Name: study of phagolysosome biogenesis in live macrophages
Uploaded: 2014-03-10T21:00:00
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Damos las gracias a los miembros del Laboratorio de Biología Fagosoma para la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo es apoyado por una beca de Helmholtz Young Investigator (Iniciativa y los fondos de red de la Asociación Helmholtz) y un Programa Prioritario SPP1580 Grant, del Consejo Alemán de Investigación (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG).

Cuidado de los animales y todos los procedimientos en este protocolo siguen las directrices institucionales y nacionales. Preparar los preparativos que se indican mediante &quot;Π&quot; de antemano. 1. Preparación de BMMs <ol><li> Lleve a cabo el sacrificio de los ratones por dislocación cervical. </li><li> Retire fémur y los huesos de tibia, huesos libres desde el tejido y corte los dos extremos de la accesibilidad de la médula ósea. </li><li> Mantener l...

<ol>
	<li>Greenberg, S., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+and+innate+immunity.">Phagocytosis and innate immunity.</a> Curr. Opin. Immunol. 14, 136-145 (2002).</li><li>Jutras, I., Desjardins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis:+at+the+crossroads+of+innate+and+adaptive+immunity.">Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity.</a> Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 511-527 (2005).</li><li>Iwasaki, A., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+adaptive+immunity+by+the+innate+immune+system.">Regulation of adaptive immunity by the innate immune system.</a> Science. 327, 291-295 (2010).</li><li>Stuart, L., Ezekowitz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis:+elegant+complexity.">Phagocytosis: elegant complexity.</a> Immunity. 22, 539-550 (2005).</li><li>Blander, J. M., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+regulation+of+phagosome+maturation+and+antigen+presentation.">On regulation of phagosome maturation and antigen presentation.</a> Nat. Immunol. 7, 1029-1035 (2006).</li><li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+phagocytosis.">The cell biology of phagocytosis.</a> Annu. Rev. Pathol. 7, 61-98 (2012).</li><li>Vieira, O. V., Botelho, R. J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagosome+maturation:+aging+gracefully.">Phagosome maturation: aging gracefully.</a> Biochem. J. 366, 689-704 (2002).</li><li>Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phagosome:+compartment+with+a+license+to+kill.">The phagosome: compartment with a license to kill.</a> Traffic. 8, 311-330 (2007).</li><li>Flannagan, R. S., Cosio, G., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+mechanisms+of+phagocytes+and+bacterial+evasion+strategies.">Antimicrobial mechanisms of phagocytes and bacterial evasion strategies.</a> Nat Rev Microbiol. 7, 355-366 (2009).</li><li>Luzio, J., Pryor, P., Bright, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomes:+fusion+and+function.">Lysosomes: fusion and function.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 622-632 (2007).</li><li>Huotari, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosome+maturation.">Endosome maturation.</a> EMBO J. 30, 3481-3500 (2011).</li><li>Luzio, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosome-endosome+fusion+and+lysosome+biogenesis.">Lysosome-endosome fusion and lysosome biogenesis.</a> J. Cell. Sci. 113 (pt 9), 1515-1524 (2000).</li><li>Eissenberg, L., Goldman, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+lysosomes+with+phagosomes+containing+Histoplasma+capsulatum:+use+of+fluoresceinated+dextran).">Fusion of lysosomes with phagosomes containing Histoplasma capsulatum: use of fluoresceinated dextran).</a> Adv. Exp. Med. Biol. 239, 53-61 (1988).</li><li>de Souza Carvalho, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization,+phagolysosomal+biogenesis+and+killing+of+mycobacteria+in+enucleated+epithelial+cells.">Internalization, phagolysosomal biogenesis and killing of mycobacteria in enucleated epithelial cells.</a> Cell. Microbiol. 13, 1234-1249 (2011).</li><li>Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+and+sequential+delivery+of+fluorescent+lysosomal+probes+into+phagosomes+in+mouse+peritoneal+macrophages.">Differential and sequential delivery of fluorescent lysosomal probes into phagosomes in mouse peritoneal macrophages.</a> J. Cell Biol. 104, 1749-1754 (1987).</li><li>Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagosomes+Fuse+with+Late+Endosomes+and/or+Lysosomes+by+Extension+of+Membrane+Protrusions+along+Microtubules:+Role+of+Rab7+and+RILP.">Phagosomes Fuse with Late Endosomes and/or Lysosomes by Extension of Membrane Protrusions along Microtubules: Role of Rab7 and RILP.</a> Mol. Cell. Biol. 23, 6494-6506 (2003).</li><li>Huynh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LAMP+proteins+are+required+for+fusion+of+lysosomes+with+phagosomes.">LAMP proteins are required for fusion of lysosomes with phagosomes.