Name: 2d and 3d chromosome painting in malaria mosquitoes
Uploaded: 2014-01-06T17:30:00
Duration: 9 min 57 s
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Este trabajo fue apoyado por la subvención de los Institutos Nacionales de Salud 1R21AI094289 a Igor V. Sharakhov

1) Preparación de diapositivas cromosómicas de politeno para la microdisección de captura láser
<ol><li>Diseccione las hembras medio-grávidas de Anopheles en la alimentación de la poste-sangre de 25 horas. Fije los ovarios de aproximadamente cinco hembras en 500 μl de solución fresca modificada de Carnoy (100% metanol: ácido acético glacial, 3:1) a temperatura ambiente durante 24 horas. Transferir ovarios a -20 °C para un almacenamiento a largo plazo.</li>
	<li>Prepare la solución de Carnoy (100% etanol: ácido acético glacial, 3:1) y ácido propiónico al 50% justo antes de hacer diapositivas cromosómicas.</li>
	<li>Coloque un par de ovarios en una gota de la solución de Carnoy en un portaobjetos de membrana zeiss 1.0 PET. Dependiendo del tamaño, divida los ovarios en aproximadamente 2-4 secciones con agujas de disección y colóquelos en una gota de ácido propiónico al 50% en portaobjetos limpios bajo un microscopio de disección.</li>
	<li>Separe los folículos y retire el tejido restante con toalla de papel debajo de un estereomicroscopio de disección. Agregue una nueva gota de ácido propiónico al 50% a los folículos y déjenlos reposar durante 3-5 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Coloque un cubrebocas siliconado en la parte superior de la gota. Deje reposar la diapositiva durante aproximadamente 1 min.</li>
	<li>Cubra la diapositiva con un material absorbente (el papel de filtro se utiliza para este método), y mientras usa el lado del borrador de un lápiz, aplique una generosa cantidad de presión al cubrebocas tocándolo repetidamente con el borrador.</li>
	<li>Caliente la diapositiva a 60 °C en un sistema de desnaturalización/hibridación de la diapositiva durante 15-20 minutos para ayudar a aplanar los cromosomas del politeno. Coloque los portaobjetos en una cámara húmeda a 4 °C durante la noche para permitir que el ácido aplane aún más los cromosomas.</li>
	<li>Colocar portaobjetos en frío al 50% etanol durante 10 min. Retire suavemente el cubrebocas y reemplácelo en frío al 50% de etanol durante 10 min más.</li>
	<li>Deshidrate los portaobjetos en 70%, 90%, 100% etanol durante 5 min cada uno. Toboganes secos al aire.</li>
	<li>Prepare una solución de solución tampón GURR agregando una sola tableta tampón a 1 L de agua destilada. autoclave.</li>
	<li>Prepare la solución de Giemsa añadiendo 1 ml de solución de tinción de Giemsa a 50 ml de tampón GURR.</li>
	<li>Coloque los portaobjetos secados al aire en la solución de Giemsa durante 10 min y lave tres veces en 1X PBS. Se desliza al aire de nuevo en un clima estéril controlado para evitar la contaminación.</li>
</ol>2) Microdisección de captura láser de un solo brazo cromosómico politeno
Esta sección detalla el uso del software PALMRobo, que viene con el sistema de microdisección láser PALM MicroBeam. 
<ol><li>Limpie el microscopio con etanol al 100%. Esterilice guantes y tubos con una luz UV en un reticulculo UV.</li>
	<li>Encienda el microscopio de microdisección láser PALM MicroBeam y encienda el láser. Abra la suite de disección láser, PALMRobo, y configure los ajustes "Power" y "Focus" según sea necesario.</li>
	<li>Búsqueda de brazo de cromosoma politeno de interés.</li>
	<li>Con la herramienta "Lápiz", delinee la región seleccionada.</li>
	<li>Abra la "ventana elementos" desde la barra de menús.</li>
	<li>Seleccione el "Elemento dibujado", asegúrese de que ha seleccionado "Cortar".</li>
	<li>Instale el tubo adhesivo de la tapa en el soporte y colóquelo encima de la corredera, dejando un pequeño espacio <1 mm de tamaño, e inicie el corte con láser.</li>
	<li>Coloque la "selección de catapulta" dentro del sitio de corte, dejando espacio entre el borde y el cromosoma.</li>
	<li>Seleccione "LPC" en la opción desplegable y comience a catapultar.</li>
	<li>Compruebe para asegurarse de que la muestra fue catapultada en la tapa pulsando el icono "Ojo".</li>
</ol>3) Purificación del ADN de un solo brazo cromosómico politético microdissecado
Siga las instrucciones del QIAamp DNA Micro Kit para liberar y purificar el ADN recolectado. El paso 3.1 se modificó para acomodar el tubo invertido. 
<ol><li>Añadir 15 μl tampón ATL y 10 μl de proteinasa K al tubo invertido (dentro de la tapa) e incubar a 56 °C durante 3 horas.</li>
	<li>Añadir 25 μl tampón ATL, 50 μl tampón AL y 1 μl de ARN portador; mezclar. Añadir 50 μl 100% EtOH; mezclar.</li>
	<li>Transferir el lisato a la columna QIAamp; centrífuga. Lavar añadiendo 500 μl de tampón AW1; centrífuga. Coloque la columna en el nuevo tubo de recolección, agregue el tampón de 500 μl AW2; centrífuga. Coloque la columna en un tubo nuevo; centrífuga para eliminar el exceso de líquido.</li>
	<li>Coloque la columna en un tubo de microcentrífuga de 1,5 μl y agregue 20 μl de agua para eluir; centrífuga.</li>
	<li>Evaporar el ADN recién eludido hasta un volumen final de 9 μl usando un vacuumfuge.</li>
</ol>4) Amplificación del ADN de un solo brazo cromosómico polisecado microdissecado
Dos diversos protocolos fueron utilizados para el WGA de un solo brazo del cromosoma. 
<ol><li>Amplificación del ADN y preparación de la sonda a través de GenomePlex WGA<ol>
<li>Siga el protocolo GenomePlex Single Cell WGA4 Kit para producir el primer lote de ADN amplificado:<ol>
