatina observado em cromossomos mitóticos foi correlacionado com a redução da atividade de acasalamento e fertilidade em An. gambiae 23. A correspondência entre segmentos eucromáticos de braços de politeno e cromossomo mitotísticos pode ser difícil de estabelecer apenas comparando seus comprimentos relativos. Isso porque a heterocromatina compõe uma porção significativa de cromossomos mitóticos, mas é sub-representada nos cromossomos politenes 24. A disponibilidade de tintas cromossômicas para mosquitos da malária permitiria aos pesquisadores expandir significativamente os estudos citogenéticos, incluindo espécies adicionais, reduzindo substancialmente o custo e o tempo nas análises da evolução cariotípica e da dinâmica 3D de cromossomos neste grupo de insetos epidemiologicamente importantes.
A fim de obter grandes trechos de cromossomos, a microdissecção tornou-se uma técnica integral para manipular e isolar regiões específicas de interesse do complemento cromossômico.  Quando juntamente com a amplificação completa do genoma (WGA), a microdisseção resulta em poderosas aplicações a jusante, incluindo o sequenciamento do genoma de 11,12 e de próxima geração 25-27. Anteriormente, a técnica exigia o uso de agulhas especializadas de microdisseção que tinham que ser controladas manualmente por um usuário experiente 28.  O avanço da microdissecção de captura a laser (LCM) resultou em uma ferramenta simplificada mais adequada para isolar células únicas 29,30 ou cromossomos individuais 31-33 com um risco diminuído de contaminação. Essa abordagem permite que o usuário estude as heterogeneidades genéticas e anormalidades cromossômicas que ocorrem em células únicas, em vez de um cenário de consenso que resulta da junção de múltiplas células 34-36. Vários métodos foram usados para amplificar o DNA produzido a partir da microdisseção.  O DOP-PCR, uma técnica útil para a amplificação de sequências altamente repetitivas, tem sido usado para amplificar cromossomos microdissectados de espécies como o gafanhoto 37,a enguia espinhosa 38e a tilápia do Nilo 39.  Mais recentemente, o kit GenomePlex WGA4 Single Cell baseado em PCR e o kit de células únicas baseados em múltiplos deslocamentos (MDA) tornaram-se ferramentas valiosas para experimentos envolvendo análise genética de células humanas únicas, bem como cromossomos40-42, incluindo os sistemas de cromossomo B em gafanhotos 37 e gafanhotos 43. Esses dois kits têm vantagens e desvantagens, mas sua aparente superioridade acima de outros sistemas de amplificação disponíveis foi demonstrada 44.
A quantidade de DNA que pode ser obtida a partir de um único cromossomo ou um segmento cromossomo é significativamente menor do que a de um núcleo inteiro. Portanto, microdisseção, amplificação e análise subsequente de um único cromossomo são muito mais desafiadores, especialmente em organismos com genomas pequenos como em Drosophila ou Anopheles.  Embora as tintas tenham sido desenvolvidas a partir de cromossomos microdissectados únicos de um humano 33 e uma vespa 45,um experimento de peixe bem sucedido exigiu cromossomos mitotísticos microdissectados múltiplos (pelo menos 10-15) microdissectados de uma mosca-das-frutas 11. No entanto, a capacidade de microdissistlar e amplificar um único cromossomo seria importante para (i) reduzir a chance de contaminação com material de um cromossomo diferente, (ii) minimizar o número de preparações cromossômicas necessárias para microdisseção, (iii) redução do nucleotídeo e polimorfismo estrutural da amostra microdissectada tanto em aplicações de PEM quanto de seque. Cromossomos de politenso encontrados em muitas espécies dipteranas oferecem uma oportunidade única de adquirir uma quantidade inicial muito maior de DNA. Eles também fornecem uma estrutura de resolução e cromossomos mais elevada que não pode ser alcançada através do uso de cromossomos mitóticos. Essa resolução adicional pode ser fundamental na visualização de rearranjos cromossômicos, estrutura cromatina e segmentos cromossômicos a serem microdissectados 28,46.
Aqui apresentamos um procedimento para isolar eficientemente um segmento eucromático de um único braço cromossomo de politeno, amplificar o DNA e usá-lo em aplicações de PEIXEs a jusante em mosquitos da malária.  Primeiro, aplicamos LCM para isolar e extrair um único braço cromossomo de lâminas de membrana especialmente preparadas. Segundo, a WGA é usada para amplificar o DNA do material microdisstado. Em terceiro lugar, hibridizamos o DNA amplificado em experimentos de PEIXE para preparações de esmagamento de politenso 47, lâminas de cromossomo metafase e interfase 48,bem como amostras de montagem inteiras de ovário 3D. Este procedimento foi feito para pintar com sucesso a maioria da eucromatina em braços cromossômicos de An. gambiae.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="562">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">A491-212</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Methanol</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:120px;">A412-4</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Propionic acid&#160;</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">402907</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Membrane slides 1.0 PET</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;">415190-9051-000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Buffer tablets &#8220;GURR&#8221;</td>