</a> EMBO J. 26, 313-324 (2007).</li><li>Kasmapour, B., Gronow, A., Bleck, C., Hong, W., Gutierrez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-dependent+mechanism+of+cargo+sorting+during+lysosome-phagosome+fusion+is+controlled+by+Rab34.">Size-dependent mechanism of cargo sorting during lysosome-phagosome fusion is controlled by Rab34.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 20485-20490 (2012).</li><li>Snijder, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+context+determines+cell-to-cell+variability+in+endocytosis+and+virus+infection.">Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection.</a> Nature. 461, 520-523 (2009).</li><li>Knight, M., Roberts, S., Lee, D., Bader, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+using+confocal+microscopy+induces+intracellular+calcium+transients+and+cell+death.">Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284, 9 (2003).</li><li>Hemmi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Toll-like+receptor+recognizes+bacterial+DNA.">A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA.</a> Nature. 408, 740-745 (2000).</li><li>Underhill, D., Ozinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptors:+key+mediators+of+microbe+detection.">Toll-like receptors: key mediators of microbe detection.</a> Curr. Opin. Immunol. 14, 103-110 (2002).</li><li>Bohdanowicz, M., Cos&#237;o, G., Backer, J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Class+I+and+class+III+phosphoinositide+3-kinases+are+required+for+actin+polymerization+that+propels+phagosomes.">Class I and class III phosphoinositide 3-kinases are required for actin polymerization that propels phagosomes.</a> J. Cell Biol. 191, 999-1012 (2010).</li><li>Hoffmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+receptor-ligand+interactions+modulate+gene+expression+and+phagosomal+properties+during+both+early+and+late+stages+of+phagocytosis.">Initial receptor-ligand interactions modulate gene expression and phagosomal properties during both early and late stages of phagocytosis.</a> Eur. J. Cell Biol. 89, 693-704 (2010).</li><li>Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetics+of+phagosome+maturation+as+a+function+of+phagosome/lysosome+fusion+and+acquisition+of+hydrolytic+activity.">The kinetics of phagosome maturation as a function of phagosome/lysosome fusion and acquisition of hydrolytic activity.</a> Traffic. 6, 413-420 (2005).</li><li>Savina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOX2+controls+phagosomal+pH+to+regulate+antigen+processing+during+crosspresentation+by+dendritic+cells.">NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells.</a> Cell. 126, 205-218 (2006).</li><li>Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+phagosome+maturation+through+the+real-time,+spectrofluorometric+measurement+of+hydrolytic+activities.">Recording phagosome maturation through the real-time, spectrofluorometric measurement of hydrolytic activities.</a> Methods Mol. Biol. 531, 157-171 (2009).</li><li>Russell, D., Vanderven, B., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macrophage+marches+on+its+phagosome:+dynamic+assays+of+phagosome+function.">The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).</li><li>Hoffmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+phagosomal+degradation+and+antigen+presentation+in+dendritic+cells.">Autonomous phagosomal degradation and antigen presentation in dendritic cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14556-14561 (2012).</li><li>Tan, S., Sukumar, N., Abramovitch, R., Parish, T., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+Responds+to+Chloride+and+pH+as+Synergistic+Cues+to+the+Immune+Status+of+its+Host+Cell.">Mycobacterium tuberculosis Responds to Chloride and pH as Synergistic Cues to the Immune Status of its Host Cell.</a> PLoS Pathog. 9, (2013).</li><li>Aziz, M., Yang, W. -. L., Wang, P., Coliganet, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+phagocytic+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester.">Measurement of phagocytic engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Current protocols in immunology. 14, (2013).</li><li>Rogers, L., Foster, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+phagosomal+proteome+and+the+contribution+of+the+endoplasmic+reticulum.">The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 18520-18525 (2007).</li><li>Russell, D. G., Vanderven, B. C., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macrophage+marches+on+its+phagosome:+dynamic+assays+of+phagosome+function.">The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).</li><li>Savina, A., Vargas, P., Guermonprez, P., Lennon, A. -. M., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+pH,+ROS+production,+maturation,+and+degradation+in+dendritic+cell+phagosomes+using+cytofluorometry-based+assays.">Measuring pH, ROS production, maturation, and degradation in dendritic cell phagosomes using cytofluorometry-based assays.</a> Methods. Mol. Biol. 595, 383-402 (2010).</li></ol>