<li>Añadir la solución de proteinasa K recién preparada a la muestra de 9 μl; mezclar. Incubar el ADN a 50 °C durante 1 hora, luego calentar a 99 °C durante 4 min. Manténgase en el hielo.</li>
			<li>Agregue 2 μl 1X Single Cell Library Preparation Buffer y 1 μl de Library Stabilization Solution; mezcla. Calentar la muestra a 95 °C durante 2 min. Enfriar sobre hielo y centrífuga.</li>
			<li>Añadir 1 μl de enzima de preparación de biblioteca; mezcla y centrífuga. Incubar de la siguiente manera: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq1.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
			<li>Añadir 7,5 μl 10X Amplificación Master Mix, 48,5 μl de agua. 5,0 μl WGA ADN polimerasa; mezcla y centrífuga.</li>
			<li>Termociclo de la siguiente manera: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq2.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Purificar el ADN utilizando el kit genomic DNA Clean &Concentrator. El protocolo es el siguiente:<ol>
<li>Añadir 5:1 Tampón de unión al ADN:Muestra de ADN (específicamente para ADN genómico de menos de 2 kb. Si el ADN de la muestra es mayor que 2 kb, utilice una relación 2:1) y transfiera a la columna de espín proporcionada. centrífuga.</li>
			<li>Añadir 200 μl de Tampón de lavado de ADN y centrífuga. Repita el paso de lavado. Luego, agregue 50 μl de agua y elua el ADN en un nuevo tubo de 1,5 ml.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Vuelva a amplificar el ADN de la muestra utilizando el kit de reamplificación GenomePlex WGA3 de la siguiente manera:<ol>
<li>Agregue 10 μl de ADN al tubo de PCR (el kit recomienda 10 ng total de ADN) con 49.5 μl de agua, 7.5 μl 10x Amplification Master Mix, 3.0 μl 10 mM DNTP mix, y 5.0 μl WGA DNA Polymerase. Mezcla y centrífuga.</li>
			<li>Utilice el siguiente perfil para la reacción: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq3.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
			<li>Almacene el ADN a -20 °C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Etiquete el ADN para FISH usando el Kit de Reamplificación GenomePlex WGA3 de la siguiente manera:<ol>
<li>Cree una mezcla maestra a partir del kit de reamplificación GenomePlex WGA3 agregando 10 μl de ADN al tubo de PCR con 49,5 μl de agua, 7,5 μl de mezcla maestra de amplificación 10X, mezcla dNTP de 3,0 μl 1 mM (1 mM de dATP, dCTP, dGTP, 0,3 μl 1 mM dTTP - si se usa dUTP etiquetado), 1 μl de 25 nM etiquetado dUTP , y 5,0 μl wga ADN polimerasa.</li>
			<li>Utilice el siguiente perfil para la reacción: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq3.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
			<li>El etanol precipita la sonda etiquetada añadiendo 1/10 el volumen de reacción final (7,5 μl para la reacción de 75 μl) de acetato de sodio de 3 M pH 5,2 y 2-3 volúmenes de etanol al 100%. Enfríe la muestra de ADN a -80 °C durante al menos 30 min.</li>
			<li>Muestra de centrífuga a 4 °C durante 10 min para crear pellets etiquetados y eliminar el sobrenadante y el pellet seco al aire.</li>
			<li>Cree el búfer de hibridación de la siguiente manera: 0,2 g Sulfato de dextrano 1200 μl Formamida desionizada 580 μl H2O 120 μl 20X SSC</li>
			<li>Añadir 40 μl de tampón de hibridación al pellet secado al aire.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Amplificación del ADN y preparación de la sonda a través de REPLI-G Single Cell WGA seguido de nick-translation<ol>
<li>Siga el protocolo REPLI-g Single Cell WGA Kit para producir el ADN amplificado:<ol>
<li>Preparar Buffer D2 (3 μl de 1 M DTT + 33 μl Buffer DLB).</li>
			<li>Mezclar 4 μl de material microdissecado purificado con 3 μl buffer D2. Tubo de flick para mezclar. Incubar durante 10 min a 65 °C. Añadir 3 μl de solución Stop; mezclar.</li>
			<li>Agregue 9 μl H2O, 29 μl REPLI-g Reaction Buffer y 2 μl de REPLI-g ADN Polimerasa a la muestra. Incubar a 30 °C durante 8 hr. Inactivar la ADN polimerasa calentando a 65 °C durante 3 min. Almacene el ADN a -20 °C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Siga el protocolo de traducción de nick para etiquetar el ADN amplificado REPLI-g:<ol>
<li>Prepare la siguiente mezcla de etiquetado: 1 μg de ADN amplificado 5 μl 10X Tampón de ADN polimerasa 5 μl 10X dNTP 5 μl 1X BSA 1 μl 1 mM etiquetado dNTP 4 μl 1 U/μl DNasa I 1 μl 10 U/μl ADN Polimerasa I H2O a 50 μl</li>
			<li>Incubar a 15 °C durante 2 horas. Añadir 2 μl de EDTA de 0,5 M para detener la reacción. Compruebe el tamaño del fragmento de ADN funcionando con gel.</li>
			<li>Siga los pasos de 4.1.4.3-4.1.4.6 para precipitar y solubilizar el pellet.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>5) PESCADO 2D en preparaciones del calabaza del politeno y mitotic del cromosoma
Consulte los protocolos detallados para FISH sobre preparaciones de calabazas de politenos 47 y diapositivas cromosómicas mitóticas 48. Aquí proporcionamos protocolos breves.
<ol><li>FISH en preparaciones de calabaza cromosómica politeno<ol>
<li>Sumerja las diapositivas en 1X PBS durante 20 min en RT. Fijar diapositivas en 4% Paraformaldehído en 1X PBS durante 1 min.</li>
		<li>Deshidrates slides through ethanol washes: 50%, 70%, 90%, 100% for 5 min each at RT. Air-dry slides.</li>
		<li>Preguerra la sonda en tampón de hibridación a 37 °C. Agregue 10-20 μl de sonda para deslizarse. Cubierta con 22 X 22 mm cubrebocas. Presione las burbujas de aire con una punta de pipeta.</li>
		<li>Desnaturalizar los cromosomas y sondear a 90 °C durante 10 min. Selle los bordes de la cubierta con cemento de goma. Transferir el portaobjetos a la cámara húmeda e incubar a 39 °C durante la noche.</li>