			<td style="width:112px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">10582-013</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">KaryoMAX Giemsa Stain</td>
			<td style="width:112px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">10092-013</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">ThermoBrite Slide Denaturation/Hybridization System</td>
			<td style="width:112px;">Abbott Molecular</td>
			<td style="width:120px;">30-144110</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Vacufuge vacuum concentrator</td>
			<td style="width:112px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:120px;">22820001</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">Spectroline Microprocessor-Controlled UV Crosslinker XL-1000</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">11-992-89</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:59px;width:191px;">Thermo Scientific NanoDrop</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">ND-2000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">REPLI-g Single Cell Kit</td>
			<td style="width:112px;">Qiagen</td>
			<td style="width:120px;">150343</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:191px;">GenomePlex Single Cell Kit (WGA4)</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">WGA4-10RXN</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">GenomePlex WGA Reamplification Kit (WGA3)</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">WGA3-50RXN</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:191px;">MZ6 Leica stereomicroscope</td>
			<td style="width:112px;">Leica</td>
			<td style="width:120px;">VA-OM-E194-354</td>
			<td style="width:139px;">A different stereomicroscope can be used</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">Olympus CX41 Phase Microscope</td>
			<td style="width:112px;">Olympus</td>
			<td style="width:120px;">CX41RF-5</td>
			<td style="width:139px;">A different phase microscope can be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">PALM MicroBeam Laser Microdissection Microscope</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Thermomixer</td>
			<td style="width:112px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:120px;">22670000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">10x PBS</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:120px;">P5493</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">50x Denhardt&#8217;s solution</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">D2532</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">99% Formamide</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP227500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Dextran sulfate sodium salt</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td style="width:120px;">D8906</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">20x SSC buffer</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:120px;">AM9765</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">ProLong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:120px;">P-36931</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">dATP, dCTP, dGTP, dTTP</td>
			<td style="width:112px;">Fermentas</td>
			<td style="width:120px;">R0141, R0151, R0161, R0171</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Cy3-dUTP, Cy5-dUTP</td>
			<td style="width:112px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:120px;">PA53022, PA55022</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">BSA</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">A3294</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">DNA polymerase I</td>
			<td style="width:112px;">Fermentas</td>
			<td style="width:120px;">EP0041</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">DNase I&#160;</td>
			<td style="width:112px;">Fermentas</td>
			<td style="width:120px;">EN0521</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Spermine</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">S3256-1G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Spermidine</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">S0266-1G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP366-500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP3581</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">EGTA</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">E0396-25G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">PIPES</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">P6757-25G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">EDTA</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">S311-500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Digitonin</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">D141-100MG</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Triton-X100</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP151-100</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">AdhesiveCap 500 clear</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;">415190-9211-000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">QIAamp DNA Micro Kit (50)</td>
			<td style="width:112px;">Qiagen</td>
			<td style="width:120px;">56304</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Genomic DNA Clean and Concentrator Kit</td>
			<td style="width:112px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:120px;">D4010</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">37% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">F79-500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

