Name: 2d and 3d chromosome painting in malaria mosquitoes
Uploaded: 2014-01-06T17:30:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about 2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантом Национальных институтов здравоохранения 1R21AI094289 Игорю В. Шарахову

Авторов нечего раскрывать.

Есть несколько шагов, критически важных для успешного усиления ДНК из микродиссектных образцов политеной хромосомы. Протокол использует LCM, метод, который как повышает общую эффективность и снижает воздействие чужой ДНК путем удаления взаимодействия физических инструментов с образцом. Тем не менее, усиление чужой ДНК по-прежнему является самой большой потенциальной ловушкой этого эксперимента. Таким образом, в течение всего процесса необходимо держать образцы защищенными от загрязнения. На протяжении всего слайд подготовки и микродиссекции фазы, важно, чтобы этанол мыть вскрытия иглы, слайды, крышка скользит, а также рабочее пространство.  Также рекомендуется уфимец обработать все применимое оборудование (иглы, горки, крышки) перед использованием.
Мембрана на слайдах вскрытия делает распространение хромосом очень трудным.  Важно использовать больше яичников (половина до полной пары яичников) при принятии этих слайдов, чтобы обеспечить больше шансов найти хорошо распространения ядра.  Также рекомендуется использовать свежие ткани при создании слайдов, так как показатели усиления, как представляется, падают, как ткани возрасте 49 лет и хромосомы распространения становится все более сложной задачей.  Подготовка слайдов для микропересмешки является наиболее трудоемким шагом в этом протоколе.  Хромосомы должны быть хорошо распространены, чтобы избежать случайного приобретения нежелательного материала.  Окрашивание Giemsa позволяет пользователю проверить качество распространения с помощью фазового контрастного микроскопа перед использованием системы микропереписьа.
Сочетание микродиссеции и усиления дает возможность извлекать и анализировать хромосомные фрагменты размером от небольших областей, представляющих интерес для большинства вооружений.  Этот протокол позволяет пользователю получить ДНК из морфологически различных регионов, таких как инверсии, специфические эвхроматические полосы и интербанды, теломерные, центрометрические и межкалорийные хетерохроматин. Пользователь может применить генерируемые зонды живописи к изучению аномальных хромосом, изучению меж видам гомологии в определенных локусах или характеристике пространственной организации хромосом в нетронутом 3D ядре. Для разработки хромосомных красок мы выбрали эухроматические сегменты, чтобы избежать гибридизации повторяющейся ДНК с несколькими хромосомными областями. В результате мы получили картину, специфичную для рук, без использования конкурента, например, геномнуюДНК или фракцию ДНКC 0 t-1.
Мы решили использовать GenomePlex WGA и REPLI-G комплекты на основе обзоров, которые сравнили эффективность и уровень отсева нескольких комплектов усиления 40,44.  Оба комплекта показали лучшие результаты среди доступных методов в обоих отсева (GenomePlex был 12,5% ставка по сравнению с REPLI-G в 37,5%) и процент усиленных маркеров (GenomePlex имел 45,24% уровень усиления против 30,0%) 40.Комплект GenomePlex также предоставил большее количество ДНК, и, таким образом, сделал его лучшим кандидатом для нескольких методов вниз по течению.  Также имеется комплект для повторного усиления системы GenomePlex, позволяющий еще больше подколоть ДНК. Однако важно отметить, что усиление не является совершенным.  Остается возможность того, что успешное усиление может привести к ошибкам или иметь уклон в сторону конкретных локусов в целевой ДНК. Важно рассмотреть окончательный размер фрагмента имеющихся методов усиления генома.  Фрагментация GenomePlex приводит к библиотеке с фрагментами от 200-500 bp, в то время как комплект REPLI-g производит фрагменты размером примерно 10-20 кб. Предполагаемое применение этого протокола ниже по течению является FISH, что делает комплект GenomePlex более осуществимым вариантом, поскольку он обеспечивает желаемый размер фрагмента и возможность маркировать фрагменты ДНК непосредственно через WGA. Длинные молекулы ДНК, производимые усилением REPLI-g, должны быть фрагментированы в реакции маркировки ник-перевода ниже по течению.
Этот протокол был адаптирован для успешного усиления ДНК из одной руки политеной хромосомы.  Другие протоколы требуют объединения многих (обычно 10-30) фрагментов хромосом для того, чтобы успешно усилить образец 7,11,28,40.  Хотя объединение нескольких хромосом возможно с помощью нашего метода, повышенная вероятность загрязнения образца подчеркивает важность начала эксперимента с как можно меньше хромосом. Если политен хромосомы не доступны, наш протокол может быть адаптирован для использования в митотических хромосомах. Это может быть необходимо, однако, объединить 10-15 митотических хромосом до усиления для успешного FISH 11. Смещение усиления ниже с большим количеством исходного шаблона DNA 50. Политеновые хромосомы обеспечивают приблизительно 512 копий одной последовательности ДНК и 1024 копии двух гомологичные последовательности ДНК.  Таким образом, объединение митотических хромосом поможет повысить общее качество продукта ДНК после усиления.
Эта процедура имеет много потенциальных применений в цитогенетических и геномных исследованиях. Здесь мы использовали хромосомные краски для установления соответствия между эухроматических сегментов политен и митотической хромосомы оружия в An. gambiae. Те же зонды живописи могут быть применены к цитогенетическим характеристикам линий клеток An. gambiae. Обширные геномные перестановки и изменения в числах хромосом являются общими особенностями клеточных линий 51,52. Анеуплоидия, полиплоидия и хромосомные перестановки, такие как транслокации, инверсии, удаления и кольцевые хромосомы были обнаружены в различных линиях клеток комаров 53,54. Классические цитогенетические наблюдения 55 и физическое картирование 56 продемонстрировали возникновение хромосомных транслокаций в эволюции малярийных комаров. Таким образом, микродиссектный материал может быть использован в сочетании с экспериментами FISH для сравнения гомологии хромосомных областей между видами. Мы успешно выполнили 3D FISH с 2R-картинным зондом на политеновых хромосомах в клетках медсестры в целом. Этот метод облегчит отслеживание хромосомных траекторий и изучение ядерной архитектуры в Anopheles. Такие методы, как генотипирование ДНК 57,58, секвенирование генома следующего поколения 26,27, физическое и соединение карты развития, и генерации зондов для хромосомной живописи 33,59 все могут извлечь выгоду из руки и региона конкретных микродиссекции. Объединив технологию LCM и продвигая одноклеточную WGA, мы демонстрируем эффективный, практичный метод производства разумного количества ДНК из одной политеной хромосомы руки.