		<li>Lave los portaobjetos con 1X SSC a 39 °C durante 20 min. Lave las guías con 1X SSC en RT durante 20 min. Enjuague los portaobjetos en 1X PBS, luego agregue Prolong anti-fade con DAPI. Cubra con cubrebocas y guárdelo en la caja deslizante a 4 °C durante al menos una hora antes de la visualización.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PESCADO EN PREPARACIONES MITÓTICAS DE LA CALABAZA DEL CROMOSOMA<ol>
<li>Extraer cromosomas mitóticos de discos imaginales de larva de4º estadio de An. gambiae.</li>
		<li>Prepare las diapositivas del cromosoma convenientes para los PESCADOS.</li>
		<li>Agregue 2-3 μl de sonda de ADN etiquetada al tampón de hibridación en un tubo y mezcle suavemente pipeteando.</li>
		<li>Aplique 10 μl de la mezcla de la sonda a la corredera y cubra con una tapa de 22 X 22 mm. Presione las burbujas de aire con una punta de pipeta.</li>
		<li>Para contratending y detección, aplique Prolong anti-fade with DAPI a la preparación y manténgalo en la oscuridad durante al menos una hora antes de la visualización.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6) FISH 3D en el tejido ovárico de montaje completo
<ol><li>Prepare la siguiente mezcla de búfer A: KCl de 60 mM NaCl de 15 mM 0,5 mM espermidina 0,15 mM Espermina EDTA de 2 mM 0,5 mM EGTA TUBERÍAS DE 15 mM</li>
	<li>Prepare diapositivas para la visualización nuclear agregando una capa de nailpolish en un patrón cuadrado para que coincida con el tamaño de las cubiertas. Esto crea una superficie elevada para evitar el aplastamiento de los núcleos al colocar en la cubierta en el futuro.</li>
	<li>Diseccione los ovarios frescos de las hembras en etapa 3 de Christopher y manténgase en una solución de 150-250 μl Buffer A con digitonina al 0,5%. Ejecute una aguja de disección más grande sobre los folículos (en tubo con tampón A con digitonina al 0,5%) para destruir la membrana folicular.</li>
	<li>Vórtice durante 5-10 min para perturbar aún más los folículos. Raspe cualquier pieza folicular grande y tubo de centrífuga durante 30 segundos en el ajuste más bajo de ~ 500 revoluciones por minuto (RPM). Transferir sobrenadante a un nuevo tubo eppendorf de 2 ml y añadir 100 μl de tampón A. Repetir el paso 6.3 entre 5-7 veces, hasta que el tejido visible se rompa en partículas pequeñas.</li>
	<li>Gire ambos tubos durante 10 minutos a 2.000 RPM. Deseche el sobrenadante en ambos tubos. Nota: Ambos tubos se utilizarán para hacer diapositivas de visualización nuclear finales. El tubo con sobrenadante recogido debe contener principalmente núcleos extraídos, mientras que el tubo original con tejido contendrá una mezcla de tejido y núcleos incrustados en células nodrizas. Añadir 200 μl de Tampón A – 0.1% Tritón e incubar durante la noche a 4 °C. Centrífuga 5 min a 10.000 RPM (10.621 x G) y retire el sobrenadante.</li>
	<li>Añadir 200 μl 4% de Paraformaldehído en PBS. Incubar en termomezclador durante 30 min, mezclando a 450 RPM. Centrífuga 5 min a 5.000 RPM (2.655 x G) y retire el sobrenadante. Lavar con Buffer A con Tritón al 0,1% durante 5 min, mezclando a 450 RPM en termomezclador. Centrífuga 5 min a 5.000 RPM (2.655 G) y retire el sobrenadante.</li>
	<li>Agregue la sonda precalentada a 37 °C etiquetada al tubo. Desnaturalizar a 95 °C en termomezclador, mezclando a 450 RPM, durante 10 min. Continuar la desnaturalización a 80 °C durante 15 min con mezcla continua. Incubar a 37 °C en termomezclador, con mezcla de 450 RPM durante la noche. Centrífuga 5 min a 5.000 RPM (2.655 x G). Retire el sobrenadante.</li>
	<li>Lavar con Buffer A con Tritón al 0,1% durante 5 min. Centrífuga 5 min a 5.000 RPM (2.655 x G). Repetir 2 veces. Aplique drop de Prolong Anti-fade con DAPI.</li>
	<li>Pipetee los núcleos / solución DAPI con cuidado (evitando burbujas), aplique sobre la diapositiva y cubra con cubrebocas.</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Hay múltiples pasos críticos para amplificar con éxito el ADN de muestras microdissecadas de cromosomas politeno. El protocolo emplea el uso de LCM, un método que aumenta la eficiencia general y reduce la exposición al ADN extraño al eliminar la interacción de las herramientas físicas con la muestra. Sin embargo, la amplificación de ADN extraño sigue siendo el mayor escollo potencial de este experimento. Por lo tanto, durante todo el proceso, es esencial mantener las muestras protegidas de la contaminación. A lo largo de las fases de preparación de diapositivas y microdisección, es esencial para el etanol lavar agujas de disección, portaobjetos, resbalones de cubierta, así como el espacio de trabajo.  También se recomienda tratar con UV todos los equipos aplicables (agujas, portaobjetos, cubrebocas) antes de su uso.
La membrana en los portaobjetos de disección hace que la propagación de los cromosomas sea muy difícil.  Es importante usar más del ovario (de la mitad a un par completo de ovarios) al hacer estos portaobjetos, para proporcionar una mayor probabilidad de encontrar un núcleo bien extendido.  También se recomienda usar tejido fresco al hacer diapositivas, ya que las tasas de amplificación parecen disminuir a medida que los tejidos envejecen 49 y la propagación de cromosomas se vuelven más desafiantes.  La preparación de diapositivas para la microdisección es el paso que más tiempo consume en este protocolo.  Los cromosomas deben estar bien diseminados para evitar la adquisición accidental de material no deseado.  La tinción de Giemsa permite al usuario comprobar la calidad de la propagación con un microscopio de contraste de fase antes de utilizar el sistema de microdisección.