2d and 3d chromosome painting in malaria mosquitoes

A hibridização fluorescente in situ (FISH) de sondas cromossômicas de braço inteiro é uma técnica robusta para mapear regiões genômicas de interesse, detectar rearranjos cromossômicos e estudar a organização tridimensional (3D) de cromossomos no núcleo celular. O advento da microdissecção de captura a laser (LCM) e da amplificação do genoma inteiro (WGA) permite obter grandes quantidades de DNA a partir de células únicas. O aumento da sensibilidade dos kits WGA nos levou a desenvolver tintas cromossômicas e usá-las para explorar a organização cromossômica e a evolução em organismos não-modelo. Aqui, apresentamos um método simples para isolar e amplificar os segmentos eucromáticos de braços cromossomos de politento único de células enfermeiras ovarianas do mosquito africano da malária Anopheles gambiae. Este procedimento fornece uma plataforma eficiente para a obtenção de tintas cromossômicas, ao mesmo tempo em que reduz o risco global de introdução de DNA estranho à amostra. O uso de WGA permite várias rodadas de re-amplificação, resultando em altas quantidades de DNA que podem ser utilizadas para múltiplos experimentos, incluindo 2D e 3D FISH. Demonstramos que as tintas cromossômicas desenvolvidas podem ser usadas com sucesso para estabelecer a correspondência entre porções eucromáticas de braços de politeno e cromossomo mitomático em An. gambiae. No geral, a união de LCM e WGA de cromossomo único fornece uma ferramenta eficiente para criar quantidades significativas de DNA alvo para futuros estudos citogenéticos e genômicos.

A Figura 1 descreve o fluxo global do protocolo descrito neste artigo.  O usuário começa inicialmente por amostras de DNA de cromossomo microdissectante de lâminas de membrana.  O material microdissectado é extraído e purificado. O DNA purificado é então amplificado, re amplificado, rotulado e, em seguida, usado para fish para rotular spreads cromossomos.
O protocolo LCM pode ser dividido em três etapas gerais: 1) Encontrar cromossomos de interesse e preparar a região para corte(Figura 2A), 2) Cortar e catapultar a região cromossômica de interesse via laser(Figura 2B) e 3) Verificar se a amostra é realmente catapultada em tampa adesiva(Figura 2C). O processo de LCM usado nos cromossomos de politeno de an. gambiae Sua é mostrado no Vídeo 1. O vídeo detalha todo o processo desde o início do programa, incluindo importantes funções e dicas de software.
Os kits WGA de célula única GenomePlex e REPLI-g usados neste protocolo diferem muito no tamanho do produto resultante, bem como no rendimento geral.  A Figura 3 mostra os resultados da eletroforese de gel para os kits GenomePlex e REPLI-g, bem como a quantificação das amostras por Nanodrop.
O material microdissectado tem sido usado para criar sondas FISH que visam regiões eucromáticas de um cromossomo.  Figura 4 demonstra PEIXE de cinco sondas geradas a partir de material microdisstado em cromossomos de politenso de An. gambiae.  Quatro braços autossômicos foram rotulados com três fluoroforos usando o kit WGA3: o cromossomo 3R é rotulado em verde (fluoresceína), o cromossomo 3L está em uma mistura de vermelho (Cy-3) e amarelo (Cy-5), o cromossomo 2R está em amarelo (Cy-5), e o cromossomo 2L está em vermelho (Cy-3). O cromossomo X foi rotulado em laranja (Cy-3) usando nick-tradução do material REPLI-g em um experimento separado. Para estabelecer a correspondência entre porções eucromáticas de braços cromossomos politenso e mitotísticos, as tintas cromossômicas foram hibridizadas para interfase, prophase, prometaphase e cromossomos metafase de An. gambiae (Figura 5).  Para visualizar a organização 3D de um único braço cromossomo de politenso no núcleo celular, o monte peixinho inteiro foi realizado em an. gâmbiae Suas strain ovarian nurse cell (Vídeo 2).  Territórios de braço cromossomo distintos são claramente vistos em núcleos com cromossomos interfase(Figura 5D) e politentos (Vídeo 2).
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig1.jpg"> Figura 1. Representação esquemática dos procedimentos experimentais para a preparação de tintas cromossômicas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem maior.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig2.jpg"> Figura 2. Os principais passos na microdisseção do cromossomo. A) Corte assistido a laser da região cromossômica de interesse através da membrana. B) A membrana com um orifício após a catapultação é realizada. C) A visão da peça catapultada da membrana com um segmento cromossômico nele preso à tampa adesiva. A seta indica a heterocromatina do cromossomo X que permaneceu no slide. O asterisco mostra um pedaço de outro cromossomo que permaneceu no escorregador. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem maior.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig3.jpg"> Figura 3. Imagens de gel de Agarose mostrando DNA após a WGA. A) BAIXO peso molecular (200-500 bp) DNA do braço 3R após o uso dos kits WGA4 e WGA3 GenomaPlex. B) DNA de alto peso molecular (10-20 kb) do braço 2L após amplificação REPLI-g. A escada de 100 bp é mostrada nas faixas da esquerda. As tabelas abaixo das imagens em gel mostram concentrações de DNA medidas por Nanodrop. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem maior.</a>
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig4.jpg"> Figura 4. Pintura de cromossomos de politenso de células enfermeiras ovarianas de An. gambiae usando quatro sondas geradas a partir de material microdisstado. O cromossomo X é rotulado em laranja (Cy-3) por tradução de nick do material REPLI-g. O braço 2R é rotulado em amarelo (Cy-5); o braço 2L está em vermelho (Cy-3); o braço 3R é rotulado em verde (fluoresceína); o braço 3L é rotulado em uma mistura de vermelho (Cy-3) e amarelo (Cy-5). Os autossómos são rotulados com o kit de amplificação WGA3. Chromatina está manchada em azul (DAPI). Nomes de cromossomos são colocados perto de regiões teloméricas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem maior.</a>
<img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig5.jpg"> Figura 5. Pintura de cromossomos interfase (A), prophase (B), prometaphase (C) e metafase (D) de discos imagináveis larvais da cepa An. gambiae Mopti usando três sondas geradas a partir de material microdissectado rotulado por WGA3. O braço 2R é rotulado em verde (fluoresceína); o braço 2L está sem rótulo; o braço 3R está em rosa, uma mistura de vermelho (Cy-3) e laranja (Cy-5); o braço 3L é rotulado em laranja (Cy-5). O cromossomo X tem uma etiqueta vermelha correspondente à sonda rDNA 18S. Chromatina está manchada em azul (DAPI). Regiões manchadas de cromossomos correspondem à heterocromatina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig5highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem maior.</a>
Vídeo 1. O processo de LCM dos cromossomos de politeno an. gambiae. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/Sharakhov_video1.mp4" target="_blank">Clique aqui para ver o vídeo 1.</a>
Vídeo 2. Montagem inteira 3D FISH realizado em células enfermeiras ovarianas an. gambiae. A sonda é rotulada em Cy-3 (retratada em azul) e foi feita a partir de um braço cromossomo 2R microdissectado.  Chromatina foi manchada com DAPI e é representada por pseudo-coloração ciano (azul claro). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/Video2.avi" target="_blank">Clique aqui para ver o vídeo 2.</a>