Хромосомная живопись является полезным методом для изучения эволюции кариотипов 1-5 и для визуализации цитогенетических аномалий с помощью гибридизации флуоресцентно помечены хромосомной ДНК 1,6-8. Этот метод также применяется к изучению 3D-динамики хромосомных территорий в развитии 9 и патологии 10. Дифференциально помеченные хромосомные краски используются для визуализации отдельных митотических 11,12, мейотических 13,14или межфазных нелифазных не политен 15,16 и политен 9,11,17 хромосом. Простой и надежный протокол для получения хромосомных красок был бы очень полезен в распространении этого метода на не моделевые организмы, такие как комары. Комплекс Anopheles gambiae – это группа из семи морфологически неразличимых комаров, которые различаются по поведению и адаптации, включая способность передавать малярию.  Эти комары служат отличной моделью, чтобы лучше понять эволюцию тесно связанных видов, которые сильно отличаются по своей векторной способности.  Большинство цитогенетических исследований малярийных комаров были проведены с использованием хорошо развитых, высоко политенизированных хромосом (рассмотрено в 18,19). Читаемые модели полос поликретных хромосом позволили исследователям продемонстрировать связь между полиморфными инверсиями и экологической адаптацией в Anopheles gambiae 20. Кроме того, в комплексе An. macullipennis были охарактеризованы специфические для тканей 21 и видоспецифические 22 особенности 3D-политеной хромосомы. Тем не менее, изучение митотических хромосом может предоставить дополнительную важную информацию. Например, более высокий уровень полиморфизма гетерохроматина, наблюдаемый в митотических хромосомах, коррелирует со снижением брачной активности и фертильности в An. gambiae 23. Переписку между эвхроматическими сегментами политеных и митотических хромосомных рук трудно установить только путем сравнения их относительной длины. Это потому, что хетерохроматин составляет значительную часть митотических хромосом, но недопредставлен в политенные хромосомы 24. Наличие хромосомных красок для малярийных комаров позволит исследователям значительно расширить цитогенетические исследования, включив в нее дополнительные виды, при этом существенно сократив затраты и время при анализе кариотипической эволюции и 3D-динамики хромосом в этой группе эпидемиологиологически важных насекомых.
Для того, чтобы получить большие участки хромосом, микроперемида стала неотъемлемой техникой для манипулирования и изоляции конкретных областей, представляющих интерес для хромосомного дополнения.  В сочетании с усилением всего генома (WGA), микроперемида приводит к мощным приложениям вниз потечению,включая FISH 11,12 и секвенирование генома следующего поколения 25-27. Ранее методика требовала использования специализированных микропересмешования игл, которыми должен был управлять опытный пользователь 28.  Развитие микродиссеции лазерного захвата (LCM) привело к упрощенному инструменту, лучше подходящему для изоляции одиночных клеток 29,30 или отдельных хромосом 31-33 с уменьшенным риском заражения. Такой подход позволяет пользователю изучать генетические неоднородности и хромосомные аномалии, которые происходят в одиночных клетках, вместо консенсусного ландшафта, который является результатом объединения нескольких клеток вместе 34-36. Для усиления ДНК, образоваемой в результате микропересовок, было использовано несколько методов.  DOP-PCR, метод, полезный для усиления высоко повторяющихся последовательностей, был использован для усиления микродиссекции хромосом от видов, включая кузнечика 37, колючий угорь 38, и Нил тилапии 39.  Совсем недавно, PCR основе GenomePlex WGA4 одноклеточный комплект и несколько усиления смещения на основе (MDA) Repli-G одноклеточный комплект стали ценными инструментами для экспериментов, связанных с генетическим анализом одиночныхклеток человека, а также хромосомы 40-42, в том числе B хромосомных систем в кузнечиков 37 и саранчи 43. Эти два комплекта имеют преимущества и недостатки, но их явное превосходство над другими доступными системами усиления было продемонстрировано 44.
Количество ДНК, которое может быть получено из одной хромосомы или хромосомного сегмента, значительно меньше, чем у целого ядра. Поэтому микроперемиск, усиление и последующий анализ одной хромосомы являются гораздо более сложными, особенно в организмах с небольшими геномами, как в Drosophila или Anopheles.  Хотя краски были разработаны из одного микродиссектных хромосом человека 33 и оса 45, успешный эксперимент FISH требует нескольких (по крайней мере 10-15) микродиссектных митотических хромосом плодовой мухи 11. Тем не менее, способность к микродизайзацию и усиление одной хромосомы будет иметь важное значение для i) снижение вероятность загрязнения материалом из другой хромосомы, (ii) минимизации числа хромосомных препаратов, необходимых для микродиссции, (iii) снижение нуклеотида и структурного полиморфизма микродиссекции образца как в FISH, так и в секвенировании вниз по течению. Политене хромосомы, найденные во многих видах диптериан предлагают уникальную возможность приобрести гораздо более высокое исходное количество ДНК. Они также обеспечивают более высокое разрешение и хромосомную структуру, которые не могут быть достигнуты с помощью митотических хромосом. Это добавленное разрешение может иметь решающее значение для визуализации хромосомных перестановок, хроматиновой структуры и хромосомных сегментов, которые будут микродиссектированы 28,46.
Здесь мы представляем процедуру эффективной изоляции эухроматический сегмент от одной политеной хромосомы руки, усилить ДНК, и использовать его в нижнем течении FISH приложений у малярийных комаров.  Во-первых, мы применяем LCM, чтобы изолировать и извлечь одну хромосомную руку из специально подготовленных мембранных слайдов. Во-вторых, WGA используется для усиления ДНК из микродиссектного материала. В-третьих, мы гибридизируем усиленную ДНК в экспериментах FISH для препаратов из политеного сквоша 47,метафазы и межфазной хромосомы слайдов 48,а также 3D образцов яичников. Эта процедура была сделана, чтобы успешно нарисовать большинство евхроматина в хромосомных руках An. gambiae.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="562">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">A491-212</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Methanol</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:120px;">A412-4</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Propionic acid&#160;</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">402907</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Membrane slides 1.0 PET</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;">415190-9051-000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Buffer tablets &#8220;GURR&#8221;</td>