En la siguiente sección vamos a discutir los pasos críticos del método presentado y sus limitaciones. Además, vamos a conectar algunos de los problemas comunes con sus soluciones, introducir posibles modificaciones y considerar ventajas de nuestro método, así como métodos complementarios adecuados para este enfoque. La preparación de las perlas, incluyendo el acoplamiento de IgG a la superficie de la perla, es crucial y el uso de preparaciones de filetes debe ser evitado. En adición...

Fagocitos profesionales, incluyendo macrófagos, juegan un crítico en el sistema inmunológico. Además de ser la primera línea de defensa en el sistema inmune innato, sino que también desempeñan un papel crítico en la activación de la inmunidad adaptativa a través de su señalización y presentadora de antígeno papel 1-3. Mientras que la función de los fagocitos profesionales es multifacética, la maduración del fagosoma es la columna vertebral crítico de la función de procesamiento bactericida y el antígeno de los fagocitos profesionales 4,5. Después de la inmersión y la captación de un blanco fagocítica, tales como bacterias mediada por el receptor, el fagosoma naciente pasa a través de una secuencia compleja y bien orquestada de la interacción y los intercambios con compartimentos de la red endocítica y varios otros orgánulos celulares 6. La naturaleza de los compuestos intercambia con estas entidades celulares, así como la regulación y el calendario de eventos de fusión determina el medio phagosomal luminal y los fagoscomposición omal membrana y, por tanto, 7, el destino del fagosoma maduración 8. La importancia fisiológica de la maduración del fagosoma se ejemplifica con las diversas estrategias empleadas por diversos patógenos intracelulares escapar, arrestar o subvertir fagosoma maduración 9. La mayoría de estas estrategias de evitar directa o indirectamente la etapa final y crítica del proceso de maduración fagosoma: la fusión de fagosoma con compartimientos endosomal / lisosomales finales de los años, que los dota de la mayor parte de las enzimas hidrolíticas y factores anti-bacterianas de un fagosoma madura 7 , 8,10. El análisis de este paso final y crítico, por tanto, nos puede proporcionar fuertes indicadores sobre el estado de maduración de los fagosomas, y si el estado fisiológico natural está siendo positiva o negativamente afectado bajo las condiciones experimentales particulares que se están utilizando. El compartimento tarde endosomal / lisosomals son generalmente considerados como los compartimentos de terminales de la vía endocítica, definidos y distinguidos de los primeros compartimentos endocítica por la presencia de varios, Escenario, moléculas marcadoras específicas. Por ejemplo enzimas hidrolíticas o componentes de membrana tales como proteínas de la membrana lisosomal asociados (lámparas), entre otros 11. El terminal endocítica que se refiere compartimentos-de ahora en adelante simplemente como lisosomas-también sirven como la ubicación principal para las etapas finales de la digestión en el extremo de la fagocítica / endocítica vía 12. De esta manera, las sondas no digeribles se pueden cargar a través de endocitosis y macropinocitosis desde el medio extracelular y se transportan a través de la vía endocítica a los lisosomas, donde se acumula 13,14 después de seguir un ciclo definido de captación y Chase. Sondas conjugado con fluoróforo para microscopía fluorescente tal como el dextrano polímero orgánico no digerible se utilizan comúnmente como endocyticprobes 15-17. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; En este método, se describe la utilización de microperlas recubiertas con IgG como carga fagocítica para investigar la maduración fagosoma mediante el análisis de la entrega de lisosomal contenido luminal a los fagosomas. Mediante el uso de una sonda de dextrano conjugado con fluoróforo como marcador fácilmente detectable de lisosomas en los macrófagos de la médula ósea en directo derivados (BMM) y time-lapse de imágenes de vídeo con un microscopio de escaneo láser confocal, seguimos el proceso dinámico de la entrega de la carga en los fagosomas con alta resolución temporal. A continuación describimos cómo los datos time-lapse recogidos pueden ser evaluados utilizando el código abierto y el software de análisis de imágenes de libre acceso, Fiji (o ImageJ), estadísticamente analizados usando Microsoft Excel y se presenta utilizando el software GraphPad Prism 14,18. Después de la descripción de nuestro método, experimentos análogos pueden ser diseñados utilizando la configuración y factores modificados para investigar su influencia sobre la maduración fagosoma; prácticamente cualquier OTsu tipo de células fagocíticas primarios o de líneas de células adherentes, la pérdida genética de los experimentos de la función