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2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

A pintura cromossômica é um método útil para estudar a organização do núcleo celular e a evolução do karyótipo. Aqui, demonstramos uma abordagem para isolar e amplificar regiões específicas de interesse de cromossomos de politenso único que são posteriormente usados para fluorescentes bi e tridimensionais em hibridização in situ (FISH).

Pintura de cromossomo 2D e 3D em mosquitos da malária

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

2d-and-3d-chromosome-painting-in-malaria-mosquitoes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

Um Protocolo de Chelex simples para extração de DNA de<em&gt; Anopheles</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Imunologia e Infecção

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes. Investigation of transcripts and gene regulators that are expressed in tissues in which the mosquito host and pathogen interact, and in organs involved in reproduction are of great interest for strategies to reduce mosquito-borne disease transmission and disrupt egg development. A number of tools have been employed to study and validate the temporal and tissue-specific regulation of gene expression. Here, we describe protocols that have been developed to obtain spatial information, which enhances our understanding of where specific genes are expressed and their products accumulate. The protocol described has been used to validate expression and determine accumulation patterns of transcripts in tissues related to mosquito-borne pathogen transmission, such as female salivary glands, as well as subcellular compartments of ovaries and embryos, which relate to mosquito reproduction and development. 
 The following procedures represent an optimized methodology that improves the efficiency of various steps in the protocol without loss of target-specific hybridization signals. Guidelines for RNA probe preparation, dissection of soft tissues and the general procedure for fixation and hybridization are described in Part A, while steps specific for the collection, fixation, pre-hybridization and hybridization of mosquito embryos are detailed in Part B.

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Temporal and spatial gene expression analyses have a crucial role in functional genomics. Whole-mount hybridization in situ is useful for determining the localization of transcripts within tissues and subcellular compartments. Here we outline a hybridization in situ protocol with modifications for specific target tissues in mosquitoes.