			<td style="width:112px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">10582-013</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">KaryoMAX Giemsa Stain</td>
			<td style="width:112px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">10092-013</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">ThermoBrite Slide Denaturation/Hybridization System</td>
			<td style="width:112px;">Abbott Molecular</td>
			<td style="width:120px;">30-144110</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Vacufuge vacuum concentrator</td>
			<td style="width:112px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:120px;">22820001</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">Spectroline Microprocessor-Controlled UV Crosslinker XL-1000</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">11-992-89</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:59px;width:191px;">Thermo Scientific NanoDrop</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">ND-2000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">REPLI-g Single Cell Kit</td>
			<td style="width:112px;">Qiagen</td>
			<td style="width:120px;">150343</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:191px;">GenomePlex Single Cell Kit (WGA4)</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">WGA4-10RXN</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">GenomePlex WGA Reamplification Kit (WGA3)</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">WGA3-50RXN</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:191px;">MZ6 Leica stereomicroscope</td>
			<td style="width:112px;">Leica</td>
			<td style="width:120px;">VA-OM-E194-354</td>
			<td style="width:139px;">A different stereomicroscope can be used</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">Olympus CX41 Phase Microscope</td>
			<td style="width:112px;">Olympus</td>
			<td style="width:120px;">CX41RF-5</td>
			<td style="width:139px;">A different phase microscope can be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">PALM MicroBeam Laser Microdissection Microscope</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Thermomixer</td>
			<td style="width:112px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:120px;">22670000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">10x PBS</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:120px;">P5493</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">50x Denhardt&#8217;s solution</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">D2532</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">99% Formamide</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP227500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Dextran sulfate sodium salt</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td style="width:120px;">D8906</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">20x SSC buffer</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:120px;">AM9765</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">ProLong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:120px;">P-36931</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">dATP, dCTP, dGTP, dTTP</td>
			<td style="width:112px;">Fermentas</td>
			<td style="width:120px;">R0141, R0151, R0161, R0171</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Cy3-dUTP, Cy5-dUTP</td>
			<td style="width:112px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:120px;">PA53022, PA55022</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">BSA</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">A3294</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">DNA polymerase I</td>
			<td style="width:112px;">Fermentas</td>
			<td style="width:120px;">EP0041</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">DNase I&#160;</td>
			<td style="width:112px;">Fermentas</td>
			<td style="width:120px;">EN0521</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Spermine</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">S3256-1G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Spermidine</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">S0266-1G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP366-500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP3581</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">EGTA</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">E0396-25G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">PIPES</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">P6757-25G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">EDTA</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">S311-500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Digitonin</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">D141-100MG</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Triton-X100</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP151-100</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">AdhesiveCap 500 clear</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;">415190-9211-000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">QIAamp DNA Micro Kit (50)</td>
			<td style="width:112px;">Qiagen</td>
			<td style="width:120px;">56304</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Genomic DNA Clean and Concentrator Kit</td>
			<td style="width:112px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:120px;">D4010</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">37% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">F79-500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