La combinación de microdisección y amplificación proporciona la oportunidad de extraer y analizar fragmentos cromosómicos que varían en tamaño desde pequeñas regiones de interés hasta la mayoría de los brazos.  Este protocolo permite al usuario obtener ADN de regiones morfológicamente distintas como inversiones, bandas eucromáticas específicas e interbandas, heterocromatina telomérica, centromérica e intercalaria. El usuario puede aplicar las sondas de pintura generadas para examinar cromosomas aberrantes, estudiar la homología entre especies en loci particulares o caracterizar la organización espacial de los cromosomas en un núcleo 3D intacto. Para desarrollar pinturas cromosómicas, seleccionamos segmentos eucromáticos para evitar la hibridación del ADN repetitivo con múltiples regiones cromosómicas. Como resultado, obtuvimos pintura específica del brazo sin usar un competidor, como el ADN genómico total ola fracciónde ADN C 0 t-1.
Elegimos utilizar los kits GenomePlex WGA y REPLI-G basados en revisiones que compararon la eficiencia y la tasa de abandono de múltiples kits de amplificación 40,44.  Ambos kits tuvieron el mejor desempeño entre los métodos disponibles en ambas tasas de abandono (GenomePlex tuvo una tasa de 12.5% en comparación con el 37.5% de REPLI-g%) y porcentaje de marcadores amplificados (GenomePlex tuvo una tasa de amplificación del 45,24% frente al 30,0% de REPLI-g) 40. El kit GenomePlex también proporcionó una mayor cantidad de ADN, y por lo tanto lo convirtió en un mejor candidato para múltiples técnicas aguas abajo.  Un kit de re-amplificación para el sistema GenomePlex también está disponible, lo que permite una mayor amplificación del ADN. Sin embargo, es importante tener en cuenta que la amplificación no es perfecta.  La posibilidad sigue siendo que la amplificación acertada pueda introducir errores o tener un prejuicio hacia los loci específicos en la DNA de la blanco. Es importante considerar el tamaño final del fragmento de los métodos de amplificación del genoma disponibles.  La fragmentación de GenomePlex da como resultado una biblioteca con fragmentos que van desde 200-500 bp, mientras que el kit REPLI-g produce fragmentos de aproximadamente 10-20 kb de tamaño. La aplicación posterior prevista de este protocolo es FISH, lo que hace que el kit GenomePlex sea una opción más factible, ya que proporciona el tamaño de fragmento deseado y la capacidad de etiquetar fragmentos de ADN directamente a través de WGA. Las moléculas de ADN largas producidas por la amplificación REPLI-g deben fragmentarse en la reacción de etiquetado de nick-translation aguas abajo.
Este protocolo se ha adaptado para amplificar con éxito la DNA de un solo brazo del cromosoma del politeno.  Otros protocolos requieren la agrupación de muchos (típicamente 10-30) fragmentos cromosómicos para amplificar con éxito la muestra 7,11,28,40.  Aunque la agrupación de cromosomas múltiples es posible utilizando nuestro método, la mayor probabilidad de contaminación de la muestra enfatiza la importancia de comenzar el experimento con el menor número posible de cromosomas. Si los cromosomas del politeno no están disponibles, nuestro protocolo se podría adaptar para el uso en cromosomas mitotic. Puede ser necesario, sin embargo, agrupar 10-15 cromosomas mitóticos antes de la amplificación para los PESCADOS acertados 11. El sesgo de amplificación es menor con altas cantidades de ADN de plantilla inicial 50. Los cromosomas politeno proporcionan aproximadamente 512 copias de una sola secuencia de ADN y 1024 copias de dos secuencias de ADN homólogas.  Por lo tanto, la agrupación de cromosomas mitóticos ayudará a aumentar la calidad general del producto de ADN después de la amplificación.
Este procedimiento tiene muchos usos potenciales en estudios citogenéticos y genómicos. Aquí, utilizamos pinturas cromosómicas para establecer la correspondencia entre los segmentos eucromáticos de politeno y los brazos cromosómicos mitóticos en An. gambiae. Las mismas puntas de prueba de la pintura se pueden aplicar a la caracterización citogenética de las variedades de células de An. gambiae. Los cambios genómicos extensos y los cambios en números del cromosoma son características comunes de variedades de células 51,52. Se han detectado reordenamientos aneuploides, poliploides y cromosómicos como translocaciones, inversiones, deleciones y cromosomas en anillo en diferentes líneas celulares de mosquitos 53,54. Las observaciones citogenéticas clásicas 55 y el mapeo físico 56 han demostrado la aparición de translocaciones cromosómicas de brazo entero en la evolución de los mosquitos de la malaria. Por lo tanto, el material microdissected se puede utilizar conjuntamente con experimentos de los PESCADOS para comparar la homología de regiones cromosómicas entre las especies. Realizamos con éxito PESCADOS 3D con la punta de prueba de la 2R-pintura en cromosomas del politeno en células ováricas enteras de la enfermera del montaje. Este método facilitará el trazado de las trayectorias cromosómicas y el estudio de la arquitectura nuclear en Anopheles. Técnicas como el genotipado del ADN 57,58,la secuenciación del genoma de próxima generación 26,27,el desarrollo de mapas físicos y de enlace, y la generación de sondas para la pintura cromosómica 33,59, todas pueden beneficiarse de la microdisección específica del brazo y la región. Mediante la combinación de la tecnología LCM y el avance de WGA unicelular, demostramos un método eficiente y práctico para producir cantidades razonables de ADN a partir de un solo brazo cromosómico politeno.