Hibridização<em&gt; In situ</em&gt; Das glândulas salivares, ovários e embriões de mosquitos vetores

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. One important application of this method is the development of high-quality physical maps useful for improving the genome assemblies for various organisms. The natural banding pattern of polytene and mitotic chromosomes provides guidance for the precise ordering and orientation of the genomic supercontigs. Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, a well-established chromosome-based mapping technique has been developed only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes 1. As a result of genome mapping efforts, 88% of the An. gambiae genome has been placed to precise chromosome positions 2,3 . Two other mosquito genera, Aedes and Culex, have poorly polytenized chromosomes because of significant overrepresentation of transposable elements in their genomes 4, 5, 6. Only 31 and 9% of the genomic supercontings have been assigned without order or orientation to chromosomes of Ae. aegypti 7 and Cx. quinquefasciatus 8, respectively. Mitotic chromosome preparation for these two species had previously been limited to brain ganglia and cell lines. However, chromosome slides prepared from the brain ganglia of mosquitoes usually contain low numbers of metaphase plates 9. Also, although a FISH technique has been developed for mitotic chromosomes from a cell line of Ae. aegypti 10, the accumulation of multiple chromosomal rearrangements in cell line chromosomes 11 makes them useless for genome mapping. Here we describe a simple, robust technique for obtaining high-quality mitotic chromosome preparations from imaginal discs (IDs) of 4th instar larvae which can be used for all three genera of mosquitoes. A standard FISH protocol 12 is optimized for using BAC clones of genomic DNA as a probe on mitotic chromosomes of Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus, and for utilizing an intergenic spacer (IGS) region of ribosomal DNA (rDNA) as a probe on An. gambiae chromosomes. In addition to physical mapping, the developed technique can be applied to population cytogenetics and chromosome taxonomy/systematics of mosquitoes and other insect groups.

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, physical genome mapping techniques were established only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes. For the genera of Aedes and Culex, however, cytogenetic mapping remains challenging because of the poor quality of polytene chromosomes. Here we present a universal protocol for obtaining high-quality preparations of mitotic chromosomes and an optimized FISH protocol for all three genera of mosquitoes.

Fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; Hibridação em cromossomos mitóticos de mosquitos

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency and type of chromosome aberrations in different cell types allows defects in DNA repair pathways to be elucidated. Understanding mammalian DNA repair biology has been greatly helped by the production of mice with knockouts in specific genes. The goal of this protocol is to quantify genomic instability in mouse B lymphocytes. Labeling of the telomeres using PNA-FISH probes (peptide nucleic acid - fluorescent in situ hybridization) facilitates the rapid analysis of genomic instability in metaphase chromosome spreads. B cells have specific advantages relative to fibroblasts, because they have normal ploidy and a higher mitotic index. Short-term culture of B cells therefore enables precise measurement of genomic instability in a primary cell population which is likely to have fewer secondary genetic mutations than what is typically found in transformed fibroblasts or patient cell lines.

DNA repair pathways are essential for maintenance of genomic integrity and preventing mutation and cancer. The goal of this protocol is to quantify genomic instability by direct observation of chromosome aberrations in metaphase spreads from mouse B cells using fluorescent in situ hybridization (FISH) for telomeric DNA repeats.

Rápida análise de aberrações cromossômicas em linfócitos B mouse por PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria

Despite decades of eradication efforts, malaria remains a global burden. Recent renewed interest in regional elimination and global eradication has been accompanied by increased genomic information about Plasmodium parasite species responsible for malaria, including characteristics of geographical populations as well as variations associated with reduced susceptibility to anti-malarial drugs.
One common genetic variation, single-nucleotide polymorphisms (SNPs), offers attractive targets for parasite genotyping. These markers are useful not only for tracking drug resistance markers but also for tracking parasite populations using markers not under drug or other selective pressures.
SNP genotyping methods offer the ability to track drug resistance as well as to fingerprint individual parasites for population surveillance, particularly in response to malaria control efforts in regions nearing elimination status.
While informative SNPs have been identified that are agnostic to specific genotyping technologies, high-resolution melting (HRM) analysis is particularly suited to field-based studies. Compared to standard fluorescent-probe based methods that require individual SNPs in a single labeled probe and offer at best 10% sensitivity to detect SNPs in samples that contain multiple genomes (polygenomic), HRM offers 2-5% sensitivity. Modifications to HRM, such as blocked probes and asymmetric primer concentrations as well as optimization of amplification annealing temperatures to bias PCR towards amplification of the minor allele, further increase the sensitivity of HRM. While the sensitivity improvement depends on the specific assay, we have increased detection sensitivities to less than 1% of the minor allele.
In regions approaching malaria eradication, early detection of emerging or imported drug resistance is essential for prompt response. Similarly, the ability to detect polygenomic infections and differentiate imported parasite types from cryptic local reservoirs can inform control programs.
This manuscript describes modifications to high resolution melting technology that further increase its sensitivity to identify polygenomic infections in patient samples.