2d and 3d chromosome painting in malaria mosquitoes

Флуоресцентная гибридизация на месте (FISH) зондов хромосомы целых рук является надежным методом для картирования геномных областей, представляющих интерес, обнаружения хромосомных перестановок и изучения трехмерной (3D) организации хромосом в ядре клетки. Появление микродиссеции захвата лазера (LCM) и усиления всего генома (WGA) позволяет получать большое количество ДНК из одиночных клеток. Повышенная чувствительность комплектов WGA побудила нас разработать хромосомные краски и использовать их для изучения организации хромосом и эволюции в не моделных организмах. Здесь мы представляем простой метод для изоляции и усиления эухроматических сегментов одной политенской хромосомы оружия из яичников клетки медсестры африканского малярийного комара Anopheles gambiae. Эта процедура обеспечивает эффективную платформу для получения хромосомных красок, уменьшая при этом общий риск введения в образец иномаенной ДНК. Использование WGA позволяет несколько раундов повторного усиления, в результате чего большое количество ДНК, которые могут быть использованы для нескольких экспериментов, в том числе 2D и 3D FISH. Мы показали, что разработанные хромосомные краски могут быть успешно использованы для установления соответствия между эвхроматических частей политен и митотической хромосомы оружия в An. gambiae. В целом, объединение LCM и однофомохм WGA обеспечивает эффективный инструмент для создания значительного количества целевой ДНК для будущих цитогенетических и геномных исследований.

На рисунке 1 описывается общий поток протоколов, описанных в данной статье.  Пользователь изначально начинает с микродисразделения образцов хромосомной ДНК с мембранных слайдов.  Микродиссектный материал извлекается и очищается. Очищенная ДНК затем усиливается, усиливается, маркируется, а затем используется для FISH для обозначения хромосомных спредов.
Протокол LCM может быть разбит на три общих шага: 1) Поиск хромосом, представляющих интерес, и подготовка региона к резке(рисунок 2A), 2) Резка и катапультирование хромосомы области интереса с помощью лазера (Рисунок 2B), и 3) Проверка, чтобы определить, если образец на самом деле катапультировался в клей крышку (Рисунок 2C). Процесс LCM, используемый на an. gambiae Sua штамма политен хромосомы показано в видео 1. Видео подробно весь процесс от запуска программы, в том числе важные функции программного обеспечения и советы.
Комплекты GenomePlex и REPLI-g, используемые в этом протоколе, сильно отличаются размером продукта, а также общей урожайностью.  На рисунке 3 показаны результаты гелеобразования, продихаемого для комплектов GenomePlex и REPLI-g, а также количественная оценка образцов Nanodrop.
Микродиссектный материал был использован для создания зондов FISH, которые нацелены на эвхроматические области хромосомы.  На рисунке 4 демонстрируется FISH пяти зондов, генерируемых из микродиссектированного материала на политенных хромосомах An. gambiae.  Четыре аутосомные руки были помечены тремя флюорофорами с использованием комплекта WGA3: 3R-хромосома помечена зеленым цветом (флуорессейн), 3L-хромосома находится в смеси красного (Cy-3) и желтого цвета (Cy-5), 2R-хромосома в желтом цвете (Cy-5), а хромосома 2L в красном цвете (Cy-3). Х-хромосома была помечена оранжевым цветом (Cy-3) с использованием ник-перевода материала REPLI-g в отдельном эксперименте. Для установления соответствия между эвхроматических частей политен и митотических хромосомных рук, хромосомные краски были гибридизированы для интерфазы, профазы, прометафазы и метафазных хромосом An. gambiae (рисунок 5).  