La pintura cromosómica es una técnica útil para estudiar la evolución de los cariotipos 1-5 y para visualizar anomalías citogenéticas mediante hibridación del ADN cromosómico marcado fluorescentemente 1,6-8. Este método también se aplica al estudio de la dinámica 3D de los territorios cromosómicos en el desarrollo 9 y la patología 10. Las pinturas cromosómicas etiquetadas diferencialmente se utilizan para la visualización de los cromosomas mitóticos individuales11, 12, meióticos13, 14,o interfase no politeno 15,16 y politeno 9,11,17. Un protocolo simple y robusto para obtener pinturas cromosómicas sería muy útil para expandir esta técnica a organismos no modelo, como los mosquitos. El complejo Anopheles gambiae es un grupo de siete mosquitos morfológicamente indistinguibles que varían en comportamiento y adaptación, incluyendo la capacidad de transmitir la malaria.  Estos mosquitos sirven como un excelente modelo para comprender mejor la evolución de especies estrechamente relacionadas que difieren mucho en su capacidad vectorial.  La mayoría de los estudios citogenéticos en mosquitos de la malaria se han realizado utilizando cromosomas bien desarrollados y altamente politenizados (revisados en 18,19). Los patrones de bandas legibles de los cromosomas politenos permitieron a los investigadores demostrar la asociación entre las inversiones polimórficas y las adaptaciones ecológicas en Anopheles gambiae 20. También, 21 tejido-específicos y 22 características especie-específicas de la organización del cromosoma del politenio 3D se han caracterizado en el complejo de los macullipennis del An. Sin embargo, el estudio de los cromosomas mitóticos podría proporcionar información adicional importante. Por ejemplo, un mayor nivel de polimorfismo de heterocromatina observado en cromosomas mitóticos se ha correlacionado con una menor actividad de apareamiento y fertilidad en An. gambiae 23. La correspondencia entre los segmentos eucromáticos del politeno y los brazos mitotic del cromosoma podía ser difícil de establecer solamente comparando sus longitudes relativas. Esto se debe a que la heterocromatina constituye una porción significativa de los cromosomas mitóticos, pero está subrepresentada en los cromosomas politeno 24. La disponibilidad de pinturas cromosómicas para los mosquitos de la malaria permitiría a los investigadores ampliar significativamente los estudios citogenéticos mediante la inclusión de especies adicionales, al tiempo que reduciría sustancialmente el costo y el tiempo en los análisis de la evolución cariotípica y la dinámica 3D de los cromosomas en este grupo de insectos epidemiológicamente importantes.
Con el fin de obtener grandes extensiones de cromosomas, la microdisección se ha convertido en una técnica integral para manipular y aislar regiones específicas de interés del complemento cromosómico.  Cuando se combina con la amplificación del genoma completo (WGA), la microdisección da lugar a potentes aplicaciones aguas abajo, incluyendo FISH 11,12 y la secuenciación del genoma de próxima generación 25-27. Anteriormente, la técnica requería el uso de agujas de microdisección especializadas que debían ser controladas manualmente por un usuario experimentado 28.  El avance de la microdisección de captura láser (LCM) ha dado como resultado una herramienta simplificada más adecuada para aislar células individuales 29,30 o cromosomas individuales 31-33 con un menor riesgo de contaminación. Este enfoque permite al usuario estudiar las heterogeneidades genéticas y anomalías cromosómicas que ocurren en células individuales, en lugar de un paisaje de consenso que resulta de la agrupación de múltiples células entre sí 34-36. Se han utilizado múltiples métodos para amplificar el ADN producido a partir de la microdisección.  Dop-PCR, una técnica útil para la amplificación de secuencias altamente repetitivas, se ha utilizado para amplificar cromosomas microdissecados de especies como el saltamontes 37,la anguila espinosa 38,y la tilapia del Nilo 39.  Más recientemente, el kit de una sola célula GenomePlex WGA4 basado en PCR y el kit de una sola célula Repli-G basado en amplificación de desplazamiento múltiple (MDA) se han convertido en herramientas valiosas para experimentos que implican el análisis genético de células humanas individuales, así como cromosomas40-42,incluidos los sistemas de cromosoma B en saltamontes 37 y langostas 43. Estos dos kits tienen ventajas y desventajas, pero se ha demostrado su aparente superioridad sobre otros sistemas de amplificación disponibles 44.
La cantidad de ADN que se puede obtener de un solo cromosoma o un segmento cromosómico es significativamente menor que la de un núcleo entero. Por lo tanto, la microdisección, la amplificación y el posterior análisis de un solo cromosoma son mucho más desafiantes, especialmente en organismos con genomas pequeños como en Drosophila o Anopheles.  Aunque las pinturas se han desarrollado a partir de cromosomas microdissecados individuales de un ser humano 33 y una avispa 45,un experimento exitoso de FISH requirió múltiples (al menos 10-15) cromosomas mitóticos microdissecados de una mosca de la fruta 11. Sin embargo, la capacidad de microdiseccionar y amplificar un solo cromosoma sería importante para (i) reducir la posibilidad de contaminación con material de un cromosoma diferente, (ii) minimizar el número de preparaciones cromosómicas necesarias para la microdisección, (iii) bajar el nucleótido y el polimorfismo estructural de la muestra microdissecada tanto en FISH como en secuenciar aplicaciones posteriores. Los cromosomas politensos que se encuentran en muchas especies de dípteros ofrecen una oportunidad única para adquirir una cantidad inicial mucho mayor de ADN. También proporcionan una resolución y una estructura cromosómica más altas que no se pueden lograr mediante el uso de cromosomas mitóticos. Esta resolución adicional puede ser crítica en la visualización de reordenamientos cromosómicos, estructura de cromatina y segmentos cromosómicos para ser microdissecados 28,46.
Aquí presentamos un procedimiento para aislar eficientemente un segmento eucromático de un solo brazo del cromosoma del politeno, amplificar la DNA, y utilizarlo en usos rio abajo de los PESCADOS en mosquitos de la malaria.  En primer lugar, aplicamos LCM para aislar y extraer un solo brazo cromosómico de portaobjetos de membrana especialmente preparados. En segundo lugar, WGA se utiliza para amplificar el ADN del material microdissecado. En tercer lugar, hibridamos el ADN amplificado en experimentos FISH para preparar preparaciones de calabaza politeno 47,metafase y diapositivas cromosómicas interfase 48,así como muestras de montaje entero ovárico 3D. Este procedimiento se ha hecho para pintar con éxito una mayoría de la eucromatina en brazos cromosómicos de An. gambiae.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="562">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">A491-212</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Methanol</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:120px;">A412-4</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Propionic acid&#160;</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">402907</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Membrane slides 1.0 PET</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;">415190-9051-000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Buffer tablets &#8220;GURR&#8221;</td>
			<td style="width:112px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">10582-013</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">KaryoMAX Giemsa Stain</td>
			<td style="width:112px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">10092-013</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">ThermoBrite Slide Denaturation/Hybridization System</td>
			<td style="width:112px;">Abbott Molecular</td>
			<td style="width:120px;">30-144110</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Vacufuge vacuum concentrator</td>
			<td style="width:112px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:120px;">22820001</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">Spectroline Microprocessor-Controlled UV Crosslinker XL-1000</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">11-992-89</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:59px;width:191px;">Thermo Scientific NanoDrop</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">ND-2000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">REPLI-g Single Cell Kit</td>
			<td style="width:112px;">Qiagen</td>
			<td style="width:120px;">150343</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:191px;">GenomePlex Single Cell Kit (WGA4)</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">WGA4-10RXN</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">GenomePlex WGA Reamplification Kit (WGA3)</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">WGA3-50RXN</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:191px;">MZ6 Leica stereomicroscope</td>
			<td style="width:112px;">Leica</td>
			<td style="width:120px;">VA-OM-E194-354</td>
			<td style="width:139px;">A different stereomicroscope can be used</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">Olympus CX41 Phase Microscope</td>
			<td style="width:112px;">Olympus</td>
			<td style="width:120px;">CX41RF-5</td>
			<td style="width:139px;">A different phase microscope can be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">PALM MicroBeam Laser Microdissection Microscope</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Thermomixer</td>
			<td style="width:112px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:120px;">22670000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">10x PBS</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:120px;">P5493</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">50x Denhardt&#8217;s solution</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">D2532</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">99% Formamide</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP227500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Dextran sulfate sodium salt</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td style="width:120px;">D8906</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">20x SSC buffer</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:120px;">AM9765</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">ProLong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:120px;">P-36931</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">dATP, dCTP, dGTP, dTTP</td>
			<td style="width:112px;">Fermentas</td>
			<td style="width:120px;">R0141, R0151, R0161, R0171</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Cy3-dUTP, Cy5-dUTP</td>
			<td style="width:112px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:120px;">PA53022, PA55022</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">BSA</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">A3294</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">DNA polymerase I</td>
			<td style="width:112px;">Fermentas</td>
			<td style="width:120px;">EP0041</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">DNase I&#160;</td>
			<td style="width:112px;">Fermentas</td>
			<td style="width:120px;">EN0521</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Spermine</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">S3256-1G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Spermidine</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">S0266-1G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP366-500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP3581</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">EGTA</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">E0396-25G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">PIPES</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">P6757-25G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">EDTA</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">S311-500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Digitonin</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">D141-100MG</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Triton-X100</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP151-100</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">AdhesiveCap 500 clear</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;">415190-9211-000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">QIAamp DNA Micro Kit (50)</td>
			<td style="width:112px;">Qiagen</td>
			<td style="width:120px;">56304</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Genomic DNA Clean and Concentrator Kit</td>
			<td style="width:112px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:120px;">D4010</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">37% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">F79-500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