While high resolution melting analysis offers the ability to differentiate between single nucleotide polymorphisms in a heterogeneous population, mutant allele amplification bias can increase its ability to detect alleles present at relatively low percentages within a sample. This protocol describes improvements that improve the sensitivity of high resolution melting analysis.

Métodos para aumentar a sensibilidade de alta resolução de derretimento Single Nucleotide Polymorphism Genotipagem em Malária

Despite decades of eradication efforts, malaria remains a global burden. Recent renewed interest in regional elimination and global eradication has been ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

Um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo para medição de respostas imunes a Malária no Contexto do HIV co-infecção

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible for most malaria-related deaths globally. Several factors including parasite sequestration in tissues, vascular dysfunction, and inflammatory responses influence the evolution of the disease in malaria-infected people. P. falciparum-infected red blood cells (iRBCs) release small extracellular vesicles (EVs) containing different kinds of cargo molecules that mediate pathogenesis and cellular communication between parasites and host. EVs are efficiently taken up by cells in which they modulate their function. Here we discuss strategies to address the role of EVs in parasite-host interactions. First, we describe a straightforward method for labeling and tracking EV internalization by endothelial cells, using a green cell linker dye. Second, we report a simple way to measure permeability across an endothelial cell monolayer by using a fluorescently labeled dextran. Finally, we show how to investigate the role of small non-coding RNA molecules in endothelial cell function.

In this work, we describe protocols to investigate the role of extracellular vesicles (EVs) released by Plasmodium falciparum infected erythrocytes. In particular, we focus on the interactions of EVs with endothelial cells.

Avaliação da função de vesículas extracelulares durante a infecção da malária

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines and/or antivirals have underscored the urgent need to develop ZIKV reverse genetic systems to facilitate the study of ZIKV biology and the development of therapeutic and/or prophylactic approaches. However, like with other flaviviruses, the generation of ZIKV full-length infectious cDNA clones has been hampered due to the toxicity of viral sequences during its amplification in bacteria. To overcome this problem, we have developed a nontraditional approach based on the use of bacterial artificial chromosomes (BACs). Using this approach, the full-length cDNA copy of the ZIKV strain Rio Grande do Norte Natal (ZIKV-RGN) is generated from four synthetic DNA fragments and assembled into the single-copy pBeloBAC11 plasmid under the control of the human cytomegalovirus (CMV) immediate-early promoter. The assembled BAC cDNA clone is stable during propagation in bacteria, and infectious recombinant (r)ZIKV is recovered in Vero cells after transfection of the BAC cDNA clone. The protocol described here provides a powerful technique for the generation of infectious clones of flaviviruses, including ZIKV, and other positive-strand RNA viruses, particularly those with large genomes that have stability problems during bacterial&#160;propagation.

The recent epidemic of Zika virus highlights the importance of establishing reverse genetic approaches to develop vaccines and/or therapeutic strategies. Here, we describe the protocol to rescue an infectious recombinant Zika virus from a full-length cDNA clone assembled in a bacterial artificial chromosome under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter.

Resgate do vírus Zika recombinante de um clone de cDNA de cromossomo artificial bacteriano

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

Análises de competência vetorial sobre mosquitos Aedes aegypti que usam zika vírus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of disease cases each year. E. aedis causes mortality and reduced reproductive fitness in the mosquito vector and has been explored for its potential as a biocontrol agent. The protocol we present for culturing E. aedis is based on its natural infection cycle, which involves both horizontal and vertical transmission at different life stages of the mosquito host. Ae. aegypti mosquitoes are exposed to spores in the larval stage. These infected larvae then mature into adults and transmit the parasite vertically to their offspring. Infected offspring are then used as a source of spores for future horizontal transmission. Culturing E. aedis can be challenging to the uninitiated given the complexities of the parasite&#8217;s life cycle, and this protocol provides detailed guidance and visual aids for clarification.

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

A protocol to culture the microsporidian parasite Edhazardia aedis. The parasite is passaged from one generation of Aedes aegypti mosquitoes to the next via horizontal transfer at the larval stage followed by vertical transmission at the adult stage. Live sporoplasms survive long-term in infected eggs.

Propagação do Parasita Microsporidiano Edhazardia aedis em Mosquitos Aedes aegypti

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of ...