Для визуализации 3D-организации одной политеной хромосомы руки в ядре клетки, вся гора FISH была выполнена на An. gambiae Sua штамма яичников клетки медсестры (Видео 2).  Различные хромосомные территории руки хорошо видны в ядрах с интерфазом(рисунок 5D)и политеной (видео 2) хромосомами.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig1.jpg"> Рисунок 1. Схематическое представление экспериментальных процедур по подготовке хромосомных красок. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig1highres.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig2.jpg"> Рисунок 2. Основные шаги в хромосомной микропересмешивании. A) Лазерная резка хромосомной области, представляющих интерес через мембрану. B) Мембрана с отверстием после катапультирования выполняется. C) Вид катапультированной части мембраны с хромосомным сегментом в ней, прикрепленный к клейкой крышке. Стрелка указывает на хетерохроматин Х-хромосомы, который остался на слайде. Звездочка показывает кусок другой хромосомы, которая осталась на слайде. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig2highres.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig3.jpg"> Рисунок 3. Агароза гель изображения, показывающие ДНК после WGA. A) Низкий молекулярный вес (200-500 bp) ДНК от руки 3R после использования комплектов WGA4 и WGA3 GenomePlex. B) Высокий молекулярный вес (10-20 кб) ДНК из руки 2L после усиления REPLI-g. Лестница 100 bp показана в левой полосе движения. Таблицы ниже гель изображения показывают концентрации ДНК измеряется Nanodrop. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig3highres.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.</a>
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig4.jpg"> Рисунок 4. Картина политеных хромосом из клеток медсестры яичников An. gambiae с использованием четырех зондов, генерируемых из микродиссектированного материала. Х-хромосома помечена оранжевым цветом (Cy-3) ник-переводом материала REPLI-g. Рука 2R помечена желтым цветом (Cy-5); 2L рука в красном (Cy-3); 3R рука помечена зеленым цветом (фторсейн); 3L рука помечена в смеси красного (Cy-3) и желтого (Cy-5). Автосомы помечены комплектом усиления WGA3. Хроматин окрашен в синий цвет (DAPI). Названия хромосом расположены вблизи теломерных областей. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig4highres.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.</a>
<img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig5.jpg"> Рисунок 5. Картина межфазы (A), профазы (B), прометафазы (C) и метафазы (D) хромосом из личиночных воображаемых дисков штамма An. gambiae Mopti с использованием трех зондов, генерируемых из микродиссектированного материала, помеченного WGA3. Рука 2R помечена зеленым цветом (флуорессейн); рука 2L не помечена; 3R рука в розовом, смесь красного (Cy-3) и оранжевый (Cy-5); рука 3L помечена оранжевым цветом (Cy-5). Х-хромосома имеет красную метку, соответствующую зонду 18S rDNA. Хроматин окрашен в синий цвет (DAPI). Ярко окрашенные области хромосом соответствуют хетерохроматину. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig5highres.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.</a>
Видео 1. Процесс LCM хромосом An. gambiae polytene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/Sharakhov_video1.mp4" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы просмотреть видео 1.</a>
Видео 2. Целый крепление 3D FISH выполняется на An. gambiae клетки медсестры яичников. Зонд помечен в Cy-3 (изображен синим цветом) и сделан из микродиссектной руки 2R-хромосомы.  Хроматин был окрашен в DAPI и изображен голубой псевдоцветной (светло-голубой). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/Video2.avi" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы просмотреть видео 2.</a>