2d and 3d chromosome painting in malaria mosquitoes

El hibridación in situ fluorescente (PESCADO) de las puntas de prueba enteras del cromosoma del brazo es una técnica robusta para trazar regiones genomic del interés, detectar cambios cromosómicos, y estudiar la organización tridimensional (3D) de cromosomas en el núcleo de la célula. La llegada de la microdisección por captura láser (LCM) y la amplificación del genoma completo (WGA) permite obtener grandes cantidades de ADN de células individuales. La mayor sensibilidad de los kits wga nos llevó a desarrollar pinturas cromosómicas y a utilizarlas para explorar la organización cromosómica y la evolución en organismos no modelo. Aquí, presentamos un método simple para aislar y amplificar los segmentos eucromáticos de los brazos de cromosomas de politeno único de las células de la enfermera ovárica del mosquito africano de la malaria Anopheles gambiae. Este procedimiento proporciona una plataforma eficiente para la obtención de pinturas cromosómicas, al tiempo que reduce el riesgo general de introducir ADN extraño en la muestra. El uso de WGA permite varias rondas de reamplización, lo que resulta en altas cantidades de ADN que se pueden utilizar para múltiples experimentos, incluidos 2D y 3D FISH. Demostramos que las pinturas desarrolladas del cromosoma se pueden utilizar con éxito para establecer la correspondencia entre las porciones eucromáticas de politeno y los brazos mitotic del cromosoma en Gambiae del An. En general, la unión de LCM y WGA de un solo cromosoma proporciona una herramienta eficiente para crear cantidades significativas de ADN diana para futuros estudios citogenéticos y genómicos.

La figura 1 describe el flujo general del protocolo descrito en este artículo.  El usuario comienza inicialmente por microdissecting muestras de ADN cromosómico de diapositivas de membrana.  El material microdissecado se extrae y purifica. El ADN purificado se amplifica, se vuelve a amplificar, se etiqueta y luego se usa para que FISH etiquete las diseminaciones cromosómicas.
El protocolo LCM se puede dividir en tres pasos generales: 1) Encontrar cromosomas de interés y preparar la región para el corte(Figura 2A),2) Cortar y catapultar la región cromosómica de interés vía láser(Figura 2B), y 3)Comprobar para determinar si la muestra está realmente catapultada en tapa adhesiva(Figura 2C). El proceso de LCM utilizado en los cromosomas del politeno de la tensión de An. gambiae Sua se muestra en el vídeo 1. El video detalla todo el proceso desde el inicio del programa, incluidas las funciones y consejos importantes del software.
Los kits WGA unicelulares GenomePlex y REPLI-g utilizados en este protocolo difieren en gran medida en el tamaño del producto resultante, así como en el rendimiento general.  La Figura 3 muestra los resultados de la electroforesis en gel para los kits GenomePlex y REPLI-g, así como la cuantificación de las muestras por Nanodrop.
El material microdissecado se ha utilizado para crear sondas FISH que se dirigen a las regiones eucromáticas de un cromosoma.  La Figura 4 muestra FISH de cinco sondas generadas a partir de material microdissecado en cromosomas politeno de An. gambiae.  Cuatro brazos autosómicos fueron etiquetados con tres fluoróforos usando el kit WGA3: el cromosoma 3R está etiquetado en verde (fluoresceína), el cromosoma 3L está en una mezcla de rojo (Cy-3) y amarillo (Cy-5), el cromosoma 2R está en amarillo (Cy-5), y el cromosoma 2L está en rojo (Cy-3). El cromosoma de X fue etiquetado en la naranja (Cy-3) usando la mella-traducción del material de REPLI-g en un experimento separado. Para establecer la correspondencia entre las porciones eucromáticas de politeno y los brazos cromosómicos mitóticos, se han hibridado pinturas cromosómicas para interfase, profase, prometafase y metafase cromosomas de An. gambiae (Figura 5).  Para visualizar la organización 3D de un solo brazo del cromosoma del politeno en el núcleo de la célula, los PESCADOS enteros del montaje fueron realizados en las células ováricas de la enfermera de la tensión de An. gambiae Sua (vídeo 2).  Los distintos territorios del brazo cromosómico se ven claramente en núcleos con cromosomas interfase(Figura 5D)y politeno (Video 2).
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig1.jpg"> Figura 1. Representación esquemática de los procedimientos experimentales hacia la preparación de pinturas cromosómicas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig2.jpg"> Figura 2. Los pasos principales en la microdisección cromosómica. A) Corte asistido por láser de la región cromosómica de interés a través de la membrana. B) Se realiza la membrana con un orificio después de la catapulta. C) La vista de la pieza catapultada de la membrana con un segmento cromosómico en ella unido a la tapa adhesiva. La flecha indica la heterocromatina del cromosoma X que permaneció en la diapositiva. El asterisco muestra un pedazo de otro cromosoma que permaneció en la diapositiva. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig3.jpg"> Figura 3. Imágenes de gel de agarosa que muestran ADN después de WGA. A) ADN de bajo peso molecular (200-500 pb) del brazo 3R después de usar los kits WGA4 y WGA3 GenomePlex. B) ADN de alto peso molecular (10-20 kb) del brazo 2L después de la amplificación de REPLI-g. La escalera de 100 pb se muestra en los carriles izquierdos. Las siguientes tablas de imágenes de gel muestran concentraciones de ADN medidas por Nanodrop. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a>
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig4.jpg"> Figura 4. Pintura de los cromosomas del politeno de las células ováricas de la enfermera del Gambiae del An. usando cuatro puntas de prueba generadas del material microdissected. El cromosoma X está etiquetado en naranja (Cy-3) por la nick-traducción del material REPLI-g. El brazo 2R está etiquetado en amarillo (Cy-5); el brazo de 2L está en rojo (Cy-3); el brazo 3R está etiquetado en verde (fluoresceína); el brazo de 3L está etiquetado en una mezcla de rojo (Cy-3) y amarillo (Cy-5). Los autosomas están etiquetados con el kit de amplificación WGA3. La cromatina se tiñe de azul (DAPI). Los nombres de los cromosomas se colocan cerca de las regiones teloméricas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig4highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a>
<img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig5.jpg"> Figura 5. Pintura de los cromosomas de interfase (A), profase (B), prometaphase (C) y metaphase (D) de los discos imaginales larvales de la tensión de An. gambiae Mopti usando tres puntas de prueba generadas del material microdissected etiquetado por WGA3. El brazo 2R está etiquetado en verde (fluoresceína); el brazo de 2L no está etiquetado; el brazo 3R es en rosa, una mezcla de rojo (Cy-3) y naranja (Cy-5); el brazo de 3L está etiquetado en naranja (Cy-5). El cromosoma X tiene una etiqueta roja correspondiente a la sonda de ADNr 18S. La cromatina se tiñe de azul (DAPI). Las regiones brillantemente manchadas de cromosomas corresponden a la heterocromatina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig5highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a>
Vídeo 1. The process of LCM of the An. gambiae polytene chromosomes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/Sharakhov_video1.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para ver el video 1.</a>
Vídeo 2. El pescado 3D entero del montaje se realizó en las células ováricas de la enfermera de An. gambiae. La sonda está etiquetada en Cy-3 (representada en azul) y fue hecha de un brazo microdisecado del cromosoma 2R.  La cromatina fue teñida con DAPI y es representada por el pseudo-colorante cian (azul claro). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/Video2.avi" target="_blank">Haga clic aquí para ver el video 2.</a>