incluyendo genes knock-out y knock-down, mutantes o expresión de proteínas de fusión, fagocíticas-objetivos, compuestos de revestimiento microbead, sondas endosomal / lisosomales y factores como un citoquinas, inhibidores químicos, o ARNsi entre otros son todas las variables que se pueden aplicar para el enfoque básico de este método. Definimos el objetivo y los requisitos básicos de este método de la siguiente manera: <ul type="disc"><li> Objetivo del método: para permitir la observación directa, cuantitativa y cualitativa y el análisis de la maduración del fagosoma con alta resolución temporal en las células fagocíticas viviente. </li><li> Fagocítica de carga: Una micropartícula adecuadamente recubiertos o diana biológica. Aquí se utiliza recubiertas de IgG-3 micras micropartículas esféricas de poliestireno que se internalizan fácilmente mediante el receptor de Fc-γ fagocitosis mediada. Alternativamente, cualquier microorganismo o micrófono revestidoroparticle para que un receptor fagocítico está presente en las células se puede utilizar. </li><li> Las células fagocíticas: células fagocíticas adherentes que expresan los receptores fagocíticas apropiados. Aquí usamos primarias BMMs de ratón que expresan abundantemente los receptores Fc-γ. Alternativamente, se podrían utilizar células dendríticas (DC), monocitos o células epiteliales fagocíticas o sus mutantes o variantes genéticos knock-out. </li><li> Lysosomal de carga: Una sonda lisosómico marcado con fluorescencia. Aquí, Texas conjugado-Rojo 70000 kilodaltons de dextrano (Dex70kD) se utiliza como la carga luminal de los lisosomas. Alternativamente, cualquier marcador fluorescente detectable de un compartimiento celular o de orgánulos, o una sonda apropiada para las propiedades phagosomal tales como la acidez o de degradación de la capacidad, se podría utilizar para estudiar la progresión de la maduración del fagosoma. </li><li> Factores de influencia: por ejemplo, las moléculas de señalización, compuestos químicos, genes knock-down, o la expresión transitoria de proteínas mutantes podían. Aquí, hemos forguno el uso de ese factor en aras de la simplicidad, pero para un ejemplo reciente con la expresión de la proteína mutante y derribo factores que influyen en favor ven Kasmapour et al. 18 Cualquier factor que puede afectar la fagocitosis o por las circunstancias y la movilidad de los fagosomas y / o los compartimentos que interactúan con los fagosomas vencimiento podrían ser utilizadas. </li></ul>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="610">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagles Medium (D-MEM)</td>
			<td>PAA, Austria</td>
			<td>E15-009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagles Medium without phenol red (D-MEM)</td>
			<td>PAA, Austria</td>
			<td>E15-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>PAA, Austria</td>
			<td>A15-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>PAA, Austria</td>
			<td>M11-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>PAA, Austria</td>
			<td>H15-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>PAA, Austria</td>
			<td>P11-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WillCo-dish&#174; Glass bottom dish (35 mm &#8709;, #1.5)</td>
			<td>WillCo Wells, Netherlands</td>
			<td>GWSt-3522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLviewTM glass bottom dish, 35 mm</td>
			<td>Greiner Bio one, Germany</td>
			<td>627871</td>
			<td>Alternative: Available as segmented</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxylated latex microspheres</td>
			<td>Polysciences, USA</td>
			<td>#09850</td>
			<td>Available in different diameters, we used 3 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene microparticles</td>
			<td>Kisker Biotech, Germany</td>
			<td>PPs-3.0COOH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>ROTH, Germany</td>
			<td>305.1.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse whole IgG</td>
			<td>Rockland, USA</td>
			<td>010-0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDAC crosslinker</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>E6383-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich,USA</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-ml syringe Omnifix -F</td>
			<td>B.Braun, Germany</td>
			<td>9161406V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26&#160;G needle (0.45*25 mm)</td>
			<td>B.Baun, Germany</td>
			<td>4657683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>PAA, Austria</td>
			<td>E15-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco, USA</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>M2933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#956;M syringe mounted filter</td>
			<td>Sartorius, Germany</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