Watch this Scientific Journal Video about 2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes at JoVE.com

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

Хромосомная живопись является полезным методом для изучения организации ядра клетки и эволюции кариотипа. Здесь мы демонстрируем подход к изоляции и усилению определенных областей интереса от одиночных политеных хромосом, которые впоследствии используются для двух- и трехмерной флуоресцентной гибридизации in situ (FISH).

2D и 3D хромосомная живопись у малярийных комаров

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Простой протокол Chelex для выделения ДНК из<em&gt; Anopheles</em&gt; SPP.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Флуоресцентный<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизации на митотических хромосом от комаров

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Быстрое Анализ хромосомных аберраций в Mouse-лимфоцитов на PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

Протеомный профилирования макрофагов 2D электрофореза

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria

Методы повышения чувствительности с высоким разрешением Melting полиморфизм единичного нуклеотида генотипирования в малярией

Despite decades of eradication efforts, malaria remains a global burden. Recent renewed interest in regional elimination and global eradication has been ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

<em&gt; In Vitro</em&gt; Модель для измерения иммунных ответов на малярией в контексте ВИЧ-инфекцией

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

Оценка функции внеклеточного пузырьков во время инфекции малярии

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone

Спасение рекомбинантного вируса Зика от бактериальной искусственной хромосомы клона

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Анализ компетентности переносчиков комаров Aedes aegypti с использованием вируса Зика

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Распространение микроспоридского паразита Edhazardia aedis у комаров Aedes aegypti

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of ...