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2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

La pintura del cromosoma es un método útil para estudiar la organización del núcleo de la célula y la evolución del karyotype. Aquí, demostramos un acercamiento para aislar y para amplificar regiones específicas del interés de los cromosomas solos del politeno que se utilizan posteriormente para el hibridación in situ fluorescente de dos y tridimensional (PESCADO).

Pintura de cromosomas 2D y 3D en mosquitos de la malaria

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

2d-and-3d-chromosome-painting-in-malaria-mosquitoes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

Un protocolo Chelex simple para la extracción de ADN a partir de<em&gt; Anopheles</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Investigación

Inmunología e Infección

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes. Investigation of transcripts and gene regulators that are expressed in tissues in which the mosquito host and pathogen interact, and in organs involved in reproduction are of great interest for strategies to reduce mosquito-borne disease transmission and disrupt egg development. A number of tools have been employed to study and validate the temporal and tissue-specific regulation of gene expression. Here, we describe protocols that have been developed to obtain spatial information, which enhances our understanding of where specific genes are expressed and their products accumulate. The protocol described has been used to validate expression and determine accumulation patterns of transcripts in tissues related to mosquito-borne pathogen transmission, such as female salivary glands, as well as subcellular compartments of ovaries and embryos, which relate to mosquito reproduction and development. 
 The following procedures represent an optimized methodology that improves the efficiency of various steps in the protocol without loss of target-specific hybridization signals. Guidelines for RNA probe preparation, dissection of soft tissues and the general procedure for fixation and hybridization are described in Part A, while steps specific for the collection, fixation, pre-hybridization and hybridization of mosquito embryos are detailed in Part B.

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Temporal and spatial gene expression analyses have a crucial role in functional genomics. Whole-mount hybridization in situ is useful for determining the localization of transcripts within tissues and subcellular compartments. Here we outline a hybridization in situ protocol with modifications for specific target tissues in mosquitoes.

Hibridación<em&gt; In situ</em&gt; De las glándulas salivales, los ovarios y embriones de los mosquitos vectores

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. One important application of this method is the development of high-quality physical maps useful for improving the genome assemblies for various organisms. The natural banding pattern of polytene and mitotic chromosomes provides guidance for the precise ordering and orientation of the genomic supercontigs. Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, a well-established chromosome-based mapping technique has been developed only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes 1. As a result of genome mapping efforts, 88% of the An. gambiae genome has been placed to precise chromosome positions 2,3 . Two other mosquito genera, Aedes and Culex, have poorly polytenized chromosomes because of significant overrepresentation of transposable elements in their genomes 4, 5, 6. Only 31 and 9% of the genomic supercontings have been assigned without order or orientation to chromosomes of Ae. aegypti 7 and Cx. quinquefasciatus 8, respectively. Mitotic chromosome preparation for these two species had previously been limited to brain ganglia and cell lines. However, chromosome slides prepared from the brain ganglia of mosquitoes usually contain low numbers of metaphase plates 9. Also, although a FISH technique has been developed for mitotic chromosomes from a cell line of Ae. aegypti 10, the accumulation of multiple chromosomal rearrangements in cell line chromosomes 11 makes them useless for genome mapping. Here we describe a simple, robust technique for obtaining high-quality mitotic chromosome preparations from imaginal discs (IDs) of 4th instar larvae which can be used for all three genera of mosquitoes. A standard FISH protocol 12 is optimized for using BAC clones of genomic DNA as a probe on mitotic chromosomes of Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus, and for utilizing an intergenic spacer (IGS) region of ribosomal DNA (rDNA) as a probe on An. gambiae chromosomes. In addition to physical mapping, the developed technique can be applied to population cytogenetics and chromosome taxonomy/systematics of mosquitoes and other insect groups.

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, physical genome mapping techniques were established only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes. For the genera of Aedes and Culex, however, cytogenetic mapping remains challenging because of the poor quality of polytene chromosomes. Here we present a universal protocol for obtaining high-quality preparations of mitotic chromosomes and an optimized FISH protocol for all three genera of mosquitoes.

Fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación en los cromosomas mitóticos de mosquitos

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency and type of chromosome aberrations in different cell types allows defects in DNA repair pathways to be elucidated. Understanding mammalian DNA repair biology has been greatly helped by the production of mice with knockouts in specific genes. The goal of this protocol is to quantify genomic instability in mouse B lymphocytes. Labeling of the telomeres using PNA-FISH probes (peptide nucleic acid - fluorescent in situ hybridization) facilitates the rapid analysis of genomic instability in metaphase chromosome spreads. B cells have specific advantages relative to fibroblasts, because they have normal ploidy and a higher mitotic index. Short-term culture of B cells therefore enables precise measurement of genomic instability in a primary cell population which is likely to have fewer secondary genetic mutations than what is typically found in transformed fibroblasts or patient cell lines.