study of phagolysosome biogenesis in live macrophages

Las células fagocíticas juegan un papel importante en el sistema inmune innato mediante la eliminación y la eliminación de los microorganismos invasores en sus fagosomas. Maduración Fagosoma es el proceso complejo y estrechamente regulado durante el cual un fagosoma naciente se somete a transformación drástica a través de interacciones bien orquestados con diversos orgánulos celulares y los compartimentos en el citoplasma. Este proceso, que es esencial para la función fisiológica de las células fagocíticas dotando fagosomas con sus propiedades líticas y bactericidas, culmina en la fusión de fagosomas con los lisosomas y la biogénesis de fagolisosomas que se considera ser la última y crucial etapa de maduración de los fagosomas. En este reporte se describe un método basado en imágenes de células vivas para el análisis cualitativo y cuantitativo del proceso dinámico de lisosoma al fagosoma de distribución de contenidos, que es un sello distintivo de la biogénesis fagolisosoma. Este enfoque utiliza microperlas recubiertas con IgG como un modelo para phagocytosis y moléculas de dextrano conjugado con fluoróforo como sonda de carga lisosomal luminal, con el fin de seguir la entrega dinámica de contenidos lisosómica de los fagosomas en tiempo real en los macrófagos en vivo utilizando time-lapse y microscopía confocal de barrido láser. A continuación se describe en detalle los antecedentes, los pasos de preparación y la configuración paso a paso experimental para permitir el despliegue fácil y preciso de este método en otros laboratorios. Nuestro método descrito es simple, robusto, y lo más importante, puede ser fácilmente adaptado para estudiar las interacciones phagosomal y maduración en diferentes sistemas y bajo diferentes condiciones experimentales, como el uso de varios tipos de células fagocíticas, experimentos de pérdida de función, diferentes sondas y partículas fagocíticas.

La preparación correcta de las células y los granos para la formación de imágenes es crítico. Figura 1 muestra el esquema de la siembra, la sonda de carga y las etapas iniciales de formación de imágenes en este método, basado en nuestro protocolo optimizado para BMMs. Es esencial por lo tanto, que los parámetros del protocolo de ser probados y optimizados en función del tipo de células y sondas que se van a utilizar. Después de la adición de las perlas recubiert...

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Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Estudio de fagolisosoma Biogénesis en macrófagos en directo

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

El uso de una trampa óptica para el estudio de interacciones huésped-patógeno de imágenes dinámicas de células vivas

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Investigación

Inmunología e Infección

Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

El agotamiento y la reconstitución de los macrófagos en ratones

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establecimiento de un<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema para estudiar el comportamiento intracelular de<em&gt; Candida glabrata</em&gt; En humanos THP-1 macrófagos

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

El uso de<em&gt; Flexneri Shigella</em&gt; Para estudiar las interacciones Autophagy Citoesqueleto

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

Proteómico de perfiles de los macrófagos por electroforesis 2D

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Cuantificación de Citosólica vs. Vacuolar<em&gt; Salmonella</em&gt; En macrófagos primarios por permeabilización diferencial

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

Fagosoma Migración y velocidad medida en vivo primaria macrófagos humanos infectados con VIH-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Aislamiento de Salmonella typhimurium-que contienen fagosomas de los macrófagos

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Aislamiento y cultivo In Vitro de los macrófagos alveolares murinos y humanos

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To Fc&#947;R Cross-linking

Medición de Cytometric del flujo de producción de ROS en los macrófagos en respuesta a Cross-linking FcγR

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in ...