DNA repair pathways are essential for maintenance of genomic integrity and preventing mutation and cancer. The goal of this protocol is to quantify genomic instability by direct observation of chromosome aberrations in metaphase spreads from mouse B cells using fluorescent in situ hybridization (FISH) for telomeric DNA repeats.

Análisis rápido de aberraciones cromosómicas en linfocitos B de ratón por PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria

Despite decades of eradication efforts, malaria remains a global burden. Recent renewed interest in regional elimination and global eradication has been accompanied by increased genomic information about Plasmodium parasite species responsible for malaria, including characteristics of geographical populations as well as variations associated with reduced susceptibility to anti-malarial drugs.
One common genetic variation, single-nucleotide polymorphisms (SNPs), offers attractive targets for parasite genotyping. These markers are useful not only for tracking drug resistance markers but also for tracking parasite populations using markers not under drug or other selective pressures.
SNP genotyping methods offer the ability to track drug resistance as well as to fingerprint individual parasites for population surveillance, particularly in response to malaria control efforts in regions nearing elimination status.
While informative SNPs have been identified that are agnostic to specific genotyping technologies, high-resolution melting (HRM) analysis is particularly suited to field-based studies. Compared to standard fluorescent-probe based methods that require individual SNPs in a single labeled probe and offer at best 10% sensitivity to detect SNPs in samples that contain multiple genomes (polygenomic), HRM offers 2-5% sensitivity. Modifications to HRM, such as blocked probes and asymmetric primer concentrations as well as optimization of amplification annealing temperatures to bias PCR towards amplification of the minor allele, further increase the sensitivity of HRM. While the sensitivity improvement depends on the specific assay, we have increased detection sensitivities to less than 1% of the minor allele.
In regions approaching malaria eradication, early detection of emerging or imported drug resistance is essential for prompt response. Similarly, the ability to detect polygenomic infections and differentiate imported parasite types from cryptic local reservoirs can inform control programs.
This manuscript describes modifications to high resolution melting technology that further increase its sensitivity to identify polygenomic infections in patient samples.

While high resolution melting analysis offers the ability to differentiate between single nucleotide polymorphisms in a heterogeneous population, mutant allele amplification bias can increase its ability to detect alleles present at relatively low percentages within a sample. This protocol describes improvements that improve the sensitivity of high resolution melting analysis.

Los métodos para aumentar la sensibilidad de alta resolución de fusión polimorfismo de nucleótido único Genotipado de la Malaria

Despite decades of eradication efforts, malaria remains a global burden. Recent renewed interest in regional elimination and global eradication has been ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo para medir la respuesta inmune a la malaria en el contexto del VIH Co-infección

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible for most malaria-related deaths globally. Several factors including parasite sequestration in tissues, vascular dysfunction, and inflammatory responses influence the evolution of the disease in malaria-infected people. P. falciparum-infected red blood cells (iRBCs) release small extracellular vesicles (EVs) containing different kinds of cargo molecules that mediate pathogenesis and cellular communication between parasites and host. EVs are efficiently taken up by cells in which they modulate their function. Here we discuss strategies to address the role of EVs in parasite-host interactions. First, we describe a straightforward method for labeling and tracking EV internalization by endothelial cells, using a green cell linker dye. Second, we report a simple way to measure permeability across an endothelial cell monolayer by using a fluorescently labeled dextran. Finally, we show how to investigate the role of small non-coding RNA molecules in endothelial cell function.

In this work, we describe protocols to investigate the role of extracellular vesicles (EVs) released by Plasmodium falciparum infected erythrocytes. In particular, we focus on the interactions of EVs with endothelial cells.

Evaluación de la función de la vesícula extracelular durante la infección de la Malaria

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines and/or antivirals have underscored the urgent need to develop ZIKV reverse genetic systems to facilitate the study of ZIKV biology and the development of therapeutic and/or prophylactic approaches. However, like with other flaviviruses, the generation of ZIKV full-length infectious cDNA clones has been hampered due to the toxicity of viral sequences during its amplification in bacteria. To overcome this problem, we have developed a nontraditional approach based on the use of bacterial artificial chromosomes (BACs). Using this approach, the full-length cDNA copy of the ZIKV strain Rio Grande do Norte Natal (ZIKV-RGN) is generated from four synthetic DNA fragments and assembled into the single-copy pBeloBAC11 plasmid under the control of the human cytomegalovirus (CMV) immediate-early promoter. The assembled BAC cDNA clone is stable during propagation in bacteria, and infectious recombinant (r)ZIKV is recovered in Vero cells after transfection of the BAC cDNA clone. The protocol described here provides a powerful technique for the generation of infectious clones of flaviviruses, including ZIKV, and other positive-strand RNA viruses, particularly those with large genomes that have stability problems during bacterial&#160;propagation.

The recent epidemic of Zika virus highlights the importance of establishing reverse genetic approaches to develop vaccines and/or therapeutic strategies. Here, we describe the protocol to rescue an infectious recombinant Zika virus from a full-length cDNA clone assembled in a bacterial artificial chromosome under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter.

Rescate del virus del Zika recombinante de un clon de ADNc cromosómico artificial bacteriano

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

Análisis de competencia vectorial en mosquitos Aedes aegypti con el virus Zika

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of disease cases each year. E. aedis causes mortality and reduced reproductive fitness in the mosquito vector and has been explored for its potential as a biocontrol agent. The protocol we present for culturing E. aedis is based on its natural infection cycle, which involves both horizontal and vertical transmission at different life stages of the mosquito host. Ae. aegypti mosquitoes are exposed to spores in the larval stage. These infected larvae then mature into adults and transmit the parasite vertically to their offspring. Infected offspring are then used as a source of spores for future horizontal transmission. Culturing E. aedis can be challenging to the uninitiated given the complexities of the parasite&#8217;s life cycle, and this protocol provides detailed guidance and visual aids for clarification.

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

A protocol to culture the microsporidian parasite Edhazardia aedis. The parasite is passaged from one generation of Aedes aegypti mosquitoes to the next via horizontal transfer at the larval stage followed by vertical transmission at the adult stage. Live sporoplasms survive long-term in infected eggs.

Propagación del parásito microsporidiano Edhazardia aedis en mosquitos Aedes aegypti